展现剂量响应的性别分选的精子以及生产展现剂量响应的性别分选的精子的方法

摘要

本发明涉及展现剂量响应的性别分选的精子以及生产展现剂量响应的性别分选的精子的方法。所请求保护的发明的实施方式涉及具有改善的剂量响应的性别分选的精子，其可以通过用缓冲保持介质稀释精子样品，以及将经稀释的精子样品的浓度调节到目标浓度范围的步骤来生产。稀释的精子然后可以用DNA选择性染料染色，用流式细胞仪性别分选到捕获液中。在稀释和分选精子样品期间，pH值可以维持在目标pH值。另外，缓冲保持介质、DNA选择性染料和捕获液的至少一种可以补充有至少一种抗氧化剂。

说明书

技术领域

一般地，本发明技术涉及染色和分选方法，例如，为分选精子采用的那些方法，更具体地涉及精子分选方法和流式细胞仪方法，它们改善与性别分选精子相关的效率和回收率，以及性别分选的精子中的改善的剂量响应。

背景技术

最广泛使用的精子分选方法依靠检测带有X-染色体的精子和带有Y-染色体的精子的DNA含量方面的可定量差异。在美国专利5,135,759、6,263,745、7,371,517和7,758,811中描述了为此目的对流式细胞仪的各种修改。在许多物种中，DNA含量的差异可能是很小的。例如在牛中，荷斯坦公牛(Holsteinbulls)在DNA含量上有约3.8％的差异，而娟姗公牛(Jerseybulls)有约4.1％的差异。化学计量的DNA染色的不精确性质使得这种微小的差异难以确定，并且需要强有力的染色方案。

虽然荧光染料Hoechst33342适合于在无毒浓度下辨别这样的差异，精子必需在升高的温度和提高的pH值下温育以使Hoechst33342渗透从而提供均匀的染色。精子是相对脆弱的细胞，它们缺乏复制的能力，一般呈现短的生命期。因而，升高精子温度和改变精子pH值的每一种所引起的损伤可能导致对精子健康的重要损害。另外，在流式细胞仪内施加于精子的压力和剪切力可能进一步损害精子膜。分选过程进一步包括在询问阶段(interrogationstage)将精子细胞暴露于UV激光，以及暴露于电荷以使含有要收集的精子细胞的液滴偏转。最后，一旦分选的精子被排出流式细胞仪，它们以约80-90km/h的速度撞击收集介质。在流式分选过程中这些步骤的每一个中遭受的损伤负面地影响精子健康状态，并可能加速精子膜的劣化，进一步降低了用于人工授精或其他辅助生殖过程的活精子的本已有限的货架寿命。

在辅助生殖技术中利用性别分选的精子的主要缺点是与性别分选的精子相关的降低的受精力。研究表明，通过流式细胞术性别分选的精子的受精力是常规的未分选精子的约75-80％。进一步的，在AI中使用的性别分选的精子的数量增加不能完全补偿低授精力。DeJarmette等，″Effectsofsex-sortingandspermdosageonconceptionratesofHolestienHeifers：Iscomparablefertilityofsex-sortedandconventionalsemenplausible？″JournalofDairyScience，第94卷，第3477-3483页(2011)。

发明内容

以下概述了请求保护的发明的某些实施方式。这些实施方式的目的不是限制请求保护的发明的范围，而是用于简要描述本发明的可能形式。本发明可以涵盖与这些概述不同的各种形式。

某些实施方式涉及性别分选的授精配剂(dosage)，例如能够在人工授精中受精的、与1500万精子的常规剂量至少处在相同的授精力水平的至少400万经染色和性别分选的精子的群体。在这个实施方式的某些方面，授精配剂可以包括来自处理精子样品的缓冲保持介质的残余量的抗氧化剂，来自处理精子样品的染色剂的残余量的抗氧化剂，和/或来自处理精子的捕获液的残余量的抗氧化剂。

某些实施方式涉及生产具有改善的剂量响应的性别分选的精子的方法，其包括用缓冲保持介质稀释精子样品，以及将经稀释的精子样品的浓度调节到目标浓度范围的步骤。经稀释的精子然后可以用DNA选择性染料染色，用流式细胞仪性别分选到捕获液中。在稀释和分选精子样品期间，pH值可以维持在目标pH值。另外，缓冲保持介质、DNA选择性染料和捕获液的至少一种可以补充有至少一种抗氧化剂。

附图说明

图1呈现了根据本文描述的某些实施方式用于分选精子的流式细胞仪的示意图。

图2呈现了当根据本文描述的各种实施方式分选精子时在流式细胞仪中获得的分选参数的图形表示。

图3说明呈现了当根据本文描述的各种实施方式分选精子时在流式细胞仪中获得的分选参数的图形表示。

图4呈现了当根据本文描述的各种实施方式分选精子时在流式细胞仪中获得的分选参数的图形表示。

本发明可以包括各种修改和备选形式，通过说明性实例的方式在附图中呈现和在本文中描述具体的实施方式。应该理解的是，附图和详细说明的目的不是将本发明的范围限制到所公开的特定形式，而是在于涵盖落入权利要求的精神和范围的所有修改体、替换体和等价体。

具体实施方式

术语“精子样品”可以理解为泛指处于包括天然液体(例如精浆)的任何介质中的精子细胞。例如，术语精子样品可以涵盖粗射出物、净射出物、或精液，以及悬浮于缓冲液、稀释液(extender)、染色剂或其他介质等的任何组合中的处理的或部分处理的精子。

如本文使用的，术语“仪器参数”应理解为包括与在仪器中、仪器的或与仪器相关的分析和/或分选条件相关的设置，其中这样的设置可以通过对仪器的手动或自动调节来修改。对于流式细胞仪或其他相似的仪器来说，仪器参数可以包括，样品压力、样品流动速度、鞘液压力、鞘液流动速度、液滴驱动频率、液滴驱动幅度、重合抛弃逻辑(coincidenceabortlogic)、门选区域(gatingregions)、分选逻辑和其他类似的设置。

术语“分选参数”可以包括与颗粒分选仪中进行的分选相关的那些条件。分选参数可以包括测量的分选参数，以及离线测定的参数、操作员估计的参数，和与分选的颗粒或细胞的群体相关的条件。

“测量的分选参数”可以包括在分析和/或分选颗粒或细胞的群体时在颗粒分选仪中直接测量的、计算的、或确定的与分选相关的那些条件。对于流式细胞仪或其他类似的仪器来说，测量的分选参数可以包括：事件速率、分选速率、分选效率、抛弃速率(abortrate)、死亡门百分比、活的定向门百分比、谷峰比，或其他分选门例如X-分选门或Y-分选门中的事件百分比。

如本文使用的，术语“重合事件”可以被理解为颗粒分选仪中的下述单独事件，其中一个或更多个颗粒或细胞过于靠近而不能被分离用于单独收集，以及其中两个细胞或颗粒中仅希望收集一个。对于液滴分选空气中激发式(jet-in-air)流式细胞仪来说，重合事件可能在两个精子足够靠近从而它们停留于同一液滴中、但这两个细胞中仅希望收集一个的时候发生。

术语“分选效率”可以理解为是指就被分析的一组细胞或颗粒中分选的或收集的颗粒或细胞的百分比而言的颗粒或细胞的回收率。被分析的细胞组可以是被分析的细胞的总数，或可以是被分析的细胞的总数的子集，例如，确定为存活的被分析细胞，或者希望用于分析和可能的收集的被分析细胞。

对于分选来说，本文使用的术语“生产力”可以理解为是指每单位时间分选的或收集的颗粒或细胞的数量。

对于分选来说，术语“纯度”可以指收集或分选的颗粒或细胞的群体中具有要分选颗粒的特征的细胞或颗粒的实际百分比或估计百分比。对于精子来说，纯度可以指不考虑分选的精子的生存力，在带X-染色体精子分选的群体中带X-染色体精子的百分比，或在带Y-染色体精子分选的群体中带Y-染色体精子的百分比。

术语“抗氧化剂”是指一大类分子的任一种，它们或抑制另一分子的氧化，代替目标底物而自身被氧化，或结合有害的自由基中间体和中断细胞内的氧化链反应。大多数抗氧化剂具有双重作用；某些是酶类，其他的是非酶的；某些其他的是维生素和其他辅因子。这种多样性赋予了抗氧化剂的多样性，但是由于它们已知的最小化细胞损伤的能力，它们常常作为仅具有单一功能——结合自由基的单一化合物类别被归并在一起。

本文公开的某些方面涉及在颗粒分选仪中分选精子样品的方法，然而，所描述的方法不局限于任何特定的仪器。颗粒分选仪可以包括空气中激发式(jet-in-air)流式细胞仪，例如LegacySX流式细胞仪、XDP流式细胞仪(BeckmanCoulter，MiamiFL，USA)；然而也可以修改其他商业上可获得的流式细胞仪用于精子分选。空气中激发式流式细胞仪可以装备有定向特征(例如，用于将精子定向的喷嘴)，用于均匀照射细胞的光学器件，和/或用于收集来自所有细胞而不考虑它们的取向的荧光发射的径向均匀光学器件。还可以使用具有不同的流动室的细胞仪，例如，具有封闭的室或比色杯的流式细胞仪。另外，一些设备，例如，具有分选功能的微流体芯片，例如用于将颗粒偏转到分叉出口中的声学或流体学装置，可以根据本文描述的某些实施方式来使用。

分选前精子处理

本文描述的某些方面涉及改善性别分选的精子的受精力的方法，例如，产生展现出剂量响应的性别分选的精子的方法，或能够在提高的压力下分选的方法。在染色之前使精子标准化、在单一稀释度(dilution)下染色精子以及改变捕获管的位置的每一种可以独立地降低这种损害，或甚至可能消除这种损害。对现有分选过程的这些修改的某些组合可以提供协同效益。

通过收集新的射出物，通过解冻冷冻的精子样品，或在接纳的动作中，都可以获得或提供精子样品。精子样品可以是纯净的精液、经稀释的精子、冷冻-解冻的精子或其组合。可以在进行其余步骤的同一位置获得精子群体，或可以在适当的精子稀释液中稀释以用于转运到分选机构。一旦获得了精子，精子可以在适当的稀释液中维持在室温、冷藏，或甚至冷冻用于以后使用。用于染色和分选的精子可以获自哺乳动物，或可以是从保藏所获得的精子，例如，获自保藏所的冷冻的或冷藏的细管(straw)。做为选择，可以将冷冻的或稀释的精子集中。

