公开/公告号CN105441505A
专利类型发明专利
公开/公告日2016-03-30
原文格式PDF
申请/专利权人 宁夏泰瑞制药股份有限公司;
申请/专利号CN201511016316.0
发明设计人 李小萍;
申请日2015-12-29
分类号C12P17/18;C12N1/20;C12R1/465;
代理机构宁夏专利服务中心;
代理人徐淑芬
地址 750101 宁夏回族自治区银川市永宁县望远开发区
入库时间 2023-12-18 15:12:07
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-07-14
专利权的转移 IPC(主分类):C12N 1/20 专利号:ZL2015110163160 登记生效日:20230704 变更事项:专利权人 变更前权利人:宁夏泰瑞制药股份有限公司 变更后权利人:黑龙江联顺生物科技有限公司 变更事项:地址 变更前权利人:750101 宁夏回族自治区银川市永宁县望远开发区 变更后权利人:154600 黑龙江省七台河市茄子河区中心河乡新立村(江河融合绿色智能产业园区)
专利申请权、专利权的转移
2019-01-29
授权
授权
2016-04-27
实质审查的生效 IPC(主分类):C12P17/18 申请日:20151229
实质审查的生效
2016-03-30
公开
公开
技术领域
本发明属于发酵技术领域,特别是涉及一种头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的 新型培养基和培养方法。
背景技术
丝裂霉素(Mitomycin)是一种广谱抗肿瘤抗生素,自1956年Hata第一个从 头状链霉菌的培养液中分离到丝裂霉素开始,由于它特殊的抗肿瘤作用引起人们 广泛的关注。
目前,国内丝裂霉素的发酵生产采用二发酵模式,存在的主要问题有以下几 点:
1丝裂霉素发酵水平较低,一般控制在800u/ml左右。
2国内外针对丝裂霉素的生产工艺文献资料报道得较少。
3发酵生产丝裂霉素的培养基中加入葡萄糖,经高温灭菌,易导致部分葡萄 糖碳化,降低总糖含量,影响发酵液质量。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷,提供一种发酵工艺简单,有 效提高发酵单位,同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响,降低生产成本, 且原辅料来源不受环境影响,保证其供应充足,实现丝裂霉素稳定、高效生产的 头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产丝裂霉素的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为:
一种头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的培养基,包括种子培养基和发酵培养 基,其特征在于
所述种子培养基的组成为:甘露醇4~8g/L、甘蔗糖蜜8~12g/L、麦芽糖5~ 9g/L、麦芽糖酶0.02~0.06g/L、蚕蛹粉4~8g/L、玉米浆10~14ml/L、玉米蛋 白粉3~7g/L、硫酸铵3~7g/L、轻质碳酸钙1~5g/L;
所述发酵培养基组成为:甘露醇4~8g/L、甘蔗糖蜜11~15g/L、麦芽糖9~ 13g/L、麦芽糖酶0.04~0.08g/L、蚕蛹粉6~10g/L、玉米浆15~19ml/L、玉米 蛋白粉5~9g/L、硫酸铵4~8g/L、轻质碳酸钙3~7g/L、磷酸镁0.2~0.6g/L、 氯化钠0.3~0.7g/L、硫酸亚铁0.01~0.05g/L、聚醚改性硅油0.03~0.07ml/L、 维生素B60.05~0.09g/L、泛酸0.01~0.05g/L、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯 0.5~1g/L。
一种利用上述培养基生产丝裂霉素的培养方法,其特征在于所述工艺步骤 为:
1)种子培养:首先将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保 压,然后在火焰保护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.5~ 0.9L/m3的接种量接入该种子培养基中进行种子培养,至菌体浓度35~40%、pH 值6~7、培养时间40~50h时移种;
2)发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至20~25℃,并用无菌空气保压, 然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在9~11%, 至菌体浓度35~40%、还原糖<2.0g/L、氨基氮<15mg/100ml、化学效价> 1300u/mL、pH6.0~7.5、培养时间200~220h时终止发酵。
灭菌后的种子培养基的质量要求:氨基氮40~60mg/100ml、还原糖50~ 70g/L、pH:6.5~7.5;
灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮70~80mg/100ml、还原糖70~ 90g/L、pH:6~7。
所述培养好的母瓶发酵液质量要求为:pH6~8;菌体浓度10~20%;镜检无 杂菌;摇瓶发酵单位800~1000u/ml。
所述种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~ 10h,采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:30~50m3/h;搅拌转速70~ 80r/min。
所述发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培 养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃;
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~ 170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:150~200m3/h;61~170h:250~300m3/h;171h~发 酵结束:100~150m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
在发酵过程中采用流加法进行补料,补料包括补蛋白胨、补水、补糖和pH 控制,其中
a补蛋白胨工艺控制:
发酵前60h不用进行补油,
发酵时间在61~170h,当氨基氮含量低于40mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨 基氮为40~60mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量,
