Ming氏人膨胀型胃癌细胞系及其应用

摘要

Ming氏人膨胀型胃癌细胞系及其应用，涉及微生物动物细胞系。所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞系为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3，保藏中心登记入册编号：CGMCC？No.10886。Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3可作为研究Ming氏膨胀型胃癌发生、发展或转移的细胞模型。Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3裸鼠接种后无成瘤特性，可与其他有成瘤特性的膨胀型细胞系对比研究胃癌转移及发展机制。所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3可以作为从Ming氏分型角度去研究胃癌的分化机制、细胞形态及功能异常、肿瘤浸润转移机制及指导临床综合诊治等的细胞模型。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物动物细胞系，尤其是涉及一株Ming氏人膨胀型胃癌细胞系及其应用。

背景技术

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，胃癌的发病率居所有恶性肿瘤第四位， 死亡率居第二位。在中国，胃癌是最常见的消化道肿瘤，占恶性肿瘤死亡率的第一位，全国 平均年死亡率为16/10万人口，高发地达60/l0万人口。虽然胃癌的诊断及治疗已经取得了长 足的进步，但近10年来其5年生存率并没有明显的提高，术后复发和转移是其死亡的重要原 因，居高不下的发病率和死亡率已经使胃癌的研究与治疗成为亟待解决的重大课题。目前的 资料表明，胃癌的发生、发展是一个多因素、多阶段的发展过程，其恶变过程包括了细胞增 生、DNA复制过度、细胞周期功能紊乱、细胞永生化、逃逸凋亡、血管新生(Angiogenesis) 及浸润转移等一系列的过程，地域环境及生活饮食、幽门螺杆菌感染(Helicobacterpylori， HP)、癌前病变以及遗传和基因等因素均与胃癌的发生、发展密切相关。分子生物学的研究 显示，胃癌的癌变涉及癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因与转移相关基因等的改变，而基因 改变的形式也是多种多样的，这些基因受一系列复杂机制调控，但是其确切的调控机制并不 完全明了。

1977年美国学者闵锡钧根据显微镜下胃癌生长方式的不同将其分为膨胀型和浸润型两型 (Ming氏分型)，并且指出二者的生物学行为和临床预后截然不同。该分类方法很好地反映 了胃癌的生物学行为，且与预后密切相关，受到国内外临床专家和学者们的公认。膨胀型胃 癌癌组织呈膨胀性生长，集聚成团块状，周围纤维结缔组织增生(Desmoplasia)，边界较为 清楚。浸润型胃癌癌组织呈浸润性生长，分散成条索状，不形成团块状，与周围组织无明显 的界限，多为低分化腺癌或印戒细胞癌。膨胀型术后5年存活率为27.4％,而浸润型仅为9.1％。 迄今为止，国内外对于这方面的研究鲜有报道，两型胃癌(Ming氏膨胀型和浸润型)的发病 机制和形成的分子基础更不清楚。

目前世界范围内报道的胃癌细胞系已经不少：中国的BGC-823、SGC-7901、MGC-803； 美国的AGS；日本的MKN-1、MKN-28、MKN-45、MKN-74、NMGC-3、NMGC-4；韩国的 SNU-1、SNU-5、SNU-16等。其中大部分来源于转移的淋巴结、腹水或晚期、低分化的肿瘤 组织，用这些细胞系做胃癌研究缺乏很好的代表性和科学性；另一方面很多细胞系应用至今 已经有几十年的时间，在长期、反复的传代培养过程中，细胞特性会发生很大变化，不同实 验室在用同种细胞的不同代次得到的数据相差会很大，结果缺乏可比性和重复性。基于以上 原因，胃癌原代细胞培养并建立细胞系在现阶段仍有很大的价值。

另有研究发现，虽然各个细胞系在体外保持了许多起源细胞的形态与功能特征，但是由 于周围环境的变化，这些细胞系与供体的起源细胞会存在程度不一的差异，这种差异在培养 开始就存在，只是程度相对较小，以后随着不断的传代培养及变异的发生，这种差异会越来 越大，甚至会产生起源细胞本不具备的特征。由于这些因素的存在，不同细胞系的建立工作 更显得意义重大。

迄今世界上关于胃癌的临床和基础研究已有很多的报道，但从Ming氏分型角度去研究 胃癌发生机制的报道却不多，本株细胞系不但为以后从Ming氏分型角度深入研究胃癌的发 病机制、生物学行为提供一个很好的模型，也为进一步开展胃癌分子生物学、免疫学及临床 综合诊治等研究提供有利条件。