精子的群体可以来源于哺乳动物，例如，c所列出的哺乳动物，其内容通过引用合并在本文中。

在收集、解冻或甚至集中的时候，可以检测精子的浓度、pH、运动性和/或形态。另外，可以在进一步的处理步骤之前添加抗生素。

在一个实施方式中，一旦获得了精子，精子可以可选地被标准化到目标浓度范围，和/或接近目标pH值范围。如本文使用的，“标准化”可以理解为使得射出物的特征进入目标范围或接近所述目标范围。例如，虽然牛的射出物可能在pH值和精子浓度上变化非常大，使精子浓度或pH值标准化的步骤可以包括添加缓冲保持介质，其用来使得pH值标准化和缓冲对抗射出物随时间变为更加酸性的倾向。作为非限制性实例，精子样品的pH值和浓度可以用具有目标pH值的缓冲保持溶液在分选前进行标准化。精子样品可以以1∶1～1∶10，或可能以1∶3的比例在缓冲保持介质中稀释。然后可以将缓冲的精子样品离心，并可以除去上清液以达到目标浓度范围。做为选择，缓冲的精子样品可以被离心成球团并重悬浮在缓冲保持介质或其他类似的稀释液中。

预定浓度和pH值的每一项对于不同的物种或甚至对于物种内的不同的动物品种是特定的。在一个实施方式中，精子样品可以与初始稀释液组合，例如，以高容量缓冲液或具有大的pH值缓冲能力的稀释液的形式的缓冲保持介质。缓冲保持介质和之后描述的其他介质可以包括TRIS柠檬酸盐、柠檬酸钠、碳酸氢钠、HEPES、TRIS、TEST、MOPS、KMT、TALP和其组合。也可以采用具有高能力缓冲pH值的缓冲剂的其他稀释液，并且可以与促进精子生存的其他成分组合使用。作为添加剂的实例，可以以蛋黄、奶、脂蛋白、卵磷脂、酪蛋白或白蛋白或其他蛋白质来源的形式加入蛋白质。还可以以单糖例如果糖、葡萄糖或甘露糖，或甚至二糖或三糖的形式加入能量源。另外，在缓冲保持介质中可以采用抗氧化剂和抗生素以促进精子生存。也可以在初始稀释液或缓冲保持介质中补充其他添加剂，例如牛血清白蛋白(BSA)。

缓冲保持介质可以设置在预定的目标pH以将所有获得的精子样品的pH标准化，例如约6.8～7.4的pH。在一个实施方式中，缓冲保持介质被调节到7.2的pH。另外，精液可能随时间逐渐变得酸性，这可能归因于精液中的蛋白质，或归因于死亡细胞或濒死细胞的酸性代谢产物或副产物。缓冲保持介质引入足够的游离质子(即，H+)结合位点来将pH值维持在目标pH值附近。即使在精子随时间变得更为酸性的自然趋势下，缓冲保持介质提供了均匀的起始点，以用于在整个其他处理步骤期间稳定多个精子样品的pH值。

缓冲保持介质可以包含抗生素以防止细菌增殖。作为非限制性实例，泰乐霉素、庆大霉素、林可霉素、利高霉素、大观霉素、青霉素、链霉素和其组合可以添加到缓冲保持介质中。

抗氧化剂也可以引入缓冲保持介质中以降低自由基和氧化胁迫。虽然当前的讨论涉及在缓冲保持介质中使用抗氧化剂，抗氧化剂可以在精子分选过程的多个阶段独立地或组合地加入，如在国际专利申请WO2012167151中描述的，其全部内容通过引用合并在本文中。可以引入的抗氧化剂的非限制性列表包括：过氧化氢酶、SOD、SOD模拟物、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸盐、己酸、巯基乙醇、BHT、硫辛酸、黄素类、奎宁类、维生素K(和相关的类维生素)、维生素B12、维生素B12类维生素、维生素E(和相关的类维生素)、生育酚、生育三醇、α-生育酚、α酮戊二酸(AKG)、丙二醛(MDA)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)和它们的生物学活性衍生物，以及其组合。

抗氧化剂的浓度可以在0.01mg/ml～0.5mg/ml的范围内，上文列出的非限制性实例抗氧化剂可以以0.01mg/ml～5.0mg/ml、0.01mg/ml～0.25mg/ml、0.01mg/ml～0.5mg/ml、0.01mg/ml～1mg/ml、0.01mg/ml～2.5mg/ml、0.01mg/ml～5mg/ml、0.05mg/ml～0.1mg/ml、0.05mg/ml～1.0mg/ml、0.05mg/ml～2.5mg/ml、0.1mg/ml～0.25mg/ml、0.1mg/ml～0.5mg/ml、0.1mg/ml～1mg/ml、0.1mg/ml～2.5mg/ml、0.1mg/ml～5mg/ml、0.15mg/ml～0.45mg/ml、0.15mg/ml～0.5mg/ml、0.25mg/ml～0.35mg/ml、0.25mg/ml～0.5mg/ml、0.25mg/ml～1mg/ml、0.25mg/ml～2.5mg/ml、0.25mg/ml～5mg/ml、0.35mg/ml～0.5mg/ml、0.35mg/ml～1mg/ml、0.35mg/ml～2.5mg/ml、0.35mg/ml～5mg/ml、0.5mg/ml～1mg/ml、0.5mg/ml～2.5mg/ml、0.5mg/ml～5mg/ml、1mg/ml～2.5mg/ml和1mg/ml～5mg/ml的浓度提供。

可以以约1∶1～约1∶10的比例在缓冲保持介质中稀释精子样品。作为一个实例，净射出物可以以1∶2～1∶5的精液与缓冲液之比在缓冲保持介质中稀释。在一个实施方式中，精子样品可以以1∶3的比例在缓冲保持介质中稀释。稀释可以降低精子对精浆中存在的某些有害因子的暴露。经稀释的精子样品然后可以通过离心、除去上清液和重悬浮来再浓缩。离心的精子样品可以重悬浮在一定体积的缓冲保持介质中，或另一类似的缓冲介质中，所述体积使得精子浓度达到或接近目标浓度。可以根据其他的精子处理步骤来选择目标浓度。例如，在性别分选牛的情况下，精子可以再浓缩到约240000万精子/ml～约50000万精子/ml之间以模拟天然的浓度范围。其他浓度，例如，约140000万精子/ml～约210000万精子/ml之间，或约170000万精子/ml～约210000万精子/ml之间，也可以用于进一步处理。以此方式以此方式，来自精子的精浆可以用一种或更多种缓冲液，例如缓冲保持介质来稀释和替换。

调节精子浓度和pH可以提供用于进一步处理的均匀的起始点。例如，相对一致的pH和浓度可以在例如使用DNA选择性染料染色精子时提供更高的可预测性。如果每种样品被调节到相同的目标pH和浓度，对每次新的收集可以需要更少的试验来确保用于性别分选的充分染色。

精子的群体会包括带X-染色体的精子和带Y-染色体的精子。另外，带X-染色体的精子和带Y-染色体的精子的每一种都将包括活力精子和无活力精子。活力精子可以认为是具有完整的膜的精子，而无活力精子可以认为是具有受损的膜的精子。在常规的精子分选中活力精子和无活力精子之间的区分是通过掺入穿透膜受损精子的淬灭染料来确定的。倾向于死亡或濒死的精子吸收淬灭染料，产生不同于其余精子群体的荧光信号，而具有完整膜的精子倾向于存活并将阻止淬灭染料的摄取。在适当的配剂中，活力精子一般将能够在人工授精中实现受精，而无活力精子或膜受损的精子可能不能在人工授精中实现受精，或具有大大降低的受精能力。然而，能够受精的某些精子可能具有受损的膜，具有完整膜的某些精子可能不能受精。

无论是否在缓冲保持介质中稀释，精子样品可以用包含DNA选择性染料的染色溶液来染色。在染色步骤中，精子群体的至少一部分与染色溶液和DNA选择性荧光染料温育，以化学计量地染色精子样品中每个细胞的DNA内容物。与其他DNA选择性染料相比，Hoechst33342倾向于具有更低的毒性。递送这种染料的载体可以是调节到约7.4的pH值的修改的TALP缓冲液的形式。Hoechst33342在美国专利5,135,759中描述，通常被用于这种目的。然而，也可以使用其他的UV激发性染料，以及可见光激发性染料、荧光聚酰胺、荧光核苷酸序列和性别特异性抗体。

天然然状态中的精子对这种染料常常是不容易渗透的。为了产生均匀的染色，染色的第一步骤可以包括在提高的pH值下在染色溶液(本文有时称为染色缓冲液)中在提高的温度下将精子群体的至少一部分和染料温育。适当的染色溶液的实例可以是基于TALP、TES-TRIS、TRIS柠檬酸盐、柠檬酸钠或HEPES的介质，每一种都在WO2005/095960中描述，通过引用将其合并在本文中。在WO2001/37655中描述的示范性的修改的TALP在表1中说明。

表1-修改的TALP缓冲液

作为一个实例，精子群体或精子群体的一部分可以用染色溶液稀释到缓冲液中的640×10⁶～40×10⁶个精子/ml之间，到约320×10⁶～80×10⁶个精子/ml之间，或约160×10⁶个精子/ml。DNA选择性荧光染料可以以约10μM～200μM之间、约20μM～100μM之间或约30μM～70μM的浓度添加到缓冲液中悬浮的精子中。缓冲液的pH值可以在约6.8～7.9之间、约7.1～7.6之间，或处在约7.4，以帮助确保核DNA的均匀染色。本领域的技术人员将理解，pH值可以通过添加NaOH来提高，通过添加HCl来降低。任选地，早先描述的抗氧化剂和浓度可以添加到染色溶液中。

精子样品可以在30～39℃之间，约32～37℃之间，或约34～36℃下温育。温育的时间可以在约20分钟～约3小时之间，约30分钟～约90分钟之间，或约45分钟～约60分钟。作为一个实例，精子群体可以在34℃下温育约45分钟。即使在单个物种内，精子浓度和pH值和其他影响染色性的因素可以是动物与动物之间不同的。在物种之间，以及甚至在品种或同一品种的动物之间温育精子的微小变化，来实现均匀染色而没有精子群体的过度染色。