发酵时间在171~200h,当氨基氮含量低于20mg/100ml,补入蛋白胨,控制 氨基氮含量为20~40mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量,
发酵时间在201h~发酵结束,当氨基氮含量低于10mg/100ml,补入蛋白胨, 控制氨基氮含量为10~15mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量;
b补水工艺控制:
发酵前60h不用进行补水,
发酵时间在61~120h,当菌体浓度高于45%,加入灭菌水,要求控制发酵液 菌体浓度在40~45%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度,
发酵时间在121~200h,当菌体浓度高于40%,加入灭菌水,要求控制发酵液 菌体浓度在35~40%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度,
发酵时间在201h~发酵结束,当菌体浓度高于35%,加入灭菌水,要求控制 发酵液菌体浓度在30~35%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度;
c补入麦芽糖控制:
发酵前60h,还原糖含量不进行控制,
发酵61h至120h:还原糖含量<50g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还 原糖的含量控制在50~55g/L,
发酵121h至200h:还原糖含量<30g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还 原糖的含量控制在30~35g/L,
发酵201h至发酵结束:还原糖含量<5g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液, 使还原糖的含量控制在5~10g/L。
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶,其浓度控制在0.001~0.003%。
本发明的技术优势体现在:
1本发明确认了种子培养基、发酵培养碳源、氮源和最佳配伍比例。
2本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述,确认了丝裂霉素 最佳的发酵工艺和控制参数。达到的技术效果为发酵单位在1300u/ml以上。
3采用麦芽糖代替葡萄糖,经高温灭菌后,不影响培养基质量。
4本发明适用于企业规模化发酵生产丝裂霉素,能够满足年产100kg丝裂霉 素生产需求。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明,应该理解的是,实例是用于说明本发明而不是 对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用头状链霉菌:母瓶发酵液质量要求为:pH6~8;菌体 浓度10~20%;镜检无杂菌;摇瓶发酵单位800~1000u/ml。
实施例1
种子培养:种子罐有效体积为1m3。
种子培养基的组成为:甘露醇4kg、甘蔗糖蜜8kg、麦芽糖5kg、麦芽糖酶 0.02kg、蚕蛹粉4kg、玉米浆10L、玉米蛋白粉3kg、硫酸铵3kg、轻质碳酸钙 1kg。灭菌后的种子培养基的质量:氨基氮42/100ml、还原糖51g/L、pH:7.4。
将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保 护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.5L/m3的接种量接入该种子 培养基中进行种子培养。
种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h, 采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:30m3/h;搅拌转速70r/min。至菌体浓 度35%、pH6.8、培养时间40h时移种。
发酵培养:发酵罐有效体积为10m3。
发酵培养基组成为:甘露醇40kg、甘蔗糖蜜110kg、麦芽糖90kg、麦芽糖 酶0.4kg、蚕蛹粉60kg、玉米浆150L、玉米蛋白粉50kg、硫酸铵40kg、轻质碳 酸钙30kg、磷酸镁2kg、氯化钠3kg、硫酸亚铁0.1kg、聚醚改性硅油0.3L、维 生素B60.5kg、泛酸0.1kg、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯5kg。先将发酵培养 基灭菌,灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮70mg/100ml、还原糖71g/L、pH: 6.9。发酵培养基冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液 移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在9%。
发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培 养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃。
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~ 170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:150m3/h;61~170h:250m3/h;171h~发酵结束:100m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵培养结束,菌体浓度35%、还原糖1.8g/L、氨基氮14mg/100ml、化学 效价1304u/mL、pH6.1、培养时间200h。
实施例2
种子培养:种子罐有效体积为1m3。
种子培养基的组成为:甘露醇5kg、甘蔗糖蜜9kg、麦芽糖6kg、麦芽糖酶 0.03kg、蚕蛹粉5kg、玉米浆11L、玉米蛋白粉4kg、硫酸铵4kg、轻质碳酸钙 2kg。灭菌后的种子培养基的质量:氨基氮45/100ml、还原糖56g/L、pH:7.2;
将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保 护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.6L/m3的接种量接入该种子 培养基中进行种子培养。
种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h, 采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:35m3/h;搅拌转速72r/min。至菌体浓 度36%、pH6.7、培养时间42h时移种。
