分离自益智仁的新抗神经变性天然化合物及其全合成

摘要

本发明涉及分离或衍生自益智仁的新化合物、化学合成的新化合物，制备该新化合物的方法以及其作为用于治疗神经变性疾病如帕金森氏症的神经保护剂或药物的用途。

说明书

相关申请的交叉参考

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2013年3月14日提交的美国临 时申请第61/782,870号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及治疗神经变性疾病的新化合物。具体而言，本发明涉及 分离和合成的化合物，分离或制备化合物的方法，化合物用于治疗神经 变性疾病的用途。

发明背景

神经变性疾病涉及主要影响人脑中神经元的病症范围。帕金森氏症 (PD)是第二常见的神经变性疾病，生理表现包括震颤、运动迟缓、异常 姿势反射、僵硬和运动不能。它主要是由于多巴胺(DA)神经元在黑质中 的死亡而致。目前PD的治疗主要是通过更换神经递质或控制其代谢以恢 复其失衡来提供症状改善。由于这些疗法都不能改变潜在疾病过程，因 此该些疗法通常对疾病进展有很小的影响或没有影响。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供用于治疗神经变性疾病的新化合物、 制备该化合物的方法、其组合物及其用途。

因此，本发明在一个方面提供了式I的化合物:

其中R₁和R₃独立地选自下组：H、未取代或取代的烷基、环烷基、 烯基、炔基、芳基、杂芳基、羧基、烷氧基、羟基、氨基、硝基、烷硫 基、酰基、氰基、酰氨基、卤基和酯；R₂和R₄独立地选自下组：H、未 取代或取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、酰基、酰氨基和 卤基。

在示例性实施方案中，对于式I的化合物，R₁和R₃独立地为未取代 或取代的(C1-C3)烷基；R₂和R₄为H。

在另一个示例性实施方案中，式I的化合物是经分离和纯化的 ((R)-4-(2-羟基-5-甲基苯基)-5-甲基己酸)。化合物((R)-4-(2-羟基-5-甲基苯 基)-5-甲基己酸)表示为下式(化合物1)。

在另一个示例性实施方案中，式I的化合物是((S)-4-(2-羟基-5-甲基 苯基)-5-甲基己酸)或(4-(2-羟基-5-甲基苯基)-5-甲基己酸)。化合物 ((S)-4-(2-羟基-5-甲基苯基)-5-甲基己酸)(化合物4)和(4-(2-羟基-5-甲基苯 基)-5-甲基己酸)(化合物5)分别表示为下式。

在另一个方面，本发明提供了包含式I的化合物和药学上可接受的盐 或载体的组合物。

本发明的另一个方面提供了式I的化合物用于防止神经损伤的用途。

本发明的另一个方面提供了式I的化合物用于治疗神经变性疾病的 用途。

在一个示例性实施方案中，神经变性疾病是帕金森氏症。

本发明的另一个方面提供了治疗帕金森氏症或防止神经损伤或神经 细胞损失的方法，包括将式I的化合物施用至有需要的个体的步骤。

本发明的另一方面提供了治疗人类患者中神经变性疾病的方法，其 包括向患者施用治疗有效量的式I的化合物和白杨素，其中该化合物与白 杨素表现出对神经保护作用的协同效应。

本发明的另一个方面提供了式II的化合物:

其中R₁和R₃独立地选自下组：H、未取代或取代的烷基、环烷基、 烯基、炔基、芳基、杂芳基、羧基、烷氧基、羟基、氨基、硝基、烷硫 基、酰基、氰基、酰氨基、卤基和酯；R₂和R₄独立地选自下组：H、未 取代或取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、酰基、酰氨基和 卤基。

在示例性实施方案中，对于式II的化合物，R₁和R₃独立地为未取代 或取代的(C1-C3)烷基；R₂和R₄为H。

在另一个示例性实施方案中，式II的化合物是经分离和纯化的 ((4S)-4-(3-羟基-3-甲基-6-氧代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)或((4R)-4-(3-羟基 -3-甲基-6-氧代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)。化合物((4S)-4-(3-羟基-3-甲基 -6-氧代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)(化合物2)和((4R)-4-(3-羟基-3-甲基-6-氧 代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)(化合物3)分别表示为下式。

本发明的另一个方面提供了包含式II的化合物和药学上可接受的盐 或载体的组合物。

本发明的另一个方面提供了式II的化合物用于防止神经损伤的用 途。

本发明的另一个方面提供了式II的化合物用于治疗神经变性疾病的 用途。

在一个示例性实施方案中，神经变性疾病是帕金森氏症。

本发明的另一个方面提供了治疗帕金森氏症或防止神经损伤或神经 细胞损失的方法，包括将式II的化合物施用至有需要的个体的步骤。

本发明的另一个方面提供了由益智仁(A.oxyphyllaefructus)制备分离 和纯化的化合物的方法，其包括以下步骤:

a)低压热回流下用醇水溶液提取益智仁样品并除去溶剂，得到粗提取 物；

b)用乙醇重建步骤(a)的粗提取物，得到乙醇提取物溶液；

c)吸收乙醇提取物溶液到硅胶并除去乙醇，得到硅胶提取物；

d)在常压热回流下用有机溶剂依次提取硅胶提取物，得到生物活性部 分；

e)分馏生物活性部分并用增加极性的溶剂混合物洗脱，得到第一生物 活性级分；

f)纯化步骤e)的第一生物活性级分，得到化合物。

其中所述化合物选自((R)-4-(2-羟基-5-甲基苯基)-5-甲基己酸)、 ((4S)-4-(3-羟基-3-甲基-6-氧代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)和((4R)-4-(3-羟基 -3-甲基-6-氧代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)。

