一种筛选CCR4拮抗剂的细胞模型及筛选方法

摘要

本发明属于药物和细胞生物学领域，涉及一种以人趋化因子受体4为靶标的高效、可靠的CCR4拮抗剂的高内涵筛选细胞模型及筛选方法。本发明建立了一种导入了人CCR4-增强型绿色荧光蛋白融合表达的细胞系，经人胸腺激活调节趋化因子、巨噬细胞衍生的趋化因子激动，诱发带有绿色荧光蛋白的CCR4发生重新分布，形成绿色荧光颗粒，建立了适于高内涵筛选的CCR4拮抗剂的细胞模型。使用该模型通过测定被筛选化合物激动或抑制CCR4的绿色荧光颗粒的形成来评价化合物的生物活性。本发明所建立的药物筛选模型是一种灵敏、高效、可靠、适用于高通量、高内涵筛选的CCR4拮抗剂的细胞模型及其筛选方法。

说明书

技术领域

本发明属于药物和细胞生物学领域，涉及一种CCR4拮抗剂的高通量筛选细胞模型及其建立方法与应用，特别涉及基于CCR4的高内涵筛选CCR4拮抗剂细胞模型及其建立方法与应用。

背景技术

药物筛选模型是药物研发必不可少的药物活性研究平台。高内涵分析技术能在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被测样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在获得生物活性信息的同时能够观察的测试样品相关的毒性信息。因此，引入高内涵筛选技术是创新药物筛选研究的趋势。

CCR4(chemokinereceptor4，CCR4)是一种由CCR4基因编码的G蛋白偶联受体,属于CC类趋化因子受体(CCR)家族成员之一。据报道，CCR4在变应原引发的Th2细胞的募集，归巢和活化过程中起着重要作用。Th2细胞可分泌多种细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13，刺激炎症细胞的活化，进而影响多种过敏性疾病的发生和发展，如过敏性气道疾病(哮喘、过敏性鼻炎)。CCR4拮抗剂能够抑制CCR4与配体的结合，阻断受体介导的细胞信号通路，因此，靶向CCR4发展抗过敏性鼻炎等过敏性疾病的治疗药物，已成为新药研发的重要方向。

目前，CCR4拮抗剂的高通量筛选方法主要有基于特定人工细胞的细胞钙流测定，包括CCR4-HEK-Gqi5细胞系(Andrews,G.,C.Jones,andK.A.Wreggett,AnIntracellularAllostericSiteforaSpecificClassofAntagonistsoftheCCChemokineGProtein-CoupledReceptorsCCR4andCCR5.MolecularPharmacology,2007.73(3):p.855-867)、CCR4-CHO-Gqi5a细胞系(YasuhiroNAKAGAMI,a,etal.,RS-1748,aNovelCCChemokineReceptor4Antagonist,InhibitsOvalbumin-InducedAirwayInflammationinGuineaPigs.Biol.Pharm.Bull.,2010.33(6):p.1067—1069)、CCR4-CHO-Ga16细胞系(DouglasF.Burdi,S.C.,KarenMattia,CelesteHarrington,ZhanShi,,etal.,SmallmoleculeantagonistsoftheCCchemokinereceptor4(CCR4).Bioorganic&MedicinalChemistryLetters2007.17:p.3141–3145)。虽然钙流检测在CCR4拮抗剂的筛选中应用非常广泛，但该模型是将人工修饰的复合式/嵌合式Gαi/q导入CCR4表达细胞，使CCR4由Gαi介导信号通路转变为Gαq介导的调控胞内钙流的信号通路。

还有基于CCR4-CHO细胞系(YasuhiroNAKAGAMI,a,etal.,RS-1748,aNovelCCChemokineReceptor4Antagonist,InhibitsOvalbumin-InducedAirwayInflammationinGuineaPigs.Biol.Pharm.Bull.,2010.33(6):p.1067—1069)的[³⁵S]GTPγS结合试验。但是，该分析方法需要特定的过滤装置和步骤来分离游离的和结合的[³⁵S]GTPγS，这就限制了该分析方法的通量，此外，值得注意的是，该分析方法涉及放射性物质，安全性较低，不是未来发展的方向。

通过cAMP分析筛选Gαs偶联受体的激动剂或拮抗剂通常是很容易的，而筛选如CCR4样的Gαi偶联受体的配基，特别是拮抗剂却比较困难。不拘于理论的限制，原因之一在于需要用forskolin(福司柯林，腺苷酸环化酶的直接激活剂)预刺激AC的活化，然后使用受体激动剂(TARC或者MDC)抑制被forskolin激活的AC，然后才能检测拮抗剂产生的与激动剂相反的作用，需要较多的优化步骤，且测试窗口比较小。

此外，还有CCR4-HEk293细胞系(Qi,H.,etal.,AnantagonistforCCR4alleviatesmurineallergicrhinitisbyintranasaladministration.IntArchAllergyImmunol,2012.159(3):p.297-305)Hut78细胞系(Sato,T.,etal.,InhibitoryeffectoftheneworallyactiveCCR4antagonistK327onCCR4+CD4+Tcellmigrationintothelungofmicewithovalbumin-inducedlungallergicinflammation.Pharmacology,2009.84(3):p.171-82)的细胞趋化实验，但该种方法操作繁复，不适合高通量。

因此，亟需开发新的能够高效筛选CCR4拮抗剂的模型。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，建立了一种能够稳定表达CCR4-EGFP融合蛋白的细胞，以及一种基于CCR4-EGFP融合蛋白的绿色荧光颗粒的形成来检测CCR4受到激活或抑制(拮抗)的方法，可用于高通量、高内涵的药物(CCR4拮抗剂)筛选，并能够通过细胞核数量、形态的分析，鉴别化合物因毒性产生的对受体的非特异性影响，确保筛选出的拮抗剂具有受体的特异性作用。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种细胞，其同时表达CCR4蛋白和报告基因蛋白。

根据本发明任一项所述的细胞，其特征在于如下的(1)－(3)项中的任意一项或者多项：

(1)所述CCR4为人源；具体地，所述CCR4蛋白的序列为SEQIDNO：1；

(2)所述报告基因蛋白为EGFP蛋白；具体地，所述EGFP蛋白的序列为SEQIDNO：3；

(3)所述细胞为人源细胞，具体地，为体外培养的人源细胞；具体地，为人骨瘤细胞；更具体地，为人骨肉瘤U2OS细胞。

在本发明的一个实施方案中，CCR4蛋白的序列如下(360aa)：

MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPCTKEGIKAFGELFLPPLYSLVFVFGLLGNSVVVLVLFKYKRLRSMTDVYLLNLAISDLLFVFSLPFWGYYAADQWVFGLGLCKMISWMYLVGFYSGIFFVMLMSIDRYLAIVHAVFSLRARTLTYGVITSLATWSVAVFASLPGFLFSTCYTERNHTYCKTKYSLNSTTWKVLSSLEINILGLVIPLGIMLFCYSMIIRTLQHCKNEKKNKAVKMIFAVVVLFLGFWTPYNIVLFLETLVELEVLQDCTFERYLDYAIQATETLAFVHCCLNPIIYFFLGEKFRKYILQLFKTCRGLFVLCQYCGLLQIYSADTPSSSYTQSTMDHDLHDAL(SEQIDNO：1)