发酵培养:发酵罐有效体积为10m3。
发酵培养基组成为:甘露醇50kg、甘蔗糖蜜120kg、麦芽糖100kg、麦芽糖 酶0.5kg、蚕蛹粉70kg、玉米浆160L、玉米蛋白粉60kg、硫酸铵50kg、轻质碳 酸钙40kg、磷酸镁3kg、氯化钠4kg、硫酸亚铁0.2kg、聚醚改性硅油0.4L、维 生素B60.6kg、泛酸0.2kg、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯6kg。先将发酵培养 基灭菌,灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮73mg/100ml、还原糖76g/L、pH: 6.7。发酵培养基冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液 移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在9.5%。
发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培 养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃。
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~ 170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:160m3/h;61~170h:260m3/h;171h~发酵结束:110m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵培养结束,菌体浓度36%、还原糖1.7g/L、氨基氮13mg/100ml、化学 效价1326u/mL、pH6.3、培养时间205h。
实施例3
种子培养:种子罐有效体积为1m3。
种子培养基的组成为:甘露醇6kg、甘蔗糖蜜10kg、麦芽糖7kg、麦芽糖酶 0.04kg、蚕蛹粉6kg、玉米浆12L、玉米蛋白粉5kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙 3kg。灭菌后的种子培养基的质量:氨基氮51/100ml、还原糖61g/L、pH:7.0;
将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保 护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.7L/m3的接种量接入该种子 培养基中进行种子培养。
种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h, 采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:40m3/h;搅拌转速75r/min。至菌体浓 度37%、pH6.5、培养时间45h时移种。
发酵培养:发酵罐有效体积为10m3。
发酵培养基组成为:甘露醇60kg、甘蔗糖蜜130kg、麦芽糖110kg、麦芽糖 酶0.6kg、蚕蛹粉80kg、玉米浆170L、玉米蛋白粉70kg、硫酸铵60kg、轻质碳 酸钙50kg、磷酸镁4kg、氯化钠5kg、硫酸亚铁0.3kg、聚醚改性硅油0.5L、维 生素B60.7kg、泛酸0.3kg、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯7kg。先将发酵培养 基灭菌,灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮75mg/100ml、还原糖82g/L、pH: 6.5。发酵培养基冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液 移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在10%。
发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培 养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃。
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~ 170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:170m3/h;61~170h:270m3/h;171h~发酵结束:120m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵培养结束,菌体浓度37%、还原糖1.5g/L、氨基氮11mg/100ml、化学 效价1412u/mL、pH6.5、培养时间210h。
实施例4
种子培养:种子罐有效体积为1m3。
种子培养基的组成为:甘露醇7kg、甘蔗糖蜜11kg、麦芽糖8kg、麦芽糖酶 0.05kg、蚕蛹粉7kg、玉米浆13L、玉米蛋白粉6kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙 4kg。灭菌后的种子培养基的质量:氨基氮54/100ml、还原糖66g/L、pH:6.7;
将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保 护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.8L/m3的接种量接入该种子 培养基中进行种子培养。
种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h, 采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:45m3/h;搅拌转速78r/min。至菌体浓 度38%、pH6.3、培养时间47h时移种。
发酵培养:发酵罐有效体积为10m3。
发酵培养基组成为:甘露醇70kg、甘蔗糖蜜140kg、麦芽糖120kg、麦芽糖 酶0.7kg、蚕蛹粉90kg、玉米浆180L、玉米蛋白粉80kg、硫酸铵70kg、轻质碳 酸钙60kg、磷酸镁5kg、氯化钠6kg、硫酸亚铁0.4kg、聚醚改性硅油0.6L、维 生素B60.8kg、泛酸0.4kg、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯8kg。先将发酵培养 基灭菌,灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮78mg/100ml、还原糖86g/L、pH: 6.2。发酵培养基冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液 移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在10.5%。