除了DNA选择性染料之外，淬灭染料可以为了渗透膜受损精子和淬灭它们产生的信号的目的来应用，淬灭染料可以理解为包括与膜受损精子差异性结合的染料。可能因为膜破裂或逐渐变得多孔，这些染料进入膜受损精子更加容易。也可能是淬灭染料容易进入所有的精子膜，健康精子比膜受损精更快地主动泵出淬灭染料。在两种情况下，与淬灭染料结合的精子包括大部分死亡的和濒死的精子，不过不必是所有的死亡的和濒死的精子。产自与淬灭染料结合的膜受损精子的淬灭的信号对于健康精子的信号有足够的独特性，从而它们可以从应用于活力精子的进一步的分析和分选中除去。

在一个实施方式中，淬灭染料和DNA选择性染料在单独的稀释中一起应用。在这种实施方式中，在染色溶液中在提高的温度下，淬灭染料与DNA选择性染料一起温育。举例来说，染色溶液可以是具有7.4的pH的修改的TALP。然而，可以采用其他染色剂，包括具有DNA选择性染料和淬灭染料的基于TES-TRIS、TRIS柠檬酸盐、柠檬酸钠或HEPES的介质，pH可以在约7.0～7.8的范围内。在一个实施方式中，在7.4的pH下染色之前，当精子在约7.2的提高的pH下标准化时，可能存在协同作用。以此方式，精子所暴露的pH以最小的改变保持在恒定的范围内。由于染色溶液和缓冲保持介质两者都具有高的缓冲能力，据认为可以避免精子随时间变得更为酸性的天然趋势。另外，通过使精子经受的pH改变最小化，据认为精子处于更健康的状况，以更好地面对性别分选过程中经受的各种压力和刺激，包括但不限于在40psi下运行的流式细胞仪中产生的额外的胁迫和剪切力。在单个稀释中染色精子可以帮助精子在提高的鞘液压力(例如，大于40psi的鞘液压力、40～65psi之间、50～60psi之间或约60psi的鞘液压力)下的分选中存活。

在另一个实施方式中，淬灭染料在第二染色步骤中添加，所述第二步骤进一步降低精子样品中的精子浓度。第二染色溶液的pH可以被靶定来实现最终的精子样品中的目标pH值。在公开的PCT国际申请WO2011/123166和国际申请PCT/US12/58008中描述了双步骤染色过程的非限制性实例。

染色溶液可以补充添加剂，例如处于早先描述的浓度范围的抗氧化剂。在某些实施方式中，提高的温度可能提高自由基和被染色的精子经受的氧化胁迫。因而，抗氧化剂可以用来中和自由基和降低被染色的精子经受的氧化胁迫。可以掺入染色过程的抗氧化剂的非限制性列表包括：过氧化氢酶、SOD、SOD模拟物、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸盐、己酸、巯基乙醇、BHT、硫辛酸、黄素类、奎宁类、维生素K(和相关的类维生素)、维生素B12、维生素B12类维生素、维生素E(和相关的类维生素)、生育酚、生育三醇、α-生育酚、α酮戊二酸(AKG)、丙二醛(MDA)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)和它们的生物学活性衍生物，以及其组合。可以使用任何早先描述的浓度。

上文描述的分选前的方法的某些方面可以以协同的方式组合。例如，精子可以标准化到目标pH和浓度，在整个分选前处理期间维持在相对窄的pH值范围内，并在整个分选前处理过程中暴露于均匀水平的抗氧化剂。单独地或组合地，对分选过程的这些修改可以帮助精子更好地在流式细胞仪分选中存活。然后精子可以在更高浓度和更高压力下分选，可能甚至是早先被认为对精子健康状态有害的压力下，来实现改善的效率和通过量。最后，在下文的实施例中实现的改善的精子健康状态还可以提供在人工授精中展现出剂量响应的性别分选的精子。能够展现剂量响应的性别分选的精子然后可以以与具有与常规的未分选精子相当的受精力的剂量中用于人工授精。

精子分选

无论是否标准化到预定的pH和浓度，以及无论是在单个稀释物(singledilution)中还是在两个稀释物(twodilution)中染色，精子样品可以通过颗粒分选仪，例如，流式细胞仪来分选。参考图1，呈现了空气中激发式流式细胞仪(10)，然而分选可以用微流体芯片或其他类型的流式细胞仪(包括具有密闭腔室和细胞仪的的流式细胞仪以及合并了消融激光的细胞仪)来进行。流式细胞仪(10)包括用于产生精子样品的流动的细胞源(12)，例如，用于分选的染色的精子样品的流。精子样品被递送到喷嘴(14)的速率可以被认为是样品流动速度，可以通过样品压力来测定。经染色的精子样品的流动沉积在喷嘴(14)之内，并被导入或流入鞘液(18)的液流(16)。鞘液(18)可以由鞘液源(20)供应，从而随着细胞源(12)将精子供应入鞘液(18)，它们可以同时进给通过喷嘴(14)。鞘液(18)可以以一定的鞘液流动速度来供应，其由鞘液压力决定。以此方式以此方式，鞘液(18)形成同轴地围绕着具有经染色精子的样品的液流，其在喷嘴出口孔(22)处离开喷嘴(14)。振荡器(24)由振荡器控制器(26)精确地控制，通过提供振荡器(24)，可以在喷嘴(14)内建立压力波，并传输给在喷嘴出口孔(22)处离开喷嘴(14)的液体。响应于压力波，离开喷嘴出口孔(22)的液流(16)最终以精确的间隔时间形成规则的液滴(28)。所形成的液滴的频率以及在一定程度上其形状可以由提供给振荡器(24)或振荡器控制器(26)的液滴驱动频率和液滴驱动振辐来控制。

每一个形成的液滴保持了鞘液和精子样品，它们在之前形成了液流(16)的一部分。由于经染色的精子被液流(16)或鞘液环境围绕，液滴(28)理想地含有单独分离的精子。然而，样品浓度、样品压力、喷嘴出口孔(22)的直径以及其他仪器参数决定了多个细胞规律地占据单个液滴的频率，以及含有精子的液滴的百分比。

流式细胞仪(10)基于预计被包含在液滴中的精子的特征来分选液滴。这可以通过与分析仪(36)连通的细胞感应系统(30)来实现。细胞感应系统(30)包括对液流(16)内含有的细胞起响应的至少一个传感器(32)。作为一个实例，两个正交的PMT可以加入到精子分选流式细胞仪中以用于在0度和90度下检测荧光，然而可以容易地采用其他传感器结构，例如在WO2010/021627中描述的那些。

细胞感应系统(30)向分析仪(36)提供数据，其可以根据液流(16)中细胞特征的相对存在或相对缺乏来引起动作。某些特征例如精子的相对DNA含量可以通过用电磁辐射源(34)激发来检测，例如，产生经染色精子可响应的辐射束的激光。电磁辐射源(34)可以是在UV波长(例如，约355nm)下操作的激光。这样的激光器的实例可以是Vanguard350(可获自Spectra-Physics)，其在350mW下运行。可以采用各种光学器件来改变激光的波束剖面的形状，将波束分成超过一个波束，或降低液流上的波束功率。这样的光学器件的非限制性实例可以在WO/2004/104178和WO/2001/85913中找到，它们的每一个通过引用合并在本文中。

个体精子的特征，特别是X-染色体或Y-染色体的存在可以从响应于电磁辐射源(34)产生的检测荧光来确定。特别地，细胞感应系统(30)的结构可以与分析仪(36)连通，以用于提供形成时的多种荧光，例如，事件的正向荧光、事件的侧向荧光，与事件相关的散射的量。分析仪(36)可以包括书面说明书，以用于分析细胞感应系统(30)中一个或更多个传感器(32)产生的信号。DNA选择性荧光染料化学计量地结合精子DNA。由于带X-染色体的精子比带Y-染色体的精子的含有更多的DNA，与带Y-染色体的精子相比，带X-染色体的精子可以结合更多数量的DNA选择性荧光染料。因而，通过测量在激发时由结合的染料发射的荧光，可以区分带X的精子和带Y的精子。除了定向的和非定向的精子之外，可以根据引入了分选逻辑的门选区域通过分析仪(36)区分有活力或无活力的精子等区别。

为了实现基于染色的精子特征的分隔和分离，可以由传感器(32)检测散射光，信息提供给与液滴充电器偶联的分析仪(36)，液滴充电器基于液滴(28)内含有的染色精子的特征为每个液滴(28)差异性充电。以此方式，基于液滴是否含有适当的颗粒或细胞，分析仪(36)起作用来允许静电偏转板(38)偏转液滴(28)。

结果，通过使得含有精子的液滴(28)导向一个或更多个收集容器(40)，流式细胞仪(10)起作用来分离染色的精子。例如，当分析仪基于精子特征区分精子时，夹带带X-染色体精子的液滴可以被充正电，因而向一个方向偏转，而夹带带Y-染色体精子的液滴可以被充负电，因而向另一个方向偏转，废弃的液流(不夹带颗粒或细胞或者夹带非期望或不可分选的细胞的液滴)可以保持不带电，因而从未偏转的液流中收集进入吸引管等等。做为选择，可以收集带X-染色体的精子或带Y-染色体的精子之一，而其他的与废物一起丢弃。一旦被偏转，液滴则可以收集在包括捕获液的收集容器中。捕获液可以包含稀释液，类似于缓冲保持介质或类似于可以用于冷却或冷冻分选的精子的随后的稀释液。举例来说，捕获液可以包含缓冲成分，例如TRIS柠檬酸盐、柠檬酸钠、碳酸氢钠、HEPES、TRIS、TEST、MOPS、KMT、TALP或其组合。也可以采用具有高缓冲pH能力的其他缓冲液，这些的任一种可以与促进精子生活力的其他成分一起使用。作为添加剂的实例，可以以蛋黄、奶、脂蛋白、卵磷脂、酪蛋白或白蛋白或其他蛋白质来源的形式加入蛋白质。还可以以例如果糖、葡萄糖或甘露糖等单糖，或甚至二糖或三糖的形式加入能量源。另外，在初始稀释液中可以采用抗氧化剂和抗生素以促进精子生活力。

可以引入捕获液的抗氧化剂的非限制性列表包括：过氧化氢酶、SOD、SOD模拟物、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸盐、己酸、巯基乙醇、BHT、硫辛酸、黄素类、奎宁类、维生素K(和相关的类维生素)、维生素B12、维生素B12类维生素、维生素E(和相关的类维生素)、生育酚、生育三醇、α-生育酚、α酮戊二酸(AKG)、丙二醛(MDA)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)和它们的生物学活性衍生物，以及其组合。

