一种硼替佐米诱导海洋真菌合成次级代谢产物的方法

摘要

本发明公开了一种硼替佐米诱导海洋真菌合成次生代谢产物的方法；所述方法具体为在海洋真菌发酵过程中添加硼替佐米，即可；其中，所述发酵包括将所述海洋真菌接种于种子培养基中培养获得种子液的步骤和将所述种子液接种于发酵培养基中进行发酵得到次生代谢产物的步骤。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：与实验室常规培养海洋真菌的条件相比，通过向培养基中添加硼替佐米，明显提高了海绵共生斑污拟盘多毛孢真菌代谢产物的合成水平。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种真菌代谢领域添加表观修饰剂进行诱导的方法，具体是一种硼替佐米诱导海洋真菌合成次级代谢产物的方法，即使用硼替佐米诱导海洋真菌Pestalotiopsismaculans合成常规实验条件下无法合成的次级代谢产物的应用及方法。

背景技术

近年来，随着国家对海洋资源的重视和开发，有关海洋真菌活性代谢产物的研究报告层出不穷。其中，很多海洋真菌的代谢产物被证明具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌和防治心血管疾病的活性，成为相关药物研制中重要的先导化合物。

随着后基因组时代的到来，高通量基因组测序结果显示，真菌次级代谢产物的合成基因远远大于目前所分离到的次级代谢产物的数量。真菌在表达次级代谢产物过程中的表观抑制现象非常明显，大部分代谢产物的生物合成基因在普通实验室培养条件下处于沉默状态。所以，通过使用表观修饰剂激活沉默基因使其进行表达，将有利于丰富海洋真菌代谢产物的多样性，乃至提高分离得到海洋真菌新颖代谢产物的效率。硼替佐米是临床上广泛应用的一种蛋白酶体抑制剂，属于表观修饰剂的一种。2014年VanderMolenKM等人首次报道了其能够诱导植物落叶中真菌产生新化合物的作用(VanderMolenKM,etal.Epigeneticmanipulationofafilamentousfungusbytheproteasome-inhibitorbortezomibinducestheproductionofanadditionalsecondarymetabolite.RSCadvances.2014；4(35):18329-18335.)。本发明将硼替佐米应用在海洋真菌Pestalotiopsismaculans的发酵过程中，检测到了实验室常规培养条件下无法产生的代谢产物。

发明内容

本发明的目的是克服海洋真菌常规实验室培养条件下沉默基因不表达、代谢产物不丰富的缺点，提供一种硼替佐米诱导海洋真菌合成次级代谢产物的方法，特别是提供一种使用硼替佐米诱导海绵共生真菌Pestalotiopsismaculans合成次级代谢产物的应用及方法。

本发明的目的是通过以下的技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种硼替佐米在诱导海洋真菌合成次生代谢产物中的用途

优选地，所述海洋真菌为海绵共生斑污拟盘多毛孢真菌。

进一步优选地，所述所述海洋真菌为海绵共生真菌为斑污拟盘多毛孢(Pestalotiopsismaculans)16F-12。

在上述第一方面所述内容中，硼替佐米的作用是作为诱导剂。

第二方面，本发明提供一种用硼替佐米诱导海洋真菌合成次生代谢产物的方法，所述方法具体为在海洋真菌发酵过程中添加硼替佐米，即可。

优选地，所述发酵包括将所述海洋真菌接种于种子培养基中培养获得种子液的步骤和将所述种子液接种于发酵培养基中进行发酵得到次生代谢产物的步骤。

优选地，所述硼替佐米的添加时间为：种子液接种于发酵培养基24小时后添加，此时，菌体在培养基中达到对数生长期，菌体子代充分可接受硼替佐米修饰。

优选地，所述硼替佐米的添加量为：硼替佐米在所述发酵培养基中的的终浓度不低于300μM。

进一步优选地，所述硼替佐米的添加量为：硼替佐米在所述发酵培养基中的的终浓度为300～1000μM。

更优选地，所述硼替佐米的添加量为：硼替佐米在所述发酵培养基中的的终浓度为300μM。

优选地，所述硼替佐米的添加具体指加入硼替佐米母液。

进一步地，所述硼替佐米母液的制备方法具体为：称取384.24mg硼替佐米溶于少量DMSO中，用容量瓶定量至10mL，得浓度为1mM的硼替佐米母液，备用。

优选地，将所述海洋真菌接种于种子培养基中培养获得种子液的步骤中，所述接种采用接种环；所述接种的量为1接种环，约含3×10⁷个海洋真菌孢子；

所述培养的条件为：28℃，150rpm，48小时；所述培养具体是指在摇床中实现的；

所述种子培养基的制备具体为：将30g马铃薯液体培养基(PDB)溶于1L人工海水，pH调至7.4，115℃高温灭菌30min即得。

优选地，将所述种子液接种于发酵培养基中进行发酵得到次生代谢产物的步骤中，所述种子液的接种量为1％(v/v)；

所述发酵的条件为：28℃，150rpm，8天；所述发酵具体是指在摇床中实现的；

所述发酵培养基的制备具体为：向每1L人工海水中加入10g葡萄糖、20g甘露醇、20g麦芽糖、3g酵母膏、1g玉米浆，10g谷氨酸钠，0.5g色氨酸，0.5gK₂HPO₄，0.3gMgSO₄·7H₂O，pH调至7.4，115℃高温灭菌30min，即得。

