与大豆抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记及其应用

摘要

本发明提供一种与大豆抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记ZCindel246000及其应用，所述标记位于大豆2号染色体的SSR标记ZCSSR33和ZCSSR46之间，且与基因RpsZS18的遗传距离为0cM。本发明以抗病品种早熟18为父本，感病品种Williams为母本，通过杂交和自交产生F3群体作为作图群体，根据初定位结果，用该区间内公布的大豆SSR标记和利用大豆基因组序列开发新的SSR标记，对早熟18含有的抗病基因进行精细定位。抗病基因RpsZS18被定位在2号染色体的ZCSSR33(0.7cM)和ZCSSR46(2.8cM)之间，并与SSR标记Satt172共分离。根据新定位区间内的基因注释，预测RpsZS18候选基因，根据抗、感亲本预测的候选基因位点序列差异，开发Indel标记ZCindel24600，将该标记进行群体验证后发现其为共分离标记，该Indel标记可用于大豆抗疫病的辅助育种中。

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术工程和农作物抗病遗传育种领域，具体地说，涉及一种与大豆抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记及其应用。

背景技术

由大豆疫霉(PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)引起的大豆疫病是大豆生产中的一种毁灭性病害。该病已在我国黑龙江省、安徽、福建、吉林、新疆等省份发生。大豆疫霉在大豆所有生育期均可以侵染大豆，引起根腐、茎腐、植株矮化、枯萎和死亡，一般田块减产10-30％，严重地块可达60-90％，甚至造成绝产。目前全世界每年因大豆疫霉病造成的经济损失大约为10亿美元(Tyler,2007)。

防治大豆疫病最为经济、有效且环境安全的方法是种植抗病品种。目前，国外已经在大豆基因组上的8个基因座上鉴定了17个抗性基因。分别为Rps1(Bernardetal.,1957)、Rps2(Kilenetal.,1974)、Rps3(Muelleretal.,1978)、Rps4(Athowetal.,1980)、Rps5(Buzzell和Anderson.,1981)、Rps6(Athow和Laviolette.,1982)、Rps7(Anderson和Buzzell.,1992)、Rps8(Gordonetal.,2006；Sandhuetal.,2005)、大豆品种Waseshiroge的Rpsgene(Sugimotoetal.,2011)、RpsUN1和RpsUN2(Linetal.,2013)。在Rps1位点上共有5个等位基因(Rps1a,1b,1c,1d,1k)(Bernardetal.,1957；Buzzell和Anderson,1992；Muelleretal.,1978)，在Rps3位点上共有3个等位基因(Rps3a,3b和3c)(Muelleretal.,1978；Ploperetal.,1985)。Rps1、Rps7、Waseshiroge的Rpsgene和RpsUN1被定位在3号染色体上；Rps2和RpsUN2被定位在第16号染色体上。Rps3和Rps8被定位在第13号染色体上；Rps4、Rps5和Rps6被定位在第18号染色体上。

迄今，我国已经鉴定了9个大豆抗疫病基因，即RpsYB30、RpsYD25、RpsZS18、RpsSN10、Rps9、RpsSu、RpsYD29、Rps10和RpsJS。抗病基因RpsYB30被定位在了大豆第19号染色体(朱振东，2007)。RpsYD25被定位大豆第3号染色体(范爱颖等,2009)；RpsZS18被定位在了大豆第2号染色体上(姚海燕，2010)；RpsSN10被定位于大豆第13号染色体上(于安亮,2010)；Rps9被定位在大豆第3号染色体上(Wuetal.,2011)。RpsSu被定位在了大豆第10号染色体上(武晓玲等,2011)。RpsYD29被定位在第3号染色体(Zhangetal.,2013a)。Rps10被定位在大豆第17号染色体上(Zhangetal.,2013b)。最新发现的RpsJS定位在18号染色体上(Sunetal.，2013)。

大豆疫霉群体结构复杂，容易产生新的毒力型。一般认为大豆抗疫病基因的使用寿命为10-15年，但是新的抗病基因被淘汰的速度正在加快。因此有必要大力挖掘和利用新的抗性资源并不断地进行抗病基因的累加，培育抗性持久的大豆品种。

随着分子标记开发技术不断发展，不同类型的分子标记不断被应用到基因的发掘和作图中，实现更精细的定位。SSR标记由于其数量大，多态性高，操作简单等特点，为目前应用范围最为广泛的一种分子标记。但随着测序技术的发展，SNP和Indel等多态性更强的分子标记被开发并且应用到基因的定位中。大豆全基因组测序的完成为大豆基因的精细定位、克隆以及功能标记的开发提供了便利。通过大豆基因组的序列信息，设计和利用SSR和SNP标记，已经广泛应用到大豆基因的定位、功能标记的开发。