抗氧化剂的浓度可以在0.01mg/ml～0.5mg/ml的范围内，作为非限制性实例上文列出的抗氧化剂可以以0.01mg/ml～5.0mg/ml、0.01mg/ml～0.25mg/ml、0.01mg/ml～0.5mg/ml、0.01mg/ml～1mg/ml、0.01mg/ml～2.5mg/ml、0.01mg/ml～5mg/ml、0.05mg/ml～0.1mg/ml、0.05mg/ml～1.0mg/ml、0.05mg/ml～2.5mg/ml、0.1mg/ml～0.25mg/ml、0.1mg/ml～0.5mg/ml、0.1mg/ml～1mg/ml、0.1mg/ml～2.5mg/ml、0.1mg/ml～5mg/ml、0.15mg/ml～0.45mg/ml、0.15mg/ml～0.5mg/ml、0.25mg/ml～0.35mg/ml、0.25mg/ml～0.5mg/ml、0.25mg/ml～1mg/ml、0.25mg/ml～2.5mg/ml、0.25mg/ml～5mg/ml、0.35mg/ml～0.5mg/ml、0.35mg/ml～1mg/ml、0.35mg/ml～2.5mg/ml、0.35mg/ml～5mg/ml、0.5mg/ml～1mg/ml、0.5mg/ml～2.5mg/ml、0.5mg/ml～5mg/ml、1mg/ml～2.5mg/ml和1mg/ml～5mg/ml的浓度提供。

在一个实施方式中，在缓冲保持介质、染色溶液和捕获液的每一种中补充抗氧化剂。抗氧化剂可以包含相同的添加剂或添加剂的组合，可以以各自类似的浓度存在于缓冲保持介质、染色溶液和捕获液的每一种中。以此方式，可以在整个分选过程中缓解精子的氧化压力。以此方式，上文描述的分选方法的各个方面可以在整个分选过程中以协同的方式组合。例如，精子可以被标准化到目标pH和浓度，并在整个分选过程中维持在相对窄的pH范围内。精子还可以在整个分选过程中暴露于均一的抗氧化剂水平。单独地或组合地，这些修改可以帮助精子更好地在流式细胞仪分选中存活，容许精子在更高压力下、甚至可能在早先被认为对精子健康有害的压力下分选，或在人工授精中与性别分选的精子一起实现剂量响应。

控制器(42)可以形成分析仪(36)的一部分，或可以是分析仪(36)外部的部件。举例的控制器(42)还可以代表单个控制器的集合。控制器(42)可以接受来自分析仪(36)的信号或指令，并且在响应时可以修改一个或更多个仪器参数，例如，样品流动速度、样品压力、鞘液流动速度、鞘液压力、液滴驱动频率或液滴驱动振辐等等。控制器(42)还可以为操作员输入提供界面，以人工地调节样品流动速度、样品压力、鞘液流动速度、鞘液压力、液滴驱动频率、液滴驱动振辐等等。分析仪(36)可以包括书面说明书，以用于响应于测量的分选参数来修改仪器参数，或者对仪器参数的修改可以通过操作员调节各种设置来人工地进行。对仪器参数的修改可以在分析仪(36)中进行，例如，改变分选逻辑、抛弃逻辑、分选区域或门选区域，以及对于在分析仪中进行分选判定特定的其他参数。对仪器参数的其他修改可以通过控制器(42)实现，用于控制分析仪的各种外部部件，例如，以用于控制样品压力、样品流动速度、鞘液压力、鞘液流动速度、液滴驱动频率和液滴驱动振辐。

图2呈现了来自经染色精子的空气中激发式流式细胞仪的侧向荧光和正向荧光的代表性的双变量直方图，其可以由分析仪(36)产生。数据的视觉呈现可以被操作员使用，来接受与经历分选的样品相关的反馈，以及图形地展现当前的分选逻辑的某些方面。例如，R1可以被看作门选区域，其可以被应用于流式细胞仪的分选逻辑。可以在分析仪(36)的显示器上提供其他的数字输出。这样的数字输出可以是测量的分选参数的形式，例如，事件速率、抛弃速率、分选速率、分选效率，或任何区域或门中颗粒的百分比。R1被作为一种区域来呈现，该区域被认为是活的定向区域，因为R1的边界包括两种密实的细胞群体，它们反映了紧密相关的带X-染色体的精子群体和带Y-染色体的精子群体。R2是围绕无活力精子或膜受损精子的门选区域集，它们的荧光被淬灭染料淬灭。虽然可以采用各种分选逻辑，与R1和R2相关的两种策略可以是分选逻辑中的第一步骤，从而落入R1的所有事件被接受用于进一步的处理或门选。做为选择，落入R2范围之外的所有事件被接受以用于进一步的处理或门选。

图3呈现了直方图形式的单变量曲线，其可以由分析仪(36)产生，并为操作员生成为图形表示。图3中呈现的数据可以代表某一时期内来自侧向和正向荧光的峰值信号强度的发生数目。对于精子来说，取决于物种，带X-染色体的精子和带Y-染色体的精子倾向于具有在2～5％之间变动的峰值强度，这种差异反映在图2中所见的峰值强度的双峰分布中。由于带X-染色体的精子和带Y-染色体的精子倾向于具有不同的荧光值，每个峰代表带X-染色体的精子或带Y-染色体的精子之一。根据分析仪(36)中应用的分选逻辑，直方图中的细胞群体可以仅是被确定为有活力的定向细胞的那些细胞，例如，落入图2中的R1中的那些，或者它们可以代表未被确定为死亡或不期望的那些细胞，例如，除了落入R2的那些之外的每一个事件。多种分选参数可以衍生自这种直方图内含有的信息。例如，两个峰之间的区分性水平可以提供分选纯度如何的指示。图3进一步说明了在两个组之间的最低点的相对强度测量，其可以被认为是值V，以及在直方图的峰或多个峰处的第二相对强度P。直方图的目视检查可以为操作员提供流式细胞仪进行得如何的印象，而测定P值、V值以及V与P的比值的计算机执行的指令还没有在商业的精子分选仪中实现。谷峰比可以被确定为分选过程期间周期性的测量的分选参数。虽然不必然地完全决定分选纯度，谷峰比可以提供快速估计纯度值的手段，其由分析仪(36)中的书面说明书的执行自动地提供，或由操作员的目视检查人工地提供。做为选择，反比关系，即峰谷比，作为倒数值提供了相似的信息。

来到图4，可以由分析仪(36)响应于细胞感应系统(30)获得的信号来产生第二双模态曲线。所述双模态曲线可以代表第一轴线，其说明正向荧光信号的峰值强度值或侧向荧光信号的峰值强度。如图3一样，图4中呈现的数据可以被门选，从而仅包括落入图2的R1之内的事件。做为选择，对于精子来说，也可以显示没有落入死亡门R2的所有事件。

R3可以代表用于收集带X-染色体的精子的X-分选门。术语X-分选门在本文中与术语X-门可互换地使用。参考图4，它展现了改变门选区域的大小如何地影响效率、纯度和生产力。如果要扩展R3区域，可以看出每一秒钟更多的精子被分选为带X-染色体的精子，产生更高的分选效率和更高的生产力。然而，R3门或区域的扩大将会开始包括具有更高可能性是带Y-染色体的精子的事件。为了提高精子的分选纯度，可以使R3区域更小，和/或从Y-染色体区域移开。由于更少的事件落入X-分选门，更少的精子被分选入带X-染色体的精子群体和具有更高概率实际是带X-染色体的精子的那些之中，意味着可以提高收集的纯度。然而，随着更少的事件落入R3区域和抛弃更多的重合事件，就细胞收集而言的效率以及就每秒的分选而言的生产力将会降低。另外，随着修改其他的仪器参数，图2、图3和图4呈现的图形可能在形状和性质上改变。例如，提高样品压力或样品流动速度可能引起谷峰比的降低，或可能另外地降低带X-染色体的精子和带Y-染色体的精子之间的双模态区别。

剂量响应和提高的分选剂量

常规的精液可以被理解为根据标准的产业实践收集的精液。作为收集常规精液的标准产业实践的一个非限制性实例，由DeJarnette等″Effectsof2.1and3.4x10⁶sexsortedspermdosagesonconceptionratesofHolsteincowsandheifers，″JournalofDairyScience，第93卷，第4079-7085页(2010)描述为常规的方法用1500万常规的(未分性的)精子提供了62％的妊娠率。如实施例7中说明的，本文提供的某些分选方法产生了具有59.9％的受精力，或甚至高达66.7％的性别分选的精子。与1500万常规精子的对照(66.5％)相比，300万性别分选的精子(60.0％)和400万性别分选的精子(66.7％)分别提供了90％和100％的相对受精力。与一剂1500万常规精液相比，400万性别分选的精子不生产统计学上显著的受精力损失(P＜0.05)。要理解的是，大量的因素可能影响受精，例如，时间或年度、环境温度、初产母牛v.母牛、检测发情期的精确性、AI技术员熟练度、以及具体品种的特定特征，或甚至不同的畜群或具体的动物。因而，由于许多理由，对于性别分选的精子和常规的精子，受精力都可以被认为是可变的。因而，在一个实施方式中，分性的精子可以被理解为具有是未分性的常规对照的90％的受精力。在另一个实施方式中，根据本文描述的某些方法分选的、性别分选的牛精子的受精可能具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、或甚至至少约67％或更高的受精力。

根据本文描述的某些实施方式分选的精子可能具有受精力特征，包括高达常规精液的受精力的至少90％的受精力，或甚至与常规精液一样高的授精力。如实施例7中展现的，300万性别分选的精子的剂量能够达到常规精液的受精力的90％，400万性别分选的精子的剂量能够达到与1500万常规(未分性的)精子的剂量相同的授精力。

作为非限制性实例，细管可以填充约300万精子～约400万精子、约400万精子～约500万精子、约500万精子～约600万精子、约600万精子～约700万精子、约700万精子～约800万精子、约800万精子～约900万精子、约900万精子～约1000万精子、约1000万精子～约1100万精子、约1100万精子～约1200万精子、约1200万精子～约1300万精子、约1300万精子～约1400万精子、约1400万精子～约1500万精子、约1500万精子～约1600万精子、约1600万精子～约1700万精子、约1700万精子～约1800万精子、约1800万精子～约1900万精子、和约1900万精子～约2000万精子。