CCR4蛋白的编码序列如下(1083bp)：

ATGAACCCCACGGATATAGCAGACACCACCCTCGATGAAAGCATATACAGCAATTACTATCTGTATGAAAGTATCCCCAAGCCTTGCACCAAAGAAGGCATCAAGGCATTTGGGGAGCTCTTCCTGCCCCCACTGTATTCCTTGGTTTTTGTATTTGGTCTGCTTGGAAATTCTGTGGTGGTTCTGGTCCTGTTCAAATACAAGCGGCTCAGGTCCATGACTGATGTGTACCTGCTCAACCTTGCCATCTCGGATCTGCTCTTCGTGTTTTCCCTCCCTTTTTGGGGCTACTATGCAGCAGACCAGTGGGTTTTTGGGCTAGGTCTGTGCAAGATGATTTCCTGGATGTACTTGGTGGGCTTTTACAGTGGCATATTCTTTGTCATGCTCATGAGCATTGATAGATACCTGGCAATTGTGCACGCGGTGTTTTCCTTGAGGGCAAGGACCTTGACTTATGGGGTCATCACCAGTTTGGCTACATGGTCAGTGGCTGTGTTCGCCTCCCTTCCTGGCTTTCTGTTCAGCACTTGTTATACTGAGCGCAACCATACCTACTGCAAAACCAAGTACTCTCTCAACTCCACGACGTGGAAGGTTCTCAGCTCCCTGGAAATCAACATTCTCGGATTGGTGATCCCCTTAGGGATCATGCTGTTTTGCTACTCCATGATCATCAGGACCTTGCAGCATTGTAAAAATGAGAAGAAGAACAAGGCGGTGAAGATGATCTTTGCCGTGGTGGTCCTCTTCCTTGGGTTCTGGACACCTTACAACATAGTGCTCTTCCTAGAGACCCTGGTGGAGCTAGAAGTCCTTCAGGACTGCACCTTTGAAAGATACTTGGACTATGCCATCCAGGCCACAGAAACTCTGGCTTTTGTTCACTGCTGCCTTAATCCCATCATCTACTTTTTTCTGGGGGAGAAATTTCGCAAGTACATCCTACAGCTCTTCAAAACCTGCAGGGGCCTTTTTGTGCTCTGCCAATACTGTGGGCTCCTCCAAATTTACTCTGCTGACACCCCCAGCTCATCTTACACGCAGTCCACCATGGATCATGATCTCCATGATGCTCTGTAG(SEQIDNO：2)

本发明中，EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)蛋白是增强型绿色荧光蛋白，属于一种报告基因蛋白。

EGFP的蛋白序列如下(239aa)：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK(SEQIDNO：3)

EGFP的编码基因序列如下(720bp)：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQIDNO：4)

在宿主细胞选择上，本发明人曾尝试了多种G蛋白偶联受体常用的表达细胞，例如HEK293、CHO和U2OS，但均未能获得稳定表达CCR4-EGFP融合蛋白的HEK293、CHO细胞克隆(实验数据和照片未保留)，最终选择U2OS作为母细胞。不拘于理论的限制，该细胞为人源细胞系，相对CHO具有更完善的下游信号通路，受体可正常激活；贴壁细胞相对HEK293更易操作，细胞较大有利于高内涵成像和分析，转染效率相对较高，适合脂质体转染；表达报告基因EGFP较强，荧光成像更灵敏。

在表达条件优化方面，由于构建的CCR4-EGFP融合蛋白为组成型表达，因此可利用流式细胞分选方法提高阳性克隆数。同时在CCR4细胞筛选模型的建立过程中，本发明人发现CCR4基因相对不稳定，在细胞传代过程中容易出现不表达甚至基因丢失的现象，对表达条件要求比较苛刻。因此本发明人通过保持抗生素筛选压力和亚克隆筛选稳定表达株的方法成功建立了本发明。

根据本发明任一项所述的细胞，其中，所述CCR4蛋白和报告基因蛋白以融合蛋白形式表达。可选地，CCR4蛋白和报告基因蛋白之间还有连接序列。所述连接序列不影响CCR4蛋白和报告基因蛋白的融合蛋白的表达。

CCR4的C端与EGFP连接并融合表达(本发明中表示为CCR4-EGFP融合蛋白，而不表示为EGFP-CCR4，目的是避免被认为CCR4是以其N端与EGFP连接)。

本发明人还通过研究发现，EGFP与CCR4的N端融合表达是不可以的。不拘于理论的限制，CCR4受体是7次跨膜蛋白，N端在膜外，连接EGFP后会影响受体与配基的结合。

在本发明的一个实施方案中，CCR4的C末端与EGFP连接时中间还有限制性内切酶位点序列，对应氨基酸序列为VDDI(SEQIDNO：5)。

在本发明的一个实施方案中，编码上述限制性内切酶位点序列的碱基序列为GTCGACGATATC(SEQIDNO：6)。其包含SalI和EcoRV限制性内切酶作用位点，使CCR4和EGFP的基因形成粘末端，并实现连接。该碱基序列也可选择与表达载体适合的其它限制性内切酶的位点序列(这也会导致CCR4的C末端与EGFP之间为其它的氨基酸序列)，如XhoI切点CTCGAG(对应氨基酸序列LE)、EcoRI切点GAATTC(对应氨基酸序列EF)以及XbaI切点TCTAGA(对应氨基酸序列SR)。

根据本发明任一项所述的细胞，其中，所述融合蛋白为CCR4-EGFP融合蛋白；具体地，所述CCR4-EGFP融合蛋白的序列为SEQIDNO：7，603aa，下划线部分为连接序列，如下:

MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPCTKEGIKAFGELFLPPLYSLVFVFGLLGNSVVVLVLFKYKRLRSMTDVYLLNLAISDLLFVFSLPFWGYYAADQWVFGLGLCKMISWMYLVGFYSGIFFVMLMSIDRYLAIVHAVFSLRARTLTYGVITSLATWSVAVFASLPGFLFSTCYTERNHTYCKTKYSLNSTTWKVLSSLEINILGLVIPLGIMLFCYSMIIRTLQHCKNEKKNKAVKMIFAVVVLFLGFWTPYNIVLFLETLVELEVLQDCTFERYLDYAIQATETLAFVHCCLNPIIYFFLGEKFRKYILQLFKTCRGLFVLCQYCGLLQIYSADTPSSSYTQSTMDHDLHDALVDDIMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK(SEQIDNO：7)

其编码序列SEQIDNO：8，1812bp，下划线部分为连接序列的编码序列，如下：

ATGAACCCCACGGATATAGCAGACACCACCCTCGATGAAAGCATATACAGCAATTACTATCTGTATGAAAGTATCCCCAAGCCTTGCACCAAAGAAGGCATCAAGGCATTTGGGGAGCTCTTCCTGCCCCCACTGTATTCCTTGGTTTTTGTATTTGGTCTGCTTGGAAATTCTGTGGTGGTTCTGGTCCTGTTCAAATACAAGCGGCTCAGGTCCATGACTGATGTGTACCTGCTCAACCTTGCCATCTCGGATCTGCTCTTCGTGTTTTCCCTCCCTTTTTGGGGCTACTATGCAGCAGACCAGTGGGTTTTTGGGCTAGGTCTGTGCAAGATGATTTCCTGGATGTACTTGGTGGGCTTTTACAGTGGCATATTCTTTGTCATGCTCATGAGCATTGATAGATACCTGGCAATTGTGCACGCGGTGTTTTCCTTGAGGGCAAGGACCTTGACTTATGGGGTCATCACCAGTTTGGCTACATGGTCAGTGGCTGTGTTCGCCTCCCTTCCTGGCTTTCTGTTCAGCACTTGTTATACTGAGCGCAACCATACCTACTGCAAAACCAAGTACTCTCTCAACTCCACGACGTGGAAGGTTCTCAGCTCCCTGGAAATCAACATTCTCGGATTGGTGATCCCCTTAGGGATCATGCTGTTTTGCTACTCCATGATCATCAGGACCTTGCAGCATTGTAAAAATGAGAAGAAGAACAAGGCGGTGAAGATGATCTTTGCCGTGGTGGTCCTCTTCCTTGGGTTCTGGACACCTTACAACATAGTGCTCTTCCTAGAGACCCTGGTGGAGCTAGAAGTCCTTCAGGACTGCACCTTTGAAAGATACTTGGACTATGCCATCCAGGCCACAGAAACTCTGGCTTTTGTTCACTGCTGCCTTAATCCCATCATCTACTTTTTTCTGGGGGAGAAATTTCGCAAGTACATCCTACAGCTCTTCAAAACCTGCAGGGGCCTTTTTGTGCTCTGCCAATACTGTGGGCTCCTCCAAATTTACTCTGCTGACACCCCCAGCTCATCTTACACGCAGTCCACCATGGATCATGATCTCCATGATGCTCTGGTCGACGATATCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQIDNO：8)

本发明建立了一种以CCR4为靶标的高效、可靠筛选CCR4拮抗剂的细胞或细胞模型。本发明通过对CCR4激活所引起的与之相融合的EGFP的改变来分析CCR4的激活水平。根据本发明的构思，将人CCR4与EGFP的融合蛋白稳定表达在人骨肉瘤细胞中，筛选、优化建立得到所述细胞系。

目前已有的CCR4激动剂或拮抗剂筛选模型尚无本发明方法的细胞模型。该模型是基于高内涵分析技术的筛选模型，而高内涵筛选平台属于新技术，普及程度有限，它要求细胞模型具有较高的重复性和稳定性，并具有较好的实验窗口，即Z'因子符合需求；而血清或培养基中可能存在CCR4的内源性配基，表达受体的细胞在培养过程中易出现自激活现象，由此导致细胞模型快速丧失受体的敏感性，因此受体表达载体的构建、表达细胞的选择、克隆挑选和/或细胞培养进行了严格优化和实验条件控制。

本发明还涉及一种细胞(CCR4-EGFP_U2OS-4-G4)，其保藏编号为CGMCCNo.9003，保藏日期2014年3月26日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明的另一方面涉及一种筛选CCR4拮抗剂的方法，包括使用本发明中任一项所述的细胞的步骤；具体地，包括下述步骤：

(1)接种和培养：将所述细胞以一定密度进接种至适宜的培养基中，培养1－48小时；

(2)加样：分别加入CCR4激动剂，以及待测样品和CCR4激动剂的混合物并继续培养一定时间；

(3)检测CCR4的分布：检测相对于加入CCR4激动剂的细胞，加入待测样品和CCR4激动剂的混合物的细胞中CCR4的分布是否受到了抑制。

根据本发明任一项所述的筛选方法，其特征在于如下的1)－10)项中的任意一项或者多项：

1)步骤(1)中，细胞接种的密度为1.0×10⁴－10.0×10⁵个/ml；优选为6.0×10⁴－10.0×10⁴个/ml；更优选为8.0×10⁴个/ml；

2)步骤(1)中，培养时间为12－36小时；优选24小时；

3)步骤(1)中，培养容器为黑色透底的培养板，优选为黑色透底的96孔培养板；

4)步骤(1)或(2)中，培养条件为37℃、5％CO₂、80％湿度；

5)步骤(1)和(2)之间还包含步骤(1－1)：

弃培养基，用缓冲液洗细胞1次或多次；具体地，所述缓冲液为HBSS缓冲液；更具体地；为含有0.1％BSA和10mMHEPES的HBSS缓冲液；

6)步骤(1)或(2)中所用培养基为500μg/mLG418的DMEM培养基；具体地，所述培养基添加有100－1000μg/mLG418，优选为添加500μg/mLG418；

7)步骤(2)中，所述CCR4激动剂为TARC和/或MDC；

8)步骤(2)中，所述CCR4激动剂的终浓度为0.03μg/ml－1μg/ml；优选为0.3μg/ml－1μg/ml、0.3μg/ml(MDC)或1μg/ml(TARC)；

9)步骤(2)中，继续培养的时间为1－60分钟；优选为5－40分钟、10－35分钟、15－25分钟或20分钟；

10)步骤(2)和(3)之间还包含步骤(2－1)：

用PBS稀释的甲醛溶液固定细胞；对细胞核进行染色。

根据本发明任一项所述的筛选方法，其为高内涵筛选。

高内涵分析或高内涵筛选(HighContentScreening，HCS)HCS是一种应用高通量荧光/明场显微成像和定量图像分析的自动化平台，整合开放式试剂与荧光标技术，在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。