大豆品种早熟18是中国科学院遗传研究所1982年用7902(克拉克63×诱变30)为母本，7821(耐阴黑豆×诱变31)为父本进行复合杂交选育而成；早熟18号高抗花叶病毒病、灰斑病和紫斑病。抗倒伏，抗裂荚。朱振东等(2006)发现早熟18对大豆疫霉具有广谱抗性。姚海燕等(2010)在早熟18中鉴定一个抗疫病基因RpsZS18，并将该基因定位在大豆2号染色体(LGD1b)SSR标记Sat_069和Sat_183之间。

发明内容

本发明的目的是提供一个与大豆抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一个与大豆抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记ZCindel246000，所述分子标记位于大豆2号染色体的SSR标记ZCSSR33(0.7cM)和ZCSSR46(2.8cM)之间，用于特异性PCR扩增分子标记ZCindel246000的引物对为：

上游引物F:5’-CAGATAGAGTTTTCCTACACAGG-3’和

下游引物R：5’-AGTAGAAGCAAAGAGGGACT-3’。

分子标记ZCindel266000与基因RpsZS18的遗传距离为0cM。

PCR扩增使用的退火温度为58.4℃，扩增产物大小为279bp(序列1)。

本发明还提供所述分子标记ZCindel266000在鉴定抗疫病大豆品种中的应用，包括以下步骤：

1)提取待测大豆的基因组DNA；

2)以待测大豆的基因组DNA为模板，利用上述引物F和R，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出279bp的产物，则判定待测大豆为抗疫病品种。

其中，PCR扩增反应使用的扩增体系以10μl计为：大豆基因组DNA模板浓度2ng/μl，2×PCRMasterMix(Tiangen)4μl，引物F和R各0.2μmol/L，用ddH₂O补足至10μl。

PCR扩增反应使用的反应条件为：95℃3分钟；94℃45秒，58.4℃45秒，72℃45秒，共35个循环；72℃10分钟。

本发明还提供用于PCR检测抗疫病大豆的试剂盒，所述试剂盒中含有上述用于特异性PCR扩增分子标记ZCindel246000的引物对。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的一种或多种。

本发明进一步提供所述分子标记ZCindel266000在大豆抗疫病分子育种中的应用。

具体地，本发明的与大豆抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记通过如下方法获得：

利用Williams和早熟18杂交组合衍生的F3为作图群体，根据抗疫病基因RpsZS18的初定位结果，在该定位区间内设计开发新的SSR标记以及利用定位区间内已经公布的SSR标记，筛选在亲本和抗、感池上都具有多态性的分子标记，将具有多态性的SSR标记进行群体验证构建新的连锁图谱，实现精细定位。在新的定位区间内预测候选基因，对早熟18和Williams的候选基因位点进行测序，开发Indel标记，并进行群体验证，获得与基因RpsZS18共分离的标记。从而为大豆抗疫病育种提供辅助选择，提高育种效率，加速抗疫病育种工作进程。

具体实施方案：

(1)早熟18的抗性遗传分析

以抗病品种早熟18为父本，感病品种Williams(rps)作为母本，杂交产生F₁代，F₁代自交产生F₂代，F₂代自交产生的75个F₃家系的抗性遗传分析、抗病基因鉴定及作图群体。采用下胚轴创伤接种方法，每个家系鉴定20-25个植株对大豆疫霉菌株PsUSAR2的反应进行抗性遗传分析。接种后在24℃，湿度为100％的条件下，保湿48小时，然后传入温室培养，4天后进行病情调查。参照Gordon等(2006)方法评价标准，调查F₃家系的抗病、分离、感病家系的分离比，研究早熟18对大豆疫病的抗性遗传规律。

(2)基因DNA的提取和抗、感池的构建

采用CTAB法提取2个亲本及75个F3家系的基因组DNA。每个F₃家系分别取20个单株叶片样品，等量混合提取DNA。按照Michelmore等(1991)方法取10个抗病、感病家系构建用于分离群体分组分析(BulkSegregationAnalysis，BSA)的抗病、感病池。

(3)利用SSR标记定位早熟18的抗病基因

根据姚海燕(2010)定位结果，在http：//soybase.org下载SSR标记Sat_069和Sat_183之间的基因序列。根据基因序列设计开发SSR标记以及利用该区间内已经公布的SSR标记，在早熟18和Williams之间，抗病、感病池之间进行PCR扩增和多态性筛选。将在亲本和抗病、感病池之间具有多态性的SSR标记进行群体验证。对F₃群体抗性分离及SSR标记在F₃家系中的分离模式进行X²检验。用mapmaker3.0软件分析SSR标记与抗病基因的连锁关系。使用MapDraw软件构建遗传连锁图谱，获得新的定位区间。PCR反应体系为10μl，含有2×TaqPCRMasterMix(Tiangen)4μl，上、下游引物各0.2μmol/L，模板DNA浓度为2ng/μl，用ddH₂O补足至10μl。