虽然再浓缩分选的精子的步骤可以很大程度上替换在整个分选过程中使用的稀释液和染色液，但可能留存残余量的这些稀释液和其各种成分。作为一个实例，在抗氧化剂添加到初始稀释液(缓冲保持介质)的实施方式中，抗氧化剂可能以残余量在最终的精子配剂中存在。另外，在染色的步骤中提供的抗氧化剂也可能以残余量存在于最终的精子配剂中。可理解地，捕获液中存在的抗氧化剂也可能存在于最终的配剂中。以此方式，精子的配剂，例如300万～2000万性别分选的精子可能含有残余量的第一抗氧化剂、残余量的第二抗氧化剂和残余量的第三抗氧化剂。在一个实施方式中，相同的抗氧化剂或抗氧化剂的组合可以添加到初始稀释液、染色液和捕获液的每一种中，并且可以在最终形式上仍被认为是第一、第二和第三残余抗氧化剂。

一旦被分选，可以制备精子的单独配剂用于人工授精(AI)、体外受精(IVF)或细胞质内的精子注射(ICSI)。用于辅助生殖技术的精子一般被保存在细管中。早先，由于性别分选的精子不提供剂量响应的事实，性别分选的精子常常以约10×10⁶个精子/ml的浓度装入0.25ml细管。由于为了密封精子的塞子在每个细管中占据的小体积，在分选的精子的每个细管中约210万的精子细胞死亡。

本发明的实施方式包括用于AI或IVF的配剂中的300万～2000万的精子。本文描述的某些实施方式在初始阶段在缓冲保持介质中加入抗氧化剂。可以理解的是，残余量的抗氧化剂可能与精子样品一起保留经过随后的染色、分选、以及在某些情况下冷冻的步骤。在这种情境下，缓冲保持介质中存在的抗氧化剂可能以残余量存在于最终的细管中，可以被称作第一残余量抗氧化剂。类似地，染色溶液中存在的第二残余量的抗氧化剂可能与精子样品一起保留经过分选和可能的冷冻步骤。为此，细管可能包括在染色步骤引入的第二残余量抗氧化剂。另外，捕获液中存在的残余量的抗氧化剂可能与精子样品一起保留，并作为第三残余量抗氧化剂停留在细管中。最后，第四数量的抗氧化剂可能在再浓缩精子样品之前或之后存在，与冷冻介质一起装入细管中。为此，第四数量的抗氧化剂可能以残余量存在，或以约0.1mg/ml～约5mg/ml的浓度存在。

实施例1

收集-使用人工阴道根据常规的收集方案从五头不同的公牛收集精子。每头公牛一天内收集两次或三次。五头公牛中，两头是娟姗公牛，三头是荷斯坦公牛。所有射出物含有大于60％的前进运动性，精子浓度从87500万精子/ml～248000万精子/ml。集中从同一公牛收集的射出物，然后分成九份精子样品用于收集和染色处理。

精子处理和染色-用九种不同的方法处理和染色每份公牛射出物的部分，在下文中描述每一种方法。

(A)对照(没有标准化，双步骤染色)-建立对照，其不包括使收集的射出物标准化的步骤，并且其中精子以两个步骤染色。在染色之前，根据样品起始浓度，通过离心或通过添加pH值6.8的tris-蛋黄稀释液，将精子样品浓缩到170000万精子/ml～180000万精子/ml之间。

对照组中的精子在如表1描述的修改的TALP缓冲液中在7.4pH下稀释到160×10⁶个精子/ml。对照组中的每份精子样品然后在34℃下与16-17μL的Hoechst33342/ml(64-68μM)的样品温育45分钟。温育之后，添加等体积的第二修改的TALP，降低浓度到80×10⁶个精子/ml。第二修改的TALP包括表1中描述的成分，并且添加有4％蛋黄、50μM黄色食用染料No.6(20g/L)，并且通过添加HCl将pH降低至5.5。

(B)稀释(没有标准化，双步骤染色)-在第二组中，精子不进行标准化，但是用具有20％蛋黄的稀释液稀释。然后按照与组(A)描述的相同的方式，将精子浓缩到170000万精子/ml～180000万精子/ml之间。然后按照组(A)中描述的同样的双步骤方式将精子在修改的TALP缓冲液中稀释到160×10⁶个精子/ml并染色。

(C)单步骤I(没有标准化，用1％蛋黄单步骤染色)-在第三组中，收集精子，按照与对照组(A)相同的方式调节浓度。然后每份精子样品在修改的TALP缓冲液中在pH值7.4下稀释至160×10⁶个精子/ml。修改的TALP缓冲液基本上相同于表1中描述的缓冲液，只是它另外包括1％蛋黄和浓度25μM的黄色食用染料No.6。该组中的每份精子样品然后在34℃与14-15μLHoechst33342/ml(56-60μM)温育45分钟。在温育之后，精子维持在160×10⁶个精子/ml的浓度。

(D)标准化的I(用3％蛋黄稀释液标准化，双步骤染色)-在该组中，在染色和分选之前通过调节pH和精子浓度来使精子标准化。在收集之后，精子在具有7.2的pH和高缓冲pH能力的初始稀释液中1∶3稀释。高能力缓冲液补充有3％蛋黄。然后离心所有样品，使得精子浓度降低到170000万精子～180000万精子/ml之间。标准化的精子然后根据(A)中描述的双步骤方法染色。

(E)标准化的II(用10％蛋黄稀释液标准化，双步骤染色)-在这个组中，按照组(D)中描述的相同方式在染色之前调节pH值和精子浓度来使精子标准化，只是初始稀释液为20％蛋黄。

(F)单步骤和标准化的I(用3％蛋黄稀释液标准化，用1％蛋黄单步骤染色)-在该组中，在染色和分选之前按照组(D)中描述的相同方式通过调节pH值和精子浓度来使精子标准化。然后用组(C)中描述的单步骤染色处理来染色标准化的样品。

(G)单步骤和标准化的II(用10％蛋黄稀释液标准化，用1％蛋黄的单步骤染色)-在该组中，在染色之前按照组(E)中描述的相同方式通过调节pH值和精子浓度来使精子标准化。然后用组(C)中描述的单步骤染色处理来染色标准化的样品。

(H)单步骤和标准化的III(用3％蛋黄稀释液标准化，不用蛋黄进行单步骤染色)-在该组中，在染色之前按照组(D)中描述的相同方式通过调节pH值和精子浓度来使精子标准化。标准化的样品然后用如组(C)中描述的单步骤染色处理来染色，只是单步骤染色TALP中没有添加蛋黄。

(I)单步骤和标准化的IV(用10％蛋黄稀释液标准化，不用蛋黄进行单步骤染色)-在该组中，在分选之前按照组(E)中描述的相同方式通过调节pH值和精子浓度来使精子标准化。标准化的样品然后用如组(C)中描述的单步骤染色处理来染色，只是单步骤染色TALP中没有添加蛋黄。

分选和数据获取-每份染色的样品在带有Genesis数码升级(Cytonome/ST，BostonMA，USA)的LegacySX流式细胞仪(BeckmanCoulter，USA)上分选。在双步骤过程中染色的那些样品以80×10⁶个精子/ml的浓度分选，通过单步骤处理染色的那些样品以160×10⁶个精子/ml的浓度分选。记录流式细胞仪采得的数据，包括与分选速率和精子亚群的门选相关的信息。例如，记录经门选为死亡的精子的百分比，以及经门选为活的定向并且过界(Overrange)的的精子的百分比，并对五头公牛进行平均。

结果-通过流式细胞仪中确定的分选参数所测定的定向的、非定向的和死亡的精子的百分比的比较在下文的表2中概述。

表2

与对照(A)相比，单步骤I(C)、标准化的I(D)和标准化的II(E)的组都展现了显著更低的死亡群体，分别降低4.58％、7.18％和10.85％。基于这些改进，在染色之前使精子样品标准化和将染色过程修改为单步骤的步骤独立地改善了精子在分选过程中存活的能力。另外，单步骤和标准化的I(F)、单步骤和标准化的II(G)、单步骤和标准化的III(H)以及单步骤和标准化的IV(I)展现了协同作用，借此，在单个步骤中标准化射出物和将射出物染色的组合效果大于任一种单独的改进。

参考表2，可以看出标准化的I(D)、标准化的II(E)、单步骤和标准化的I(F)以及单步骤和标准化的II(G)，就降低死亡精子的数量而言，看起来都提供了显著的益处，但是定向的精子的百分比没有改善。这可能与标示为过界的一栏相关。虽然对于分选，更多的精子被门选为活的，看起来在高于分选门范围的散射信号上有提高。这种信号可能代表堆在一起的精子，或可能代表结合到蛋黄脂质的精子。无论是哪一种，出现了一般的模式，即，更多数量的蛋黄降低死亡精子数量，但是可能引入新的问题，因而可能需要一种平衡。

另外，加入了单步骤染色方法的每个试验提供了将DNA选择性染料Hoechst33342与精子细胞的核DNA结合的更有效的手段。在每种测试的条件之间维持了染色品质，但是仅包括单独染色步骤的测试利用了更少2μLHoechst/ml样品。用更少的Hoechst染色的能力为总体改善的精子健康状态作出了贡献。

实施例2

收集-使用人工阴道根据常规的收集方案从六头不同的娟姗公牛收集精子。所有射出物含有大于65％的前向运动性，精子浓度从76500万精子/ml～171000万精子/ml。每份精子样品在15mL试管中分成两部分，以用于两次收集和染色处理。在收集时以及在每个后续的处理步骤进行pH测量。

精子处理和染色-为了对比，每份公牛射出物的部分通过两种方法来处理和染色。

对照(没有标准化，双步骤染色)-建立对照，其不包括使收集的射出物标准化的步骤，并且其中精子在两个步骤中染色。在染色之前，根据样品起始浓度，通过离心或通过添加pH为6.8的tris-蛋黄稀释液，将精子样品浓缩到170000万精子/ml～180000万精子/ml之间。

对照组中的精子在如表1描述的修改的TALP缓冲液中在pH为7.4下稀释到160×10⁶个精子/ml。对照组中的每份精子样品然后在34℃下与16-17μLHoechst33342/ml(64-68μM)的样品温育45分钟。温育之后，添加等体积的第二修改的TALP，降低浓度到80×10⁶个精子/ml。第二修改的TALP包括表1中描述的成分，并且添加有4％蛋黄、50μM红色食用染料No.40(20g/L)，通过添加HCl将pH值降低至5.5。