不拘于理论的限制，CCR4的天然的特异性配体—胸腺和活化调节趋化因子(TARC/CCL17)以及巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC/CCL22)，对CCR4具有很高的亲和力，当CCR4与TARC或MDC结合后，会激活CCR4，CCR4内在化，并聚集分布到内涵体，并引发信号通路AC-cAMP-PKA激活，进一步产生一些生物学功能的改变。在所构建的细胞中加入趋化因子(TARC，MDC)，激活CCR4，诱导CCR4-EGFP融合蛋白的绿色荧光颗粒形成。

CCR4受体在常规细胞培养条件下存在很强的自激活，导致筛选模型窗口过低，Z'因子不能达到规定值。本发明通过优化分析液成分，最终选用HBSS平衡盐缓冲液替代常规培养液，添加HEPES提供pH缓冲能力，并添加脱脂BSA减少血清中复杂成分，获得了较高的窗口值，显著提高了Z'因子值。

在本发明的一个实施方案中，采用高内涵分析仪器(IncellAnalyzer1000，IncellAnalyzer2000,美国GE)活细胞成像系统，在激发波长Ex＝360nm，发射波长Em＝460nm，曝光200ms检测Hoechst33342染色的细胞核通道蓝色荧光；激发波长Ex＝475nm，发射波长Em＝535nm，曝光500ms检测EGFP标记的CCR4绿色荧光，每孔5个视野连续拍照，进行测定。并采用使用GE公司INCellAnalyzerWorkstation图像分析软件，MultiTargetAnalysisModule分析模块，定量分析CCR4-EGFP融合蛋白绿色荧光颗粒的形成，评价化合物的活性。具体地，用CCR4-EGFP融合蛋白的绿色荧光颗粒的形成来反映CCR4的激活水平；以被筛选样品抑制CCR4-EGFP融合蛋白的绿色荧光颗粒相对面积的改变来评价其对CCR4的抑制活性。

本发明还涉及根据上面任一项所述的筛选方法处理得到的细胞/细胞模型。

本发明的再一方面涉及一种细胞模型或者一种试剂盒，其包含本发明中任一项所述的细胞。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的细胞在筛选治疗和/或预防和/或辅助治疗哮喘或过敏性鼻炎的药物、或者在筛选CCR4拮抗剂或激动剂中的用途。

发明的有益效果

1)本发明以永生化的人源细胞为工具细胞，该细胞是贴壁细胞且易操作。细胞生长状态稳定，表达报告分子CCR4-EGFP较强，细胞有利于荧光成像和高内涵分析。

2)本发明以人的CCR4为靶点进行药物筛选，作用机制明确。

3)本发明以CCR4激活所引起的CCR4-EGFP的分布改变的原理为基础，在活细胞内对CCR4的激活进行检测，建立可动态观察CCR4激活作用的细胞模型。

4)本发明所建立的筛选方法比受体配体结合试验安全性高，操作简单快速；比趋化实验稳定性重复性好。

CCR4-EGFP_U2OS细胞是稳定转染细胞，比瞬时转染细胞稳定性高，虽然瞬时转染的细胞在实验过程中CCR4受体会高表达，但是受体同样也容易丢失，导致实验结果稳定性不高重复性差的状况，本发明构建的稳转细胞系经过多次传代以后，其CCR4表达无差异，而且每次实验重复性好，误差小，Z因子波动小。

5)本发明所建立的细胞系可用于高通量、高内涵药物筛选，并能够通过细胞核数量，形态的分析，鉴别化合物毒性产生非特异性的受体影响，确保筛选出的拮抗剂具有受体的特异性作用。

附图说明

图1：CCR4荧光标记表达载体。

图2：TARC激活CCR4所引起的绿色荧光颗粒的形成现象。2A，对照(溶剂对照，即不给予TARC)；2B，TARC，1μg/ml。

激动剂对该模型的不同剂量效应关系的曲线的平均Z′值，不同剂量的TARC对CCR4激活的平均Z′值为Z'＝0.662±0.145，不同剂量的MDC对CCR4的激活的平均Z′值为Z'＝0.799±0.072。

图3：TARC和MDC激活CCR4所引起的绿色荧光颗粒的形成的剂量效应关系。n＝4，TARC激活CCR4的EC50为(3.19±0.28)×10^-7g/mL，MDC激活CCR4的EC₅₀为(7.98±3.13)×10^-10g/mL。

TARC(1μg/ml)对CCR4激活的强度是对照组的11.5倍，其Z′值为0.72，MDC(0.3μg/ml)对CCR4激活是对照组的14.9倍，其Z′值为0.90。

图4：4A，TARC(1μg/ml)激活CCR4所引起的绿色荧光颗粒的形成强度及该方法的可靠性分析。4B，MDC(0.3μg/ml)激活CCR4所引起的绿色荧光颗粒的形成强度及该方法的可靠性分析。

图5：5A，TARC处理细胞的时间对CCR4激活所引起的绿色荧光颗粒的形成的的影响。5B，MDC处理细胞的时间对CCR4激活所引起的绿色荧光颗粒的形成的的影响。

图6：U2OS-CCR4-EGFP细胞接种密度对CCR4激活所引起的绿色荧光颗粒的形成的影响。

图7：TARC激活CCR4所引起的绿色荧光颗粒的形成的细胞模型中CCR4拮抗剂BMS-397对CCR4激活所引起的绿色荧光颗粒的形成的抑制效果图{n＝4；BMS-397的IC₅₀为(3.36±0.91)×10^-7M}。

图8：BMS-397抑制CCR4活性的高内涵成像。图8A，对照；图8B，TARC(1μg/ml)；图8C，BMS-397+TARC(1μg/ml)。

图9：与对照组细胞(溶剂对照，即不含TARC的溶液)相比，在浓度为1μg/mL的TARC，或0.3μg/mL的MDC作用下，CCR4-EGFP_U2OS细胞中的CCR4-EGFP会形成绿色荧光颗粒。图9A，溶剂对照；9B，1μg/mLTARC；9C，0.3μg/mLMDC。

图10：不同的细胞分析液对CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积的影响。图10A，DMEM(Hg)+0.1％BSA；10B，HBSS+10mMHEPES+0.1％脱脂BSA-Control；10C，HBSS+10mMHEPES+0.1％脱脂BSA-TARC1μg/ml；10D，HBSS+10mMHEPES+0.1％脱脂BSA-MDC300ng/ml。