PCR反应扩增程序：95℃预变性3分钟；94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃10分钟，10℃保存。扩增产物在8-12％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳和分析。

(4)候选基因的预测和共分离标记的发现

在http：//soybase.org中查找新的定位区间中注释基因的信息，发现基因Glyma.02g246000为具有典型抗病基因结构的Ser/Thr蛋白激酶类型。将早熟18和Williams中基因Glyma.02g246000对应的位点进行测序。对比基因Glyma.02g246000位点在抗、感亲本中的测序结果，通过差异位点开发Indel标记ZCindel246000。将Indel标记进行群体验证，发现其为共分离标记。Glyma.02g246000很可能为控制早熟18抗性的候选基因模型。

大豆疫病是大豆生产过程中的一种毁灭性病害。本发明利用SSR和Indel分子标记方法，对大豆抗疫病基因RpsZS18进行精细定位，并发现其共分离和紧密连锁的分子标记。该抗病基因对大豆疫霉具有广谱抗性，可有效控制我国大豆疫病的发生，减轻该病害造成的产量损失。利用与该基因共分离的Indel分子标记ZCIndel246000，可有效应用到分子标记辅助育种中，克服常规育种方法所需周期长的缺点；基于PCR技术，在室内对大豆资源进行抗性分析；同时为克隆该基因奠定基础，这对进一步了解该基因的分子遗传学机理具有重要意义，在大豆生产实践、育种工作和抗病理论研究中具有重要的价值。

本发明的优点在于：

(一)本发明首次对2号染色体上发现的大豆抗疫病基因RpsZS18进行了精细定位。该基因对我国大豆疫霉具有广谱抗性，可有效控制我国大豆疫病的发生，减轻该病害造成的产量损失。

(二)本发明提供的与抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记ZCindel246000，是在早熟18及其抗性稳定的杂交后代家系中获得的分子标记。可用于抗大豆疫病资源鉴定和抗大豆疫病后代的分子标记辅助育种。

(三)本发明提供的与抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记ZCindel246000，为该基因的克隆和测序奠定基础，从而明确该序列信息的结构特征。另外，根据共分离的分子标记和大豆基因组序列信息，进行该基因的单倍型分析，有望克隆获得新的抗病基因。

附图说明

图1为本发明实施例1中早熟18(左3)和Williams(右3)接种大豆疫霉菌株PsUSAR2后4天病情调查结果。

图2为本发明实施例1中大豆抗疫病基因RpsZS18遗传连锁图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1大豆抗疫病基因RpsZS18的候选基因及其共分离的分子标记ZCindel246000的获得

1、早熟18的抗性遗传分析

以抗病品种早熟18为父本，感病品种Williams(rps)作为母本，杂交产生F₁代，F₁代自交产生F₂代，F₂代自交产生的75个F₃家系的抗性遗传分析、抗病基因鉴定及作图群体。采用下胚轴创伤接种方法，将每个家系鉴定20-25个植株对大豆疫霉菌株PsUSAR2的反应进行抗性遗传分析。接种后在24℃，湿度为100％的条件下，保湿48小时，然后传入温室培养，4天后进行病情调查(图1)。参照Gordon等(2006)方法评价标准，规定植株死亡率小于20％的家系为纯和抗病家系，死亡率大于80％的为纯和感病家系，而死亡率为21-79％的家系为抗性分离家系，调查F₃家系的抗、分离、感病家系的分离比，研究早熟18对大豆疫病的抗性遗传规律。

75个Williams与早熟18杂交组合衍生的F₃家系对菌株PsUSAR2的抗性鉴定结果表明，纯和抗病家系为18个，纯和感病家系为14个，杂合型家系为43个。经X²检验符合期望的1:2:1的分离比例。