单步骤和标准化的(用10％蛋黄标准化，使用百分之一蛋黄进行单步骤染色)-在该组中，在染色之前通过调节pH值和精子浓度来标准化精子。在收集之后，精子在具有7.2的pH和高缓冲pH能力的初始稀释液中1∶3稀释。高能力缓冲液补充有1％蛋黄。然后离心所有样品，使得精子浓度降低到170000万精子～180000万精子/ml之间。

然后精子样品在修改的TALP缓冲液中在pH为7.4下稀释到160×10⁶个精子/ml。修改的TALP缓冲液基本上相同于表1中描述的缓冲液，不同之处在于它另外包括1％蛋黄和浓度25μM的黄色食用染料No.6。该组中的每份精子样品然后在34℃与16-17μLHoechst33342/ml(64-68μM)温育45分钟。在温育之后，精子维持在160×10⁶个精子/ml的浓度。

分选和数据获取-每份染色的样品在带有Genesis数码升级(Cytonome/ST，BostonMA，USA)的LegacySX流式细胞仪(BeckmanCoulter，USA)上分选。对照在80×10⁶个精子/ml的浓度下分选，标准化的精子在160×10⁶个精子/ml的浓度下分选。通过流式细胞仪采得数据，然后对6头公牛进行平均。

结果-表3呈现了对照(A)和标准化的射出物(B)的记录的pH。这些值在下文的表3中反映。虽然标准化的射出物经历了初始的提高，但是避免了随后在染色期间的提高，并且也避免了在之后的降低。另外，表4呈现了在实施例1中所见的死亡精子降低的类似效果。具体地而言，在单步骤中染色的标准化的样品具有更低5.67％的死亡精子。

表3

初始离心之前离心之后染色期间染色之后细胞仪之前对照(A)6.346.346.257.227.076.59标准化的(B)6.347.126.857.186.986.98

表4

PV％定向的％死亡的分选速率双份/三份对照1.8652.9914.6335.8321.73标准化的-单步骤1.9757.228.9637.0024.59差值0.114.23-5.671.172.86

实施例3

收集-根据常规的收集方案从三头不同的娟姗公牛和三头不同的荷斯坦公牛收集精子，总共17次收集。分开每份射出物用于两种处理。

精子处理和染色-为了对比，每份公牛射出物的部分通过两种方法来处理和染色。

对照(没有标准化，双步骤染色)-建立对照，其不包括使收集的射出物标准化的步骤，并且其中精子在两个步骤中染色。对照组中的精子在如表1描述的修改的TALP缓冲液中在pH为7.4下稀释到160×10⁶个精子/ml。对照组中的每份精子样品然后在34℃下与16-17μLHoechst33342/ml(64-68μM)的样品温育45分钟。温育之后，添加等体积的第二修改的TALP，降低浓度到80×10⁶个精子/ml。第二修改的TALP包括表1中描述的成分，并且添加有4％蛋黄、50μM红色食用染料No.40(20g/L)，通过添加HCl将pH值降低至5.5。

标准化的III和单步骤(用3％蛋黄稀释液标准化，单步骤染色)-其余精子在染色和分选之前通过调节pH值和精子浓度来标准化。在收集之后，精子在具有7.2的pH值和高缓冲pH能力的初始稀释液中1∶3稀释。高容量缓冲液补充有3％蛋黄。然后精子样品在修改的TALP缓冲液中在pH值7.4下稀释到160×10⁶个精子/ml。修改的TALP缓冲液基本上相同于表1中描述的缓冲液，不同之处在于它另外包括1％蛋黄和浓度25μM的黄色食用染料No.6。该组中的每份精子样品然后在34℃与14-15μLHoechst33342/ml(56-60μM)温育45分钟。在温育之后，精子维持在160×10⁶个精子/ml的浓度。

分选和结果-对照组以80×10⁶个精子/ml的浓度通过具有Genesis数码升级(Cytonome/ST，BostonMA，USA)的LegacySX流式细胞仪(BeckmanCoulter，MaimiFL，US)，而标准化的III和单步骤在160×10⁶个精子/ml的浓度下分选。表5呈现了在每份射出物的死亡门中细胞的百分比和平均值。在分选之后，对两种样品标明了死亡门(图3中所见的R2)中出现的精子的百分比。可以看出，在对照中17头公牛平均有17％的精子被门选为死亡的，而对处理的精子，仅10％的精子被门选为死亡，意味着处理对精子健康提供了显著的益处。

表5

实施例4

收集和分选-从荷斯坦公牛收集精子，并根据如实施例1和3中描述的标准化的III和单步骤方案染色。样品置于带有Genesis数码升级(Cytonome/ST，BostonMA，USA)的LegacySX流式细胞仪(BeckmanCoulter，MaimiFL，USA)上。在分选期间，鞘液压力建立为40psi，液滴驱动频率设置为64.9KHz。样品压力调节到约1500、3500、7500、8500、10,000、15000、20000、25000和30000的目标事件速率。

结果-来自每种目标事件速率的测量的分选参数记录在表6中。这个实施例中的射出物展现了约3％-5％的死亡门，其允许大部分精子被包括在活的定向的门中，为79.1％～85.4％之间。这一分选中使用的分选逻辑对精子的活的定向的区域(R1)门选开放。由操作员建立R1来保持大部分的精子。以90％纯度为目标，由操作员类似地建立X-分选门。在每种事件速率下，对几份样品周期性地数字收集数据。在每一事件速率下的数据进行平均，来提供生产力(分选速率)、分选效率(分选速率/事件速率)、谷峰比、抛弃速率、以及死亡门(R2)中的群体百分比，活的定向门(R1)中的群体百分比，X-分选门(R3)中精子群体的百分比，以及X-分选门中活力(活的)精子的百分比的平均值。另外，对在每种事件速率设置下分选的每种精子离线测定纯度。通过对尾部的100万精子进行超声来测定纯度，在每组事件速率下收集纯度，在离线纯度分析仪中测量。对每组进行这种测量两次并进行平均。

表6

可以看出，低的事件速率降低了抛弃速率并改善了分选效率。特别地，当事件速率是1722时，抛弃速率是分选速率的7％。

另外，降低死亡精子的协同作用通过以下事实来说明：对于小于10,000个事件每秒的事件速率，超过50％的精子样品被门选入X-分选门。低百分比的死亡精子与高百分比的活的定向精子的组合容许调节R3区域的门选，使得R3侵入图4中精子具有更大概率是带Y-染色体的精子而不是带X-染色体的精子的区域。即使在稍微地侵入这一区域时，在分选后检查的纯度保持了96％，即使所有精子的54％被包括入X-分选门以及所有的活精子中的57％被包括入X-分选门。

可以看出改善染色技术与关注效率的分选方法的协同组合提供了可靠的精子分选方法，该方法可以提供总精子群体的25％～约40％的产率，维持了大于90％的纯度。

本公开内容的一个方面提出了更有空间效率的流式细胞仪，它可以容许在可用空间中更多的分选头。在这种布置下，更多的流式细胞仪分选头可以用于单一精子样品，每一个可以在改进的效率下运行，从而组合了高效分选方法和高产量的益处。

实施例5

精子处理-从五头公牛收集精子样品，包括两头荷斯坦公牛、两头娟姗公牛和一头西门塔尔公牛。在收集时，检查体积、浓度、运动性、形态学和pH，然后根据产业实践添加抗生素。该实施例中使用的每头公牛呈现了处于了大于70％的运动性。然后通过置于有pH缓冲能力的稀释液中并离心再浓缩到170000万-180000万精子/ml，将精子样品标准化。根据早先实施例中描述的单步骤染色，每头公牛的3ml用具有Hochest33342和黄色淬灭食用染料的TALP染色，染色后的浓度是16000万精子/ml。

来自每头公牛的精子分成四种处理。两种处理在40psi下进行，两种处理在65psi下进行。在40和65psi的每一种中，一种处理被建立为高产量处理，一种处理被建立为高效率处理。

处理1-在第一处理中，分类仪鞘液压力设置为40psi。然后通过调节样品压力建立约35,000个事件每秒的事件速率。调节液滴驱动频率和其他液滴生成信号，直到建立标准测流而没有喷雾。然后进行液滴延迟校准以确定充电延迟。

处理2-在第二处理中，分选仪维持在40psi的压力，利用样品压力调整将事件速率降至约20,000个事件每秒。然后在流式细胞仪上重新调整门选。

处理3-在第三处理中，鞘液压力设置在65psi，利用样品压力建立约35,000个事件每秒的事件速率。调节液滴驱动频率和其他液滴生成信号，直到建立标准测流而没有喷雾。然后进行液滴延迟校准以确定充电延迟。

处理4-在第四处理中，鞘液压力维持在65psi，利用调节样品压力建立约20,000个事件每秒的事件速率。然后在流式细胞仪上重新调整门选。

精子分选和冷冻-在描述的每一标准下分选来自五头公牛的每一头的精子。在每个分选期间，从流式细胞仪记录数据，见表7。在捕获管中收集了总共1000万带X-染色体的精子，捕获管各自具有包括约20％蛋黄的稀释液的A部分。收集的精子冷却90分钟到约5℃。将包括12％甘油的稀释液的B部分添加到两个相等的部分中。在添加B部分之后，离心样品并重悬浮在具有约20％蛋黄和约6％甘油的等量的A部分和B部分稀释液中。对每头公牛和每种处理填充多个.25ml细管，然后在液氮中冷冻。

表7

抛弃速率X分选速率定向的％X门％PVR处理40psi2487449060.3836.7743.82处理40psi1188346063.0338.7952.42处理65psi2034601962.6539.2748.48处理65psi982436365.5741.4557.71

解冻后-对每一公牛和处理选择冷冻的细管以进行品质控制测试。在0小时和三小时后检查运动性。另外，通过用SybrGreen和碘化丙锭染色解冻精子的一部分进行流式细胞仪分析来测定生活力。通过用PI/PNA染色进行流式细胞仪来分析另一部分解冻精子的顶体健康状态。另外，对来自每个细管的精子进行超声，分析精子核的纯度。结果见表8。

表8

0小时运动性3小时运动性完整顶体有活力的纯度处理140psi7250764492处理240psi7148764694处理365psi6845734192处理465psi6547744392

结果-表7记录的数据说明了几个趋势，重要的趋势是分别与处理1和3比较，处理2和4的更慢的事件速率稍微地提高了X门中精子的百分比，中度地改善了峰谷比(PVR)和定向的门中精子的百分比。另外，分别与处理1和2相比，处理3和4的提高的压力单独地降低了抛弃速率，进一步改善了X门中精子的百分比。