图11：使用DMEM+0.1％BSA细胞分析液，不加激动剂TARC和MDC的情况下，CCR4本身就会受细胞分析液的影响。

图12：TARC组与对照组的形态学比较。

图13：不同剂量的给药组(BMS-397)与TARC组的形态学比较。其中：

细胞计数(CellCount)；

细胞核面积(NucArea)，形态学参数；

细胞核短轴/长轴比值(NucElongation)，形态学参数；

细胞核周长2/(4π*面积)，Nuc1/(FormFactor)，形态学参数，值升高表示细胞核边缘皱缩或核碎裂；

细胞核亮度(NucIntensity)；

细胞核亮度的变异系数(NucIntensityCV)，形态学参数，值升高表示核碎裂，值降低表示核固缩。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及以下生物材料：

人骨肉瘤细胞株(CCR4-EGFP_U2OS-4-G4)，其于2014年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.9003，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

主要药品与试剂：质粒小量提取试剂盒购自OmegaBio-tek公司；限制性内切酶，T4连接酶购自TaKaRa公司；脂质体2000，hoechst33342染料购自Invitrogen公司；DMEM(Gibco),胎牛血清购自Hyclone公司；新霉素(G418)购自Merckmillpore公司；TARC因子购自Peprotech公司；HBSS，HEPES购自Gibco，BSA购自北京欣经科生物技术有限公司；所用到的CCR4拮抗剂均由本课题组合成，NMR确证其结构，HPLC测定其纯度大于98％；其他试剂均为国产分析纯试剂。

主要仪器：InCellAnalyzer1000或者InCellAnalyzer2000(美国GE公司产品)

实施例1：稳定表达人CCR4细胞系的建立(人骨肉瘤细胞株CCR4-EGFP_U2OS-4-G4)

1.构建含有人CCR4全长cDNA的pCORONneo-CCR4-EGFPn真核表达载体。

该载体的构建可以参考如下步骤：

以所获得人CCR4全长cDNA序列为模板，以如下的引物1-2进行PCR扩增。

CCR4全长cDNA序列(SEQIDNO：9，对应于GenBank登录号：NM_005508.4)如下：

AGCTGCTTCTGGTTGGGCCCAGACCTGCCTTGAGGAGCCTGTAGAGTTAAAAAATGAACCCCACGGATATAGCAGACACCACCCTCGATGAAAGCATATACAGCAATTACTATCTGTATGAAAGTATCCCCAAGCCTTGCACCAAAGAAGGCATCAAGGCATTTGGGGAGCTCTTCCTGCCCCCACTGTATTCCTTGGTTTTTGTATTTGGTCTGCTTGGAAATTCTGTGGTGGTTCTGGTCCTGTTCAAATACAAGCGGCTCAGGTCCATGACTGATGTGTACCTGCTCAACCTTGCCATCTCGGATCTGCTCTTCGTGTTTTCCCTCCCTTTTTGGGGCTACTATGCAGCAGACCAGTGGGTTTTTGGGCTAGGTCTGTGCAAGATGATTTCCTGGATGTACTTGGTGGGCTTTTACAGTGGCATATTCTTTGTCATGCTCATGAGCATTGATAGATACCTGGCAATTGTGCACGCGGTGTTTTCCTTGAGGGCAAGGACCTTGACTTATGGGGTCATCACCAGTTTGGCTACATGGTCAGTGGCTGTGTTCGCCTCCCTTCCTGGCTTTCTGTTCAGCACTTGTTATACTGAGCGCAACCATACCTACTGCAAAACCAAGTACTCTCTCAACTCCACGACGTGGAAGGTTCTCAGCTCCCTGGAAATCAACATTCTCGGATTGGTGATCCCCTTAGGGATCATGCTGTTTTGCTACTCCATGATCATCAGGACCTTGCAGCATTGTAAAAATGAGAAGAAGAACAAGGCGGTGAAGATGATCTTTGCCGTGGTGGTCCTCTTCCTTGGGTTCTGGACACCTTACAACATAGTGCTCTTCCTAGAGACCCTGGTGGAGCTAGAAGTCCTTCAGGACTGCACCTTTGAAAGATACTTGGACTATGCCATCCAGGCCACAGAAACTCTGGCTTTTGTTCACTGCTGCCTTAATCCCATCATCTACTTTTTTCTGGGGGAGAAATTTCGCAAGTACATCCTACAGCTCTTCAAAACCTGCAGGGGCCTTTTTGTGCTCTGCCAATACTGTGGGCTCCTCCAAATTTACTCTGCTGACACCCCCAGCTCATCTTACACGCAGTCCACCATGGATCATGATCTCCATGATGCTCTGTAGAAAAATGAAATGGTGAAATGCAGAGTCAATGAACTTTCCACATTCAGAGCTTACTTAAAATTGTATTTTAGTAAGAGATTCCTGAGCCAGTGTCAGGAGGAAGGCTTACACCCACAGTGGAAAGACAGCTTCTCATCCTGCAGGCAGCTTTTTCTCTCCCACTAGACAAGTCCAGCCTGGCAAGGGTTCACCTGGGCTGAGGCATCCTTCCTCACACCAGGCTTGCCTGCAGGCATGAGTCAGTCTGATGAGAACTCTGAGCAGTGCTTGAATGAAGTTGTAGGTAATATTGCAAGGCAAAGACTATTCCCTTCTAACCTGAACTGATGGGTTTCTCCAGAGGGAATTGCAGAGTACTGGCTGATGGAGTAAATCGCTACCTTTTGCTGTGGCAAATGGGCCCTCT(SEQIDNO：9)

引物1(正向引物，SEQIDNO：10)：

ATTGCACGCGTTCTAGAATGAACCCCACGGATATAGCAG和

引物2(反向引物，SEQIDNO：11)：

ATTGCGTCGACCAGAGCATCATGGAGATCATG；

经PCR扩增获得含MluI、XbaI及SalI限制性酶切位点及保护碱基，不含终止密码子的人CCR4全长cDNA片段，经酶切插入真核表达载体pCORONneo-EGFPn的MluI和SalI位点之间，获得可组成型表达CCR4-EGFP融合蛋白的真核表达载体pCORONneo-CCR4-EGFPn)，如附图1所示。

其中，上面使用的真核表达载体pCORONneo-EGFPn是在常规真核表达载体pcDNA3.1的基础上，优化了强启动子CMVPromoter，在其前后分别增加了CMVI.EEnhancer和Intron插入序列，用以提高CCR4的表达；并且，将EGFP的序列预先置于载体多克隆位点(MCS)后，使CCR4的C端与EGFP融合表达(表示为CCR4-EGFP融合蛋白，不能表示为EGFP-CCR4融合蛋白)并避免对受体结构的影响，干扰CCR4与配体结合。

2.细胞转染

利用脂质体法转染人骨肉瘤U2OS细胞系(采用LifeTechnologies公司的Lipofectamine2000TransfectionReagent试剂，以该试剂标准转染方法转染U2OS细胞)。