优选地，所述海洋真菌为海绵共生斑污拟盘多毛孢真菌。

进一步优选地，所述所述海洋真菌为海绵共生真菌为斑污拟盘多毛孢(Pestalotiopsismaculans)16F-12。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：与实验室常规培养海洋真菌的条件相比，通过向培养基中添加硼替佐米，明显提高了海绵共生斑污拟盘多毛孢真菌代谢产物的合成水平。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为在海绵共生斑污拟盘多毛孢真菌发酵培养基中添加不同表观修饰剂代谢产物的指纹图谱的对比图；

图2为在海绵共生斑污拟盘多毛孢真菌发酵时添加不同浓度的硼替佐米时产生代谢产物指纹图谱的对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

以下实施例中涉及的海洋真菌分离自中国南海永兴岛Phakelliafusca海绵，菌株经分子生物学鉴定，其小亚基核糖体基因(18SrDNA)序列blast比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)与最相似菌株斑污拟盘多毛孢Pestalotiopsismaculans(序列号：AB220236)，相似度为99％，故可确定本海洋真菌为斑污拟盘多毛孢(Pestalotiopsismaculans)，将其编号为16F-12，菌株的18SrDNA基因的序列号为KM972709。

实例1、确定最优的表观修饰剂

选择三种表观修饰剂伏立诺他(SAHA)、5-氮杂胞苷(5-Azacytidine)、硼替佐米(Bortizomib)作为诱导真菌沉默基因表达的诱导剂，从中确定最优的诱导剂。

三种表观修饰剂的配制如下：

(1)伏立诺他溶液的配制：准确称取264.32mg伏立诺他溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，容量瓶定量至10mL，即得浓度额为1mM的伏立诺他母液，经0.22μm无菌滤膜过滤除菌备用。

(2)5-氮杂胞苷溶液的配制：准确称取244.21mg5-氮杂胞苷溶解于DMSO中，容量瓶定量至10mL，即得浓度额为1mM的5-氮杂胞苷母液，经0.22μm无菌滤膜过滤除菌备用。

(3)硼替佐米溶液的配制：准确称取384.24mg硼替佐米溶解于DMSO中，容量瓶定量至10mL，即得浓度额为1mM的硼替佐米母液，经0.22μm无菌滤膜过滤除菌备用。

培养基配制如下：

(1)种子培养基的制备具体为：将30gPDB培养基溶于1L人工海水，pH调至7.4，115℃高温灭菌30min即得。

(2)发酵培养基的制备具体为：将10g葡萄糖，20g甘露醇，20g麦芽糖，3g酵母膏，1g玉米浆，10g谷氨酸钠，0.5g色氨酸，0.5gK₂HPO₄，0.3gMgSO₄·7H₂O，溶解于1L人工海水，pH调至7.4，115℃高温灭菌30min即得。

采用上述培养基对海绵共生斑污拟盘多毛孢真菌发酵，具体实施步骤如下：

(1)将1接种环海绵共生斑污拟盘多毛孢真菌孢子(约3×10⁷)接种于含100mL上述种子培养基的锥形瓶(250mL)中，28℃、150rpm摇床培养48小时。

(2)种子液培养结束后，按1％(v/v)接种量将其接种到含250mL发酵培养基容量为1L锥形瓶中，28℃、150rpm摇床培养。

(3)上述发酵培养进行24小时后，分别将上述三种表观修饰剂接种到同一批次的海绵共生斑污拟盘多毛孢真菌的发酵培养基中，使其终浓度为500μM；将同样条件下，加入相同体积DMSO的发酵培养基作为空白对照。之后，继续摇床培养7天。

发酵结束后代谢产物的检测方法，具体如下：

(1)发酵结束后，用乙酸乙酯浸泡发酵液过夜灭菌。

(2)减压抽滤除去菌体，将发酵液用等体积乙酸乙酯萃取三次，使用旋转蒸发仪蒸干即获得发酵液总浸膏。

(3)将总浸膏用甲醇稀释至浓度为4mg/mL，采用高效液相色谱(HPLC)法进行代谢产物指纹图谱检测。

(4)检测方法具体为：采用安捷伦高效液相(Agilent1200Series)及安捷伦C18分析型色谱柱(型号：EclipseXDB-C18，4.6×150mm，5μm)，将20μL上述样品进样，设置方法为：10-100％(乙腈–水)梯度洗脱30分钟，检测代谢产物在220nm处的出峰情况。

经过检测，如图1所示，与空白对照组相比，在发酵培养基中添加硼替佐米可明显促进代谢产物的合成；通过与空白对照组比较，其他两种表观修饰剂伏立诺他和5-氮杂胞苷的添加对该菌的代谢产物并无明显影响。

实例2、确定硼替佐米最优的添加浓度

上述实施例1确定表观修饰剂硼替佐米为海绵共生斑污拟盘多毛孢真菌的有效诱导剂，在此基础上本实施例对硼替佐米的添加浓度进行了进一步的优化。

按实施例1中发酵方法进行接种，种子液培养，将种子液按1％(v/v)接种到上述发酵培养基，24小时后，分别加入终浓度为20μM，50μM，100μM，300μM，500μM，1000μM的硼替佐米。并以相同条件下加入500μLDMSO的发酵培养基为空白对照。

按实施例1中所述的代谢产物检测方法进行检测，结果如图2所示，当加入硼替佐米的终浓度为20μM，50μM，100μM时，代谢产物的指纹图谱与空白对照相比并无明显差别；当加入硼替佐米的终浓度在300μM以上时，代谢产物峰明显变得丰富；图2亦显示，当硼替佐米浓度为500μM和1000μM时，代谢产物图谱较硼替佐米浓度为300μM并无明显增多，故综合考虑表观修饰剂的经济成本，确定硼替佐米的最佳添加浓度为300μM。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。