实施例6

精子处理-从七头公牛收集精子样品，包括四头荷斯坦公牛和三头娟姗公牛。在收集时，检查体积、浓度、运动性、形态学和pH值，然后添加抗生素。该实施例中使用的每头公牛呈现了处于了大于60％的运动性。然后通过置于有pH缓冲能力的稀释液中并离心再浓缩到170000万-180000万精子/ml，将精子样品标准化。根据实施例1中列出的单步骤过程染色精子，在染色时不添加蛋黄。

分选仪校准-用设置为40psi的操作鞘液压力的、具有获自Cytonome/ST(Boston，MA，USA)的Genesis数码升级的LegacySX流式细胞仪产生第一数据集。液滴驱动频率设置为现有推荐范围内提供优质侧流的最高频率。然后通过显微镜载玻片上的测试分选确定液滴延迟。收集管的初始捕获液高度置于流式细胞仪的偏转板下4.5英寸，或是流式细胞仪中50ml捕获管的标准位置。

用在60psi的鞘液压力下运行的同样的LegacySX流式细胞仪产生第二数据集。液滴驱动频率设置为现有推荐范围内提供优质侧流的最高频率。然后通过显微镜载玻片上的测试分选确定液滴延迟。收集管的初始捕获液高度置于流式细胞仪的偏转板下方4.5英寸，或是流式细胞仪中50ml捕获管的标准位置。

按照与第二数据集相同的方式产生第三数据集，不同之处在于通过裁剪流式细胞仪坐落的工作架来将收集管下移1.25英寸。捕获液的初始高度是流式细胞仪的偏转板下方5.75英寸。

精子分选和冷冻-在描述的每一标准下分选来自七头公牛的每一头的精子。在捕获管中收集了总共1500万带X-染色体的精子，捕获管各自具有包括约20％蛋黄的稀释液的A部分。

收集的精子冷却90分钟到约5℃。将包含12％甘油的稀释液的B部分添加到两个相等的部分中。在添加B部分之后，将样品离心并重悬浮在具有约20％蛋黄和约6％甘油的等量的A部分和B部分稀释液中。对每头公牛和每种处理填充多个.25ml细管，然后在液氮中冷冻。

解冻后-之后对每一公牛和处理选择冷冻的细管进行品质控制测试。解冻细管，在0小时和三小时后检查细管。另外，在用Sybr/PI染色后通过流式细胞仪评估精子生活力。选择七头公牛的五头用于IVF。另外，对来自每个细管的精子进行超声，分析精子核的纯度。

结果-对在40psi下进行的所有分选和在60psi下进行的所有分选，编辑通过数据记录软件确定的平均测量分选参数。另外，在40psi下分选1500万带X染色体精子的平均时间是48：17，在60psi下分选1500万带X染色体精子的平均时间是34：23。

表9

事件速率抛弃速率分选X速率定向的死亡的X％PVR平均40psi36,5953034535059.609.5342.0342.06平均60psi40,8302822717560.329.6843.8246.39

就生产力以及表9中记录的平均测量分选参数而言，与40psi相比，可以容易地看出在60psi下分选的益处。对于生产力来说，平均7175次分选每秒容许更快13：54地分选1500万精子。进一步的，60psi提供了更高的事件速率、改善的精子定向以及带X染色体精子与带Y染色体精子之间的改善的区分。

七头公牛的每一份都进行冷冻，解冻每头公牛的细管，评估运动性、受损的精子膜(Sybr/PI)和纯度。选择七头公牛中的五头进行IVF，包括三头荷斯坦公牛和两头娟姗公牛。每种处理的卵细胞向胚胎的转化记录在表11中。

另外，特别是对于在60psi下的分选，改变捕获液的距离实现了益处。对于选择用于IVF实验的五头公牛的每种处理，表10说明了平均的解冻后运动性、生活力和纯度。

表10

0小时3小时生活力纯度40psi-4.5593831.669260psi-4.5563530.599460psi-5.75653932.6093

特别是对于在60psi下评估的五头公牛，与同一位置在40psi下的分选相比，标准的捕获液位置提供了稍微更低的解冻后运动性和稍微更低的生活力。然而，将捕获管额外下移1.25英寸(3.18cm)提供了60psi下0小时运动性的10％改善，以及3小时运动性的11％改善。对于IVF中使用的五头公牛，在60psi下分选并在第二捕获管位置下收集的精子展现了比40psi分选稍微更好的运动性和生活力。

表11

卵细胞胚胎卵细胞转变为胚胎的％40psi-4.5200420510.2360psi-4.520621869.0260psi-5.7520811949.32

实施例7

从五头公牛收集精子样品。在收集时，检查体积、浓度、运动性、形态学和pH值，然后添加抗生素。该实施例中使用的每头公牛呈现了60％以上的运动性。将精子样品然后分成两个组。

处理I-处理I中的精子样品按照基本上与上文描述相同的方式在双步骤中染色。具体而言，将处理I保持为净精液，在pH为7.4下在如表1描述的修改的TALP缓冲液中在160×10⁶个精子的第一稀释度下染色。然后，第二组中的每份精子样品与Hoechst33342温育。温育之后，添加等体积的第二修改的TALP，降低浓度到80×10⁶个精子/ml。第二修改的TALP包括表1中描述的成分，并且添加有红色食用染料No.40和4％蛋黄，通过添加HCl将pH值降低至5.5。

处理II-处理II中的精子样品然后在初始稀释液或缓冲保持稀释液中按照3到1的稀释度来标准化。缓冲液保持稀释液具有强的缓冲能力和约7.2的pH。另外，将抗氧化剂添加到初始稀释液中来降低精子的氧化胁迫。将稀释的悬浮液进行离心，再浓缩到160000万±40000万精子/ml之间。在具有BSA并补充有抗氧化剂成分的修改的TALP中，在160×10⁶浓度的单一稀释度中染色精子。

精子分选-使用获自Cytonome/ST(Boston，MA)的GenesisII流式细胞仪来分选两种染色的样品。取决于计划的纯度，在25,000～约40,000个事件每秒的事件速率下，在两种处理中分选X染色体(雌性)的精子。

根据处理I制备的精子被分选到具有20％蛋黄的TRIS柠檬酸盐稀释液的捕获液(有时称为TRISA)中。

来自处理II的精子分选到具有20％蛋黄、并添加有抗氧化剂处理的TRIS柠檬酸盐稀释液的捕获液中。

分选后/冷冻-收集来自处理I的精子，冷却90℃到约5℃。将包括12％甘油的稀释液的TrisB部分添加到两个相等的部分中。在添加B部分之后，将离心样品并重悬浮在具有约20％蛋黄和约6％甘油的等量的A部分和B部分稀释液中。对每头公牛和每种处理以约210万精子的剂量填充多个0.25ml细管，然后在液氮中冷冻。

收集来自处理II的精子，冷却90℃到约5℃。将包括12％甘油的稀释液的TrisB部分和降低氧化胁迫的抗氧化剂的组合添加到两个相等的部分中。在添加B部分之后，将样品离心并重悬浮在具有约20％蛋黄和约6％甘油以及约25mg/μl抗氧化剂的等量的A部分和B部分稀释液中。来自处理II的精子分成三个组。第一组以210万精子每细管的剂量填充到0.25ml细管中，第二种以300万精子每细管的剂量填充到0.25ml细管中，第三组以400万精子每细管的剂量填充到0.25ml细管中，然后在液氮中冷冻。

除了按常规剂量(1500万精子每细管)的未分选精液的对照之外，用每种处理和剂量进行授精。

结果-流式细胞仪精子分选的有害作用首次得到足够的补偿，从而可以看到性别分选的精子的剂量响应效果。此外，性别分选的精子的配剂首次显示了与常规未分选精子一样好的性能。在表12中，比较了每种处理和剂量的56天不发情率(non-returnrate)(NRR)。另外，按照相对常规授精的百分比，比较了相对受精力。

表12

处理授精的数量56天NRR(％)相对授精力处理I195355.9^A84％处理II-210万199959.9^B90％处理II-300万201360.0^B90％处理II-400万189066.7^C100％常规-1500万62,39866.5^C-

数据来自奶牛和初产母牛。带有不同上标的NRR结果是差异显著的，P＜0.05。

现在已经建立了一种精子分选方法，其提供了能够展现剂量响应的性别精子，预期的是，进一步的剂量提高可以开始超过常规精液受精力。虽然性别分选是对精子有害的过程，分选步骤从被分选的精子样品中主动地除去了死亡的或膜受损的精子细胞。可能的是在改进的分选方法中，精子分选过程的那些有害的步骤不可恢复地损害了较低可能对卵受精的那些精子细胞，从而从授精样品中除去了最低生育力的精子。因而，一旦总体过程的损伤被降低到足以提供剂量响应，通过从分选的群体中除去最低生育力的精子，精子剂量的进一步提高开始超过常规的未分选精液。

本领域技术人员将认识到，上文描述的本发明包括许多发明性的方面，它们可以以任何组合来提供，至少包括以下的：

A1.一种生产具有改善的剂量响应的性别分选的精子的方法，所述方法包括：a)用缓冲保持介质稀释精子样品；b)调节所述经稀释的精子样品的浓度到目标浓度范围；c)用DNA选择性染料染色所述精子样品；d)用流式细胞仪将经染色的精子样品性别分选到捕获液中；e)将步骤a)到c)的精子样品的pH值维持在目标pH值范围；以及f)向所述缓冲保持介质、所述DNA选择性染料和所述捕获液的至少一种补充至少一种抗氧化剂。

A2.如权利要求A1所述的方法，其中用缓冲保持介质稀释精子样品和调节稀释的精子样品的浓度到目标浓度范围的步骤进一步包括：a)在7.0～7.4的目标pH下在所述缓冲保持介质中稀释精子样品；和b)将经稀释的精子样品浓缩到约800×10⁶个精子/ml～约2100×10⁶个精子/ml的目标浓度。

A3.如权利要求A1或A2所述的方法，所述方法进一步包括从步骤a)～c)维持精子样品对抗氧化剂的暴露。

A4.如任一项前述权利要求所述的方法，其中通过步骤a)～e)分选的至少400万性别分选的精子的剂量具有与1500万常规未分性精子至少相同的受精力。

A5.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述缓冲保持介质包含选自下组的一种或更多种：碳酸氢钠、TRIS柠檬酸盐、柠檬酸钠、HEPES、TRIS、TEST、MOPS、KMT、TALP和其组合。