U2OS细胞培养于含10％FBS的无抗生素DMEM(Hg)培养液中至达到对数生长期，细胞消化种6孔板，至细胞丰度80-90％时准备转染。转染前1h换无抗无血清DMEM(Hg)培养液500μl/孔，配置转染混合物：pCORONneo-CCR4-EGFPn质粒2μg/孔用无抗无血清DMEM(Hg)配至250μl/孔；Lipofectamine2000脂质体10μl/孔用无抗无血清DMEM(Hg)补齐至250μl/孔混匀，静置5min，将上述稀释好的质粒和脂质体混匀，室温静置20min。混合物500μl/孔加入6孔板内混匀。转染后3h，换含10％FBS的无抗生素DMEM(Hg)新鲜培养液培养24h。

3.单克隆细胞的筛选

通过G-418抗性筛选和有限稀释法，获得稳定表达人CCR4-EGFP的新型细胞系。具体步骤如下：

以含1000μg/mlG418选择压力的10％FBSDMEM(Hg)培养液培养7d筛选阳性细胞。消化细胞，经流式分选获得表达CCR4-EGFP融合蛋白的阳性细胞克隆，细胞计数，以含500μg/mlG418的10％FBSDMEM(Hg)培养液稀释细胞至2-4cell/100μl/孔，种96孔板5板。每天观察细胞1次，每2-3天换选择压力培养液1次，2周左右形成单克隆，25-30天后选取细胞形态和增殖正常、仅单个单克隆孔用胰酶消化细胞，扩大培养于24孔或6孔板上，单个克隆继续培养，传瓶，冻存，部分细胞进行克隆鉴定。

基于CCR4-EGFP的HCS分析细胞株的优选过程：

CCR4-EGFP真核表达载体pCORONneo-CCR4-EGFPn瞬时转染U2OS细胞，细胞绿色荧光应分布于除核区外的胞浆和质膜，给予激动剂鉴定CCR4-EGFP颗粒形成重分布活性，饱和浓度激动剂处理下响应细胞绿色荧光应100％重分布形成颗粒。CCR4-EGFP真核表达载体pCORONneo-CCR4-EGFPn再转染U2OS细胞，选择压力筛选并给予饱和浓度激动剂鉴定绿色荧光重分布形成颗粒活性，选择压力筛选后细胞响应百分率>30％且活性高于瞬转组。种70-100个表达CCR4-EGFP的阳性克隆，筛选5-10个优选克隆用于后续检测，优选克隆应增殖正常，保持正常上皮细胞形态，无拉长、变圆、膨大或空泡现象。激动剂浓度效应曲线优化优选克隆，计算各克隆最低最高激动强度、EC50和Z’因子，选择EC₅₀与文献报道接近、Z’因子较高、细胞增殖和形态正常的克隆。使用拮抗剂做IC₅₀量效曲线并选择与文献报道接近的克隆。优选克隆进行稳定表达细胞株的质控及优化，筛选连续传代稳定、无支原体及细菌真菌污染、冻存-复苏率正常、增值率正常的1-2个克隆，建立CCR4-EGFP_U2OSHCS分析细胞株。由于CCR4基因相对不稳定，在细胞传代过程中容易出现不表达甚至基因丢失的现象，对表达条件要求比较苛刻，因此本发明人在优选克隆的基础上又进行了亚克隆的筛选，获得了稳定表达CCR4-EGFP的U2OS细胞株即CCR4-EGFP_U2OS-4-G4(本发明中有时也简称为CCR4-EGFP_U2OS)。

利用含有4500mg/L葡萄糖、10％胎牛血清、4mML-谷氨酰胺、500μg/mLG418的DMEM培养基，置于37℃，5％CO₂，80％湿度培养箱中培养。

较转染前相比，建立获得的细胞形态未发生明显变化，生长状态稳定。

得到的人骨肉瘤细胞株(CCR4-EGFP_U2OS-4-G4)，于2014年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.9003，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101。下面的实施例中，如果没有特别说明，使用的细胞/细胞株均为CGMCCNo.9003。

实施例2：新建立细胞系的鉴定

使用实施例1建立的人骨肉瘤细胞株CCR4-EGFP_U2OS-4-G4。

利用趋化因子TARC、MDC激活CCR4，促使CCR4-EGFP绿色荧光的重分布，诱导绿色荧光颗粒的形成。

所建立细胞系中的CCR4与其特异性配体TARC、MDC结合后，其激活后，CCR4-EGFP则内在化聚集分布到内涵体，形成在荧光显微镜下可动态示踪的绿色荧光颗粒。

为了定量检测TARC、MDC诱导CCR4-EGFP的绿色荧光颗粒形成面积，本发明采用InCellAnalyzer1000或InCellAnalyzer2000获取CCR4-EGFP的细胞图像，用(INCellAnalyzer1000GranularityAnalysisModule)分析颗粒形成，以颗粒形成率表示CCR4-EGFP的激活程度。颗粒形成率等于所有细胞被识别的的颗粒亮度与背景亮度之差乘以颗粒总面积。

具体步骤如下：

1、将细胞接种于黑色透底的96孔培养板，于37℃，5％CO₂，80％湿度培养箱中培养24小时。

2、用含有4500mg/L葡萄糖、4mML-谷氨酰胺、0.1％BSA和10mMHEPES的HBSS的缓冲液(以下称细胞分析液)洗涤细胞2次，每次加细胞分析液100μL/孔。此后，加入50μL每孔的细胞分析液。

3、加入含有TARC的细胞分析液，50μL/孔，使TARC的终浓度为1μg/mL(或使用终浓度为0.3μg/mL的MDC)，于37℃细胞培养箱中孵育20分钟。

4、用37℃预热1×PBS溶液稀释的4％甲醛溶液固定细胞，100μL/孔,室温避光放置20分钟。

5、弃液，加入含有hoechst33342的1×PBS溶液,200μL/孔，室温避光放置30分钟。

6、采用InCellAnalyzer2000获取细胞图像，利用GE公司INCellAnalyzerWorkstation图像分析软件，MultiTargetAnalysisModule分析模块，定量分析CCR4-EGFP融合蛋白绿色荧光颗粒的形成。

结果如图9(图9A、9B、9C)所示。结果表明，与对照组细胞相比，在浓度为1μg/mL的TARC，或0.3μg/mL的MDC作用下，U2OS-CCR4-EGFP细胞中的CCR4-EGFP会形成绿色荧光颗粒。