中国专利CN101993854A公开一种来源于肝转移灶的大肠癌细胞系CJF及其构建方法， 所述细胞系由如下方法获得：取大肠癌肝转移灶的组织，用胶原酶/透明质酸酶消化成单细胞 后，MACS分选出CD133+细胞接种于NOD/SCID鼠皮下，成瘤后取出肿瘤组织，经体外培 养获得可稳定传代的富含大肠癌干细胞的大肠癌细胞系CJF。该发明CJF细胞是从结肠癌人 肝转移灶取材的，对大肠癌肝转移的研究有其他大肠癌细胞系无法比拟的优点；该发明CJF 细胞稳定表达CD133+的细胞亚群约为10％，这株细胞系在大肠癌肝转移过程及肿瘤干细胞 在转移机制中的作用研究具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一株Ming氏人膨胀型胃癌细胞系及其应用。

本发明所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞系为Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3，已于 2015年06月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号： CGMCCNo.10886。

Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3可作为研究Ming氏膨胀型胃癌发生、发展或转移的 细胞模型。

Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3裸鼠接种后无成瘤特性，可与其他有成瘤特性的膨胀 型细胞系对比研究胃癌转移及发展机制。

本发明采用取自一老年男性胃癌手术切除标本，经混合蛋白酶消化后作原代培养，经细 胞培养技术建立了一个Ming氏人膨胀型胃癌细胞系。

所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3具有以下生物学特性：

1、细胞贴壁生长，无接触抑制，可出现叠加生长现象。

2、细胞倍增时间接近48h。

3、染色体分析提示：本株细胞为稳定的亚三倍体细胞系，有较多的染色体缺失、异位及 衍生现象。

4、裸鼠接种本细胞后不成瘤。

本发明所述Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3可以作为从Ming氏分型角度去研究胃 癌的分化机制、细胞形态及功能异常、肿瘤浸润转移机制及指导临床综合诊治等的细胞模型。

附图说明

图1为XGC-3细胞来源肿瘤组织的病理结果。

图2为XGC-3细胞在显微镜下的形态学观察图。

图3为XGC-3细胞的生长曲线。

图4为XGC-3细胞染色体分析结果。

图5为XGC-3细胞免疫缺陷小鼠体内成瘤性实验结果。

具体实施方式

以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3的建立及鉴定。

一、Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3的建立

采集胃癌患者手术切除肿瘤组织，经混合酶消化后作原代培养，进而成功建立一株能够 连续传代的胃癌细胞系，目前传至51代，细胞性状保持稳定。该患者病理结果为胃体部中分 化管状腺癌(图1)。

二、Ming氏人膨胀型胃癌细胞株XGC-3的生物学特性检测

1、细胞形态学：细胞生长稳定并传化后，对培养细胞进行活细胞观察。结果显示：相差 显微镜下见细胞呈上皮样细胞排列，细胞贴壁生长，有重叠生长现象(图2)。

2、细胞生长曲线测定：取处于对数生长期的第20代细胞制成1×10⁵/ml的单细胞悬液， 然后按照100μl/孔接种于96孔板，设置3个复孔。24h后开始加药测定490nm波长时的OD 值，每天换液，共测9天。实验结束后绘制生长曲线，按公式Td＝t×lg2/lg(N1/N0)计算倍增 时间。结果显示：本株细胞贴壁后第1天生长缓慢，第2天开始呈指数生长，在每天更换培 养基营养充足的条件下细胞可出现叠加生长，无接触抑制现象；细胞倍增时间约48h(图3)。

3、染色体分析：取对数生长期的第35代细胞作核型分析。细胞经秋水仙素作用2h，经 0.075mol/LKCl低渗，甲醇－冰醋酸固定处理，冰湿片滴片，室温老化后用胰酶处理，Giemsa 染色显带分析。结果显示：本细胞系为稳定的亚三倍体细胞系。细胞染色体缺失、异位及衍 生染色体等现象很常见，具有恶性肿瘤细胞的特征(图4)。

4、免疫缺陷小鼠体内成瘤实验：取4周龄BALB/C雌性小鼠3只，右前肢皮下分别注射 2×10⁷个/100μl细胞，连续观察1月后颈椎脱臼法处死裸鼠，未发现移植瘤生长(图5)。