A6.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述缓冲保持介质进一步包含蛋黄。

A7.如权利要求A6所述的方法，其中所述缓冲保持介质进一步包含约1％～10％的蛋黄。

A8.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述缓冲保持介质进一步包含柠檬酸或柠檬酸盐。

A9.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述缓冲保持介质进一步包含一种或更多种抗氧化剂。

A10.如任一项前述权利要求所述的方法，其中从步骤a)～e)稳定所述精子样品的pH。

A11.如权利要求A10所述的方法，其中从步骤a)～e)所述精子样品的pH值维持在目标pH的0.5之内。

A12.如权利要求A10所述的方法，其中从步骤a)～e)所述精子样品的pH维持在约6.65～约7.35之间。

A13.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述抗氧化剂选自以下构成的组：过氧化氢酶、过氧化物歧化酶(SOD)、SOD模拟物、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙酮酸盐、巯基乙醇、BHT、硫辛酸、黄素类、奎宁类、维生素K(和相关的类维生素)、维生素B12、维生素B12类维生素、维生素E(和相关的类维生素)、生育酚、生育三醇、α-生育酚、α酮戊二酸(AKG)、丙二醛(MDA)、不对称二甲基精氨酸(ADMA)和它们的生物学活性衍生物，以及其组合。

A14.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述抗氧化剂选择包含以下的组：维生素B12、维生素B12类维生素、维生素E、维生素E类维生素、生育酚、生育三醇、α-生育酚、α酮戊二酸、它们的衍生物，以及其组合。

A15.如任一项前述权利要求所述的方法，其中抗氧化剂以约0.01～约5.0mg/ml的浓度存在。

A16.如权利要求A1-A14所述的任一项的方法，其中抗氧化剂以选自以下的组的浓度存在：0.01～5.0mg/ml、0.01～0.25mg/ml、0.01～0.5mg/ml、0.01～1mg/ml、0.01～2.5mg/ml、0.01～5mg/ml、0.05～0.1mg/ml、0.05～1.0mg/ml、0.05～2.5mg/ml、0.1～0.25mg/ml、0.1～0.5mg/ml、0.1～1mg/ml、0.1～2.5mg/ml、0.1～5mg/ml、0.15～0.45mg/ml、0.15～0.5mg/ml、0.25～0.35mg/ml、0.25～0.5mg/ml、0.25～1mg/ml、0.25～2.5mg/ml、0.25～5mg/ml、0.35～0.5mg/ml、0.35～1mg/ml、0.35～2.5mg/ml、0.35～5mg/ml、0.5～1mg/ml、0.5～2.5mg/ml、0.5～5mg/ml、1～2.5mg/ml和1～5mg/ml。

A17.如权利要求A1-A14所述的任一项的方法，其中抗氧化剂的浓度选自以下的组：约0.05mg/ml、约0.1mg/ml、约0.15mg/ml、约0.25mg/ml、约0.35mg/ml、约0.45mg/ml和约0.5mg/ml。

A18.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述目标浓度包括约800×10⁶个精子/ml～约2100×10⁶个精子/ml的浓度。

A19.如任一项前述权利要求所述的方法，其中在单次稀释(singledilution)中用DNA选择性染料和死亡淬灭染料进行染色步骤。

A20.如任一项前述权利要求所述的方法，进一步包括将分选的精子样品冷冻的步骤。

A21.如权利要求A20所述的方法，其中将一种或更多种抗氧化剂添加到其中将分选的精子样品冷冻的介质中。

A22.如权利要求A21所述的方法，其中一种或更多种抗氧化剂以选自以下的组的浓度存在：0.01～5.0mg/ml、0.01～0.25mg/ml、0.01～0.5mg/ml、0.01～1mg/ml、0.01～2.5mg/ml、0.01～5mg/ml、0.05～0.1mg/ml、0.05～1.0mg/ml、0.05～2.5mg/ml、0.1～0.25mg/ml、0.1～0.5mg/ml、0.1～1mg/ml、0.1～2.5mg/ml、0.1～5mg/ml、0.15～0.45mg/ml、0.15～0.5mg/ml、0.25～0.35mg/ml、0.25～0.5mg/ml、0.25～1mg/ml、0.25～2.5mg/ml、0.25～5mg/ml、0.35～0.5mg/ml、0.35～1mg/ml、0.35～2.5mg/ml、0.35～5mg/ml、0.5～1mg/ml、0.5～2.5mg/ml、0.5～5mg/ml、1～2.5mg/ml、和1～5mg/ml。

A23.如权利要求A21所述的方法，其中抗氧化剂的浓度选自以下的组：约0.05mg/ml、约0.1mg/ml、约0.15mg/ml、约0.25mg/ml、约0.35mg/ml、约0.45mg/ml和约0.5mg/ml。

A24.如任一项前述权利要求所述的方法，其中用缓冲保持介质稀释精子样品的步骤进一步包括以约1∶1、约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9或约1∶10的比例在缓冲介质中稀释精子样品。

B1.一种通过权利要求1所述的方法生产的性别分选的授精配剂，其在大于300万的剂量下具有剂量响应。

B2.一种性别分选的授精配剂，其包含：能够在人工授精中受精的、与1500万精子的常规剂量至少处在相同的受精力水平的至少400万经染色的和性别分选的精子的群体。

B3.一种性别分选的授精配剂，其包含：能够实现常规的1500万精子剂量的90％受精力的、至少300万经染色的和性别分选的精子。

B4.如权利要求B1-B3中任一项所述的性别分选的授精配剂，其中所述性别分选的精子包含通过流式细胞仪对X-染色体进行了分选的精子。

B5.如权利要求B1-B3中任一项所述的性别分选的授精配剂，其中所述性别分选的精子包含通过流式细胞仪对Y-染色体进行了分选的精子。

B6.如权利要求B1-B5中任一项所述的性别分选的授精配剂，其进一步包含来自其中对精子样品进行处理的缓冲保持介质的第一残余量的抗氧化剂。

B7.如权利要求B1-B6中任一项所述的性别分选的授精配剂，其进一步包含来自其中对精子样品进行处理的染色剂的第二残余量的抗氧化剂。

B8.如权利要求B1-B7中任一项所述的性别分选的授精配剂，其进一步包含来自其中对精子进行处理的捕获液的第三残余量的抗氧化剂。

B9.如权利要求B1-B8中任一项所述的性别分选的授精配剂，其中所述精子配剂包含具有与常规精液的1500万精子剂量相当的受精力特征的约400万～约2000万的分选的精子。.

B10.如权利要求B1-B9中任一项所述的性别分选的授精配剂，其中所述性别分选的精子配剂包含选自以下的范围之一的精子：约300万精子～约400万精子之间、约400万精子～约500万精子之间、约500万精子～约600万精子之间、约600万精子～约700万精子之间、约700万精子～约800万精子之间、约800万精子～约900万精子之间、约900万精子～约1000万精子之间、约1000万精子～约1100万精子之间、约1100万精子～约1200万精子之间、约1200万精子～约1300万精子之间、约1300万精子～约1400万精子之间、约1400万精子～约1500万精子之间、约1500万精子～约1600万精子之间、约1600万精子～约1700万精子之间、约1700万精子～约1800万精子之间、约1800万精子～约1900万精子之间、以及约1900万精子～约2000万精子.

B11.如权利要求B1-B10中任一项所述的性别分选的授精配剂，其中所述精子包含冷冻的精子。

B12.如权利要求B1-B11中任一项所述的性别分选的授精配剂，其中所述授精配剂包含冷冻稀释液，其中所述冷冻稀释液进一步包含以0.01mg/ml～0.5mg/ml的浓度存在的抗氧化剂。

从上文可以容易理解的是，本发明的基本概念可以以各种方式来概括。本发明涉及性别分选精子的许多和各种实施方式，包括但不限于本发明的最佳方式。

因而，说明书所公开的以及本申请附随的附图或表格中显示的本发明的特定实施方式或元素不是限制性的，而是本发明一般性涵盖的许多和各种实施方式的非限制性实例，或对于其任何特定元素所涵盖的等价物。此外，本发明的单个实施方式或元素的具体描述可能没有明确地描述所有可能的实施方式或元素；许多可选择性由说明书和附图隐含地公开。

此外，对于所使用的每个术语，要理解的是，除非它在本申请中的使用与这样的解释不一致，通常的词典定义应当被理解为被包括在RandomHouseWebster′sUnabridgedDictionary第二版中含有的每个术语的描述中，通过引用将每一项定义合并在本文中。

此外，对于本发明来说，术语“一个(a或an)”实体是指一个或更多个这样的实体。因而，术语“一个”、“一个或更多个”和“至少一个”在本文中可互换地使用。

无论是否明确地标明，本文的所有数字值被假定为由术语“约”修饰。对本发明来说，范围可以被表示为从“约”一个特定值～“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，其他的实施方式包括从一个特定值～另一个特定值。通过端点对数值范围的叙述包括该范围内包含的所有数字值。例如，一～五的数值范围包括数值1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5，等等。要进一步理解的是，每个范围的端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都是重要的。当使用在先的词“约”来表示一个值的近似值时，要理解的是该特定的值形成了另一个实施方式。

本专利申请的背景部分提供了本发明所属领域的记载。这一节还可以合并或含有某些美国专利、专利申请、出版物或请求保护的发明的主题，它们是在与本发明所针对的技术状况相关的信息、问题或关注方面有用的。本文引证或合并的任何美国专利、专利申请、出版物、记载内容或其他信息不应被理解为、解释为或视为是本发明的现有技术。

如果有的话，本说明书中列出的权利要求作为本发明的描述的一部分通过引用合并在此，申请人明确地保留权利，来使用这些权利要求的这种合并内容的所有或一部分作为额外的描述，以支持任一或所有的权利要求或其任何元素或成分，申请人进一步明确地保留权利，来根据需要将这些权利要求或其任何元素或成分的合并内容的任何部分或所有从说明书中移入权利要求，或反之，以限定本申请、或其任何后续申请或延续申请、分案、或部分延续申请所要求保护的主题，或用以获得任何国家或条约的专利法、细则或规程的任何利益、费用减低或与之相符，通过引用合并的这些内容应当在本申请的整个未决期期间，包括任何其随后的延续、分案或部分延续申请，或在此之上的重新授权或扩展期间存续。