实施例3：TARC诱导CCR4-EGFP颗粒形成面积的半数有效浓度测定

使用实施例1建立的人骨肉瘤细胞株CCR4-EGFP_U2OS-4-G4。

1、将细胞制成8×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于黑色透底的96孔培养板，100μL/孔。

2、于37℃，5％CO₂，80％湿度培养箱中培养24小时。

3、用细胞分析液洗细胞2次，每次100μL/孔；弃液，再加入50μL/孔的细胞分析液。

4、加入细胞分析液稀释的TARC，MDC，使其终浓度分别为0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、0.6、1μg/mL。

5、37℃，5％CO₂，80％湿度培养箱中孵育20分钟后，加入37℃预热细胞固定液，100μL/孔，轻微振动培养板混匀，室温避光放置20分钟。

6、弃液，加入含有hoechst33342的1×PBS溶液,200μL/孔，室温避光放置30分钟。

7、采用InCellAnalyzer2000获取细胞图像，利用InCellAnalyzer2000获取细胞图像(如图2A-2B)，利用GE公司INCellAnalyzerWorkstation图像分析软件，MultiTargetAnalysisModule分析模块对获得的图像进行快速定量的分析。

如图3所示，当TARC的浓度为1μg/mL时，CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积达到最大。当MDC的浓度为0.3μg/mL时，CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积达到最大。通过Graphpadprism5软件sigmoidaldose-response拟合“S”型曲线，得到TARC和MDC激活U2OS-CCR4-EGFP细胞中的CCR4而诱导融合蛋白CCR4-EGFP绿色荧光颗粒面积形成的半数有效浓度(EC₅₀)，其值分别为3.19e-07±2.78e-08g/mL，7.98e-10±3.13e-10g/mL。

实施例4：U2OS-CCR4-EGFP细胞模型可靠性评价

本发明采用Z′因子来评价实施例1新建细胞模型的可靠性。Z′因子作为评价实验体系可靠性的重要参数，在评价高通量筛选、高内涵分析实验体系的稳定性和可靠性中得到广泛应用。Z′因子的计算公式如下：

$>Z^{\prime }=1-\frac{({3\sigma }_{C+}+3{\sigma }_{C-})}{|{\mu }_{C+}-{\mu }_{C-}|}$>

其中，σ为标准差(standarddeviation)；μ为平均值(meansignal)；C+为阳性对照(positivecontrol)；C-为阴性对照(negativecontrol)。

Z′因子的值在0－1之间。当Z′因子的值为0时，说明该实验体系不成立。当0.5＞Z′＞0时，说明实验体系稳定性差，不可靠。当1＞Z′≥0.5，说明实验体系稳定性好，可靠性很好。若Z′因子的值为1，这时阳性对照和阴性对照的标准差为0，表示一种理想的实验体系(Ji-HuZhang,ThomasD.Y.ChungandKevinR.Oldenburg.ASimpleStatisticalParameterforUseinEvaluationandValidationofHighThroughputScreeningAssays[J].JBiomolScreen.1999.4:67)。

评价本发明所建立实验体系可靠性的步骤如下：

1、将细胞制成8×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于黑色透底的96孔培养板，100μL/孔，于37℃，5％CO₂，80％湿度培养箱中培养24小时。

2、用细胞分析液洗细胞2次，每次100μL/孔；弃液，再加入50μL/孔的细胞分析液。

3、加入细胞分析液稀释的TARC、MDC，分别使其终浓度为1μg/mL和0.3μg/mL，设加入不含TARC和MDC的细胞分析液为对照，于37℃细胞培养箱中孵育20分钟。

4、加入37℃预热细胞固定液，100μL/孔，轻微振动培养板混匀，室温避光放置20分钟。

5、弃液，加入含有hoechst33342的1×PBS溶液,200μL/孔，室温避光放置30分钟。

6、采用InCellAnalyzer2000获取细胞图像，利用GE公司INCellAnalyzerWorkstation图像分析软件，MultiTargetAnalysisModule分析模块对获得的图像进行快速定量的分析，计算Z′因子的值。

本发明所建立的筛选体系，用1μg/mL的TARC作用时，Z′值平均为0.72(图4A-4B)，0.3μg/mL的MDC作用时，Z′值平均为0.90(图4A-4B)表明本发明的筛选体系是非常可靠，很可行的。

实施例5：TARC处理细胞的时间对CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积的影响

使用实施例1建立的人骨肉瘤细胞株CCR4-EGFP_U2OS-4-G4。

1、将细胞制成8×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于黑色透底的96孔培养板，100μL/孔，于37℃，5％CO₂，80％湿度培养箱中培养24小时。

2、用细胞分析液洗细胞2次，每次100μL/孔；弃液，再加入50μL/孔的细胞分析液。

3、每隔5分钟加入细胞分析液稀释的TARC和MDC，使其终浓度分别为1μg/mL和0.3μg/mL，设加入不含TARC的细胞分析液为对照；置于37℃细胞培养箱中孵育，使细胞因子处理细胞的时间分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟。

4、加入37℃预热细胞固定液，100μL/孔，轻微振动培养板混匀，室温避光放置20分钟。

5、弃液，加入含有hoechst33342的1×PBS溶液,200μL/孔，室温避光放置30分钟。

6、采用InCellAnalyzer2000获取细胞图像，利用GE公司INCellAnalyzerWorkstation图像分析软件，MultiTargetAnalysisModule分析模块对获得的图像进行快速定量的分析。

加入TARC因子后，CCR4-EGFP绿色荧光颗粒迅速形成。因子处理细胞5分钟到20分钟期间，CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积不断增大。在20分钟时，CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积最大。20分钟后，随着因子处理细胞时间的延长，CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积基本保持平稳(图5A-5B)。

实施例6：细胞的接种密度对CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积的影响

使用实施例1建立的人骨肉瘤细胞株U2OS-CCR4-EGFP。

1、将细胞分别以0.5、1、2、4、6、8、10、12、15、20×10³个/孔接种于黑色透底的96孔培养板37℃，5％CO₂，80％湿度培养箱中培养24小时。

2、用细胞分析液洗细胞2次，每次100μL/孔；弃液，再加入50μL/孔的细胞分析液。

3、加入细胞分析液稀释的TARC，使其终浓度为1μg/mL，设加入不含TARC的细胞分析液为对照，于37℃细胞培养箱中孵育20分钟。

4、加入37℃预热细胞固定液，100μL/孔，轻微振动培养板混匀，室温避光放置20分钟。

5、弃液，加入含有hoechst33342的1×PBS溶液,200μL/孔，室温避光放置30分钟。

6、采用InCellAnalyzer2000获取细胞图像，利用GE公司INCellAnalyzerWorkstation图像分析软件，MultiTargetAnalysisModule分析模块对获得的图像进行快速定量的分析。