2、大豆基因组DNA的提取和抗感池构建

采用CTAB法提取2个亲本及75个F₃家系的基因组DNA。每个F₃家系分别取20个单株叶片样品，等量混合放入2.0ml的离心管中。至于液氮中研磨成粉末，向离心管中加入800μl65℃预热的CTAB提取缓冲液，混匀后于65℃水浴中保存30-50分钟；取出离心管，冷却至室温，加入800μl酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)，提取10分钟，轻轻摇荡，使其充分混匀，12000rpm离心10分钟；取上清液到另一1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24:1)，充分混匀10分钟后，12000离心10分钟；取上清液到另一1.5ml离心管中，加入0.8倍体积预冷的异丙醇，缓慢混匀，与-20℃下放置30-60分钟，使DNA以沉淀析出；挑出DNA沉淀转移至1.5ml离心管中，用75％酒精洗涤2次，最后用无水乙醇脱水，吹干，家如适量灭菌的超纯水。DNA溶解后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性和紫外分光光度法检测DNA样品的浓度。

按照Michelmore等(1991)等方法构建用于分离群体分组分析(BulkSegregatingAnalysis,BSA)的抗、感池。各取1μl的10个抗病家系的DNA混合于一个新的离心管中，构建成抗池。感池构建方法参照抗池构建方法。

3、利用SSR标记定位早熟18的抗病基因

根据姚海燕(2009)定位结果，从http：//soybase.org下载SSR标记Sat_069和Sat_183之间的基因序列。根据基因序列设计开发176对SSR标记以及利用该区间内已经公布的23对SSR标记，在早熟18和Williams之间，抗、感池之间进行PCR扩增和多态性筛选。将在亲本和抗、感池之间具有多态性的SSR标记进行群体验证。对F₃群体抗性分离及SSR标记在F₃家系中的分离模式进行X²检验。用mapmaker3.0软件分析SSR标记与抗病基因的连锁关系。使用MapDraw软件构建遗传连锁图谱，获得新的定位区间。PCR反应体系为10μl，含有2×TaqPCRMasterMix4μl，上、下游引物各0.2μmol/L，模板DNA浓度为2ng/μl，用ddH₂O补足10μl。

PCR反应扩增程序：95℃预变性3分钟；94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃10分钟，10℃保存。扩增产物在8-12％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳和分析。

在新设计的176对SSR中通过亲本筛选和群体验证。有13对在群体中具有多态性；在基因组上查找的23对引物中有4对在群体间具有多态性(表1)。其中16个标记在群体中均呈现1:2:1的分布，1个标记ZCSSR8为显性标记，呈3:1分布。

使用mapmaker3.0软件分析表明，这17对多态性SSR引物与RpsZS18均连锁(表1)。使用MapDraw软件绘制遗传连锁图谱，RpsZS18被定位在标记ZCSSR33和ZCSSR46之间，遗传距离分别为0.7cM和2.8cM，同时与SSR标记Satt172共分离，与RpsZS18的遗传距离为0cM(图2)。

4、候选基因的预测和共分离标记的发现

在http：//soybase.org数据库内进行分析比对可知，在标记ZCSSR33和ZCSSR46之间有16个预测的基因模型(表2)，9个具有功能注释，其中有一个基因模型Glyma.02g246000编码植物抗病相关的Ser/Thr激酶结构的蛋白。通过设计重叠引物对早熟18和Williams中的Glyma.02g246000位点及其上、下游1000bp序列进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序。比对早熟18和Williams中Glyma.02g246000的位点发现存在多个SNP位点以及插入和缺失。根据其早熟18的3ˊ-UTR区域内一段13bp的缺失设计上、下游引物开发Indel标记ZCindel246000，用于特异性PCR扩增分子标记ZCindel246000的引物对为：

上游引物F:5’-CAGATAGAGTTTTCCTACACAGG-3’(SeqIDNo.1)

下游引物R：5’-AGTAGAAGCAAAGAGGGACT-3’(SeqIDNo.2)

用Indel标记ZCindel246000进行群体验证，通过mapmaker3.0软件计算遗传连锁距离，使用MapDraw构建遗传连锁图谱(图2)。ZCindel246000与RpsZS18的遗传距离为0cM，标记ZCindel246000为共分离分子标记，Glyma.02g246000很可能为控制早熟18抗性的候选基因模型。

进行群体验证包括以下步骤：

1)提取待测大豆的基因组DNA；

2)以待测大豆的基因组DNA为模板，利用上述引物F和R，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出279bp的产物(SeqIDNo.3)，则判定待测大豆为抗疫病品种。

其中，PCR扩增反应使用的扩增体系以10μl计为：大豆基因组DNA模板浓度2ng/μl，2×PCRMasterMix(Tiangen)4μl，引物F和R各0.2μmol/L，用ddH₂O补足至10μl。

PCR扩增反应使用的反应条件为：95℃3分钟；94℃45秒，58.4℃45秒，72℃45秒，共35个循环；72℃10分钟。

本发明中涉及的大豆抗疫病基因RpsZS18、候选基因Glyma.02g246000的核苷酸序列分别如SeqIDNo.4和5所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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