发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培 养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃。
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~ 170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:180m3/h;61~170h:280m3/h;171h~发酵结束:130m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵培养结束,菌体浓度39%、还原糖1.4g/L、氨基氮10mg/100ml、化学 效价1384u/mL、pH6.3、培养时间215h。
实施例5
种子培养:种子罐有效体积为1m3。
种子培养基的组成为:甘露醇8kg、甘蔗糖蜜12kg、麦芽糖9kg、麦芽糖酶 0.06kg、蚕蛹粉8kg、玉米浆14L、玉米蛋白粉7kg、硫酸铵7kg、轻质碳酸钙 5kg。灭菌后的种子培养基的质量:氨基氮59mg/100ml、还原糖70g/L、pH:6.5。
将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保 护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.9L/m3的接种量接入该种子 培养基中进行种子培养。
种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h, 采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:50m3/h;搅拌转速80r/min。至菌体浓 度40%、pH6.1、培养时间50h时移种。
发酵培养:发酵罐有效体积为10m3。
发酵培养基组成为:甘露醇80kg、甘蔗糖蜜150kg、麦芽糖130kg、麦芽糖 酶0.8kg、蚕蛹粉100kg、玉米浆190L、玉米蛋白粉90kg、硫酸铵80kg、轻质 碳酸钙70kg、磷酸镁6kg、氯化钠7kg、硫酸亚铁0.5kg、聚醚改性硅油0.7L、 维生素B60.9kg、泛酸0.5kg、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯9kg。先将发酵培 养基灭菌,灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮80mg/100ml、还原糖90g/L、pH: 6.0。发酵培养基冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液 移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在11%。
发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培 养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃。
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~ 170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:200m3/h;61~170h:300m3/h;171h~发酵结束:150m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵培养结束,菌体浓度40%、还原糖1.3g/L、氨基氮8mg/100ml、化学效 价1317u/mL、pH6.0、培养时间220h。
在上述实施例1-5中,在发酵过程中需要进行补料。补料采用流加法,补料 包括补蛋白胨、补水和补麦芽糖,其中
a补蛋白胨工艺控制:
发酵前60h不用进行补油,
发酵时间在61~170h,当氨基氮含量低于40mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨 基氮为40~60mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量,
发酵时间在171~200h,当氨基氮含量低于20mg/100ml,补入蛋白胨,控制 氨基氮含量为20~40mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量,
发酵时间在201h~发酵结束,当氨基氮含量低于10mg/100ml,补入蛋白胨, 控制氨基氮含量为10~15mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量;
b补水工艺控制:
发酵前60h不用进行补水,
发酵时间在61~120h,当菌体浓度高于45%,加入灭菌水,要求控制发酵液 菌体浓度在40~45%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度,
发酵时间在121~200h,当菌体浓度高于40%,加入灭菌水,要求控制发酵液 菌体浓度在35~40%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度,
发酵时间在201h~发酵结束,当菌体浓度高于35%,加入灭菌水,要求控制 发酵液菌体浓度在30~35%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度;
c补入麦芽糖控制:
发酵前60h,还原糖含量不进行控制,
发酵61h至120h:还原糖含量<50g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还 原糖的含量控制在50~55g/L,
发酵121h至200h:还原糖含量<30g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还 原糖的含量控制在30~35g/L,
发酵201h至发酵结束:还原糖含量<5g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液, 使还原糖的含量控制在5~10g/L。
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶,其浓度控制在0.001~0.003%。
机译: 一种新型丝裂霉素抗生素及其发酵生产
机译: 由含有碳水化合物的培养基生产乙醇的方法,该培养基可通过运动发酵单胞菌的发酵而发酵,并由所述另一种生产
机译: 一种用于从盐藻中生产β-胡萝卜素和其他类胡萝卜素的新型培养基(ARL 5),以及一种用于使用该新型培养基生产胡萝卜素的盐藻菌株