如图6和表1所示，细胞接种密度从0.5×10³－8×10³个/孔，1μg/mL的TARC因子处理细胞20分钟，诱导CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积，逐渐减加，但不明显；细胞接种密度从8×10³－20×10³个/孔，1μg/mL的TARC因子处理细胞20分钟，诱导CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积，逐渐减小。

表1：细胞接种密度(单位：10³个/孔)相对应Z′因子

细胞密度0.51246810121520Z′因子—0.40.530.690.750.780.800.770.770.71

实施例7：不同的细胞分析液对CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积的影响

使用实施例1建立的人骨肉瘤细胞株CCR4-EGFP_U2OS-4-G4。

1、将细胞分别以8×10³个/孔接种于黑色透底的96孔培养板37℃，5％CO₂，80％湿度培养箱中培养24小时。

2、用不同的细胞分析液(DMEM+0.1％BSA；HBSS+10mMHEPES+0.1％脱脂BSA)洗细胞2次，每次100μL/孔；弃液，再加入50μL/孔的不同的细胞分析液。

3、加入HBSS+10mMHEPES+0.1％脱脂BSA细胞分析液稀释的TARC和MDC，使其终浓度分别为1μg/mL、0.3μg/mL，设加入不含TARC和MDC的HBSS+10mMHEPES+0.1％脱脂BSA细胞分析液以及不含TARC和MDC的DMEM+0.1％BSA细胞分析液为对照，于37℃细胞培养箱中孵育20分钟。

4、加入37℃预热细胞固定液，100μL/孔，轻微振动培养板混匀，室温避光放置20分钟。

5、弃液，加入含有hoechst33342的1×PBS溶液,200μL/孔，室温避光放置30分钟。

6、采用InCellAnalyzer2000获取细胞图像，利用GE公司INCellAnalyzerWorkstation图像分析软件，MultiTargetAnalysisModule分析模块对获得的图像进行快速定量的分析。

结果如图10(图10A、10B、10C、10D)、图11所示。

由图10可见，不同的细胞分析液对CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成面积的影响差异很大，为了减少细胞分析液自身对该体系的影响，本发明人选取了HBSS+10mMHEPES+0.1％脱脂BSA作为本发明人后续试验的分析液。

由图11可见，使用DMEM+0.1％BSA细胞分析液，不加激动剂TARC和MDC的情况下，CCR4本身就会受细胞分析液的影响，出现受体激活现象，即出现CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成；当使用HBSS+10mMHEPES+0.1％的细胞分析液后，在没加激动剂之前，没有出现CCR4的重新分布，在加入1μg/mL的TARC和0.3μg/mL的MDC处理细胞20分钟，会出现CCR4-EGFP绿色荧光颗粒的形成的现象。

实施例8：U2OS-CCR4-EGFP细胞模型形态学参数分析

使用实施例1建立的人骨肉瘤细胞株CCR4-EGFP_U2OS-4-G4。

本发明采用高内涵分析实验体系的形态学参数，为了检测药物对细胞是否有毒性。

评价本发明所建立实验体系形态学参数的步骤如下：

1、将细胞制成8×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于黑色透底的96孔培养板，100μL/孔，于37℃，5％CO₂，80％湿度培养箱中培养24小时。

2、用细胞分析液洗细胞2次，每次100μL/孔；弃液，再加入50μL/孔的细胞分析液。

3、加入细胞分析液稀释的TARC，使其终浓度为1μg/mL，设加入不含TARC的细胞分析液为对照，加入TARC与化合物混合液(TARC终浓度为1μg/mL，化合物BMS-397的终浓度分别为1μM，3μM，10μM，30μM)，于37℃细胞培养箱中孵育20分钟。

4、加入37℃预热细胞固定液，100μL/孔，轻微振动培养板混匀，室温避光放置20分钟。

5、弃液，加入含有hoechst33342的1×PBS溶液,200μL/孔，室温避光放置30分钟。

6、采用InCellAnalyzer2000获取细胞图像，利用GE公司INCellAnalyzerWorkstation图像分析软件，MultiTargetAnalysisModule分析模块对获得的图像进行快速定量的分析。

结果如图12、图13所示。

由图12可见，不同剂量的给药组(BMS-397)与TARC组相比，其形态学参数几乎无差异，表明BMS-397浓度在低于30μM的情况下，对该细胞模型无毒性。

由图13可见，TARC组与对照组相比，其形态学参数几乎无差异，表明TARC在饱和剂量(1μg/ml)对该细胞模型无毒性。

实施例9：BMS-397对细胞模型中CCR4-EGFP绿色荧光颗粒的抑制

BMS-397是一种抑制的选择性的CCR4拮抗剂(分子式C₂₄H₂₇Cl₂N₇O，结构式如下)，可有效抑制CCR4与配体的结合。本发明人利用本发明所建立的CCR4拮抗剂筛选模型对BMS-397的抑制活性进行评价。

方法如下：

1.将CCR4-EGFP_U2OS-4-G4细胞以8.0×10³个/孔接种于黑色透底的96孔培养板中，100μL/孔，37℃、5％CO₂、80％湿度的培养箱中培养24小时；

2.弃培养基，细胞分析液轻洗细胞两次，100μL/孔；

3.加入细胞分析液，50μL/孔；加入用细胞分析液稀释的溶于DMSO的BMS-397，以及含有TARC的细胞分析液共50μL/孔，使TARC的终浓度为1μg/mL，于37℃、5％CO₂、80％湿度的培养箱中孵育20分钟；

4.加入1×PBS溶液稀释的预热甲醛溶液(4％)，100μL/孔，室温避光放置20分钟；

5.弃液，加入含有hoechst33342的1×PBS溶液，200μL/孔，室温避光放置30分钟；

6.采用InCellAnalyzer2000获取细胞图像，每孔5个视野连续拍照，利用GE公司INCellAnalyzerWorkstation图像分析软件，MultiTargetAnalysisModule分析模块对获得的图像进行快速定量的分析，通过Graphpadprism5软件sigmoidalFit拟合“S”型曲线，计算IC₅₀值。

抑制率(％)＝(激动剂处理组每细胞颗粒数-化合物处理组每细胞颗粒数)/(激动剂处理组每细胞颗粒数-溶剂对照处理组每细胞颗粒数)×100％

结果如图7、图8(图8A、8B、8C)所示，在TARC激活人CCR4，诱导CCR4-EGFP绿色荧光颗粒形成的CCR4拮抗剂筛选细胞模型中，BMS-397可显著地{n＝4；IC₅₀＝(3.36±0.91)×10^-7M}抑制CCR4-EGFP绿色荧光颗粒面积。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。