在示例性实施例中，步骤(f)还包括：

g)分馏步骤(e)的第一生物活性级分，并用增加极性的溶剂混合物洗 脱，得到第二生物活性级分，

h)用等度洗脱纯化第二生物活性级分，得到化合物((R)-4-(2-羟基-5- 甲基苯基)-5-甲基己酸)。

在示例性实施例中，步骤(f)还包括通过准备的高效液相色谱用等度 洗脱来纯化步骤(e)的第一生物活性级分，得到化合物((4S)-4-(3-羟基3- 甲基-6-氧代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)和化合物((4R)-4-(3-羟基-3-甲基-6- 氧代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)。

附图说明

图1显示了化合物1-5对MPP⁺诱导的原代CGN损伤的神经保护作 用。与MPP⁺单独处理组相比*p<0.05。

图2A和2B显示化合物1对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤的作用。 相对于对照组##p<0.01；相对于载体组**p<0.01。

图3A-3G显示化合物1对保护斑马鱼免受MPTP诱导的多巴胺能神 经元损失的作用。相对于对照组##p<0.01；相对于载体组*p<0.05；相对 于载体组**p<0.01。

图4A和4B显示化合物1扭转斑马鱼中由MPTP诱导的总行进距离 的降低。相对于对照组(没有MPTP处理)##p<0.01；相对于MPTP处理组 *p<0.05。

图5显示化合物1和白杨素对MPP⁺诱导的原代CGN损伤的协同神 经保护作用。与MPP⁺单独处理组相比*p<0.05，与3μΜ白杨素加MPP⁺处理组相比#p<0.05，与6μΜ白杨素加MPP⁺处理组相比$p<0.05。

图6显示药物处理和行为测试的工作流程。

图7A-7D显示化合物1改善注射MPTP的小鼠的运动损伤。(A)爬杆 试验；(B)足迹试验的持续时间；(C)旋转试验；(D)足迹试验的步长。结 果表示为三个重复试验的平均数±S.E.M(n＝8)。与对照(Ctrl)组比较#p<0.05 和###p<0.001；与载体(Veh)处理组相比*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。 Rasa，雷沙吉兰。

图8A-8C显示在注射MPTP的小鼠中化合物1保护TH阳性多巴胺 能神经元损失。(A)从吻端到尾端典型中脑段的TH免疫染色。(B)曲线图 显示8个匹配的相邻段的TH阳性细胞计数±S.E.M(n＝8)。(C)不同处理组 的切片的数据平均值的统计分析。结果表示为平均数±S.E.M(n＝8)。与对 照(Ctrl)组相比#p<0.05；与载体(Veh)处理组相比*p<0.05。Rasa，雷沙吉 兰。

发明详述

本文和权利要求中所用的“包括”意指包括以下要素但不排除其它。

以下实施例是通过说明本发明的方式给出，但不应该被认为限制本 发明的范围。可以在不脱离本发明的范围内作出合理的变化，例如由合 理的技术人员所理解的那些。

实施例1化合物1-5的物理化学性质

1.化合物1的物理化学性质

((R)-4-(2-羟基-5-甲基苯基)-5-甲基己酸)

式：

物理描述：白色粉末

比旋度:[α]_D^26.2＝-11.3(c3.0,MeOH),[α]_D^25.0＝-19.4(c0.72,CH₂C1₂).

UV(甲醇)λ最大：222nm,282nm

¹HNMR谱(600MHz,CDCl₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ(ppm)2.18,2.11 (2H,m,Η-2α,2β),1.80,2.17(2H,m,H-3α,3β),2.67(1H,m,H-4),1.85(1H, m,H-5),1.01(3H,d,J＝6.58Hz,H-6),0.74(3H,d,J＝6.65Hz,H-7),6.66 (1H,d,J＝8.52Hz,H-3'),6.85(1H,d,J＝8.52Hz,H-4'),6.85(1H,s,H-6'), 2.27(3H,s,H-7')

¹³CNMR谱(125MHz,CDCl₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ(ppm)178.2(C-1), 31.7(C-2),27.6(C-3),44.1(C-4),32.7(C-5),20.8(C-6),21.1(C-7),130.1 (C-1'),151.9(C-2'),115.4(C-3'),127.4(C-4'),129.5(C-5'),128.2(C-6'),20.6 (C-7')

质谱(HR-ESI-MS):mlz235.1369[M-H]^-(C₁₄H₁₉O₃的计算值, 235.1339)

2.化合物2的物理化学性质

((4S)-4-(3-羟基-3-甲基-6-氧代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)

式:

物理描述:黄色油状

比旋度:[α]_D^26.2＝-22.5(c3.0,MeOH)

UV(甲醇)λ最大:238nm

¹HNMR谱(600MHz,CDCl₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ(ppm)2.18,2.16 (2H,m,H-2),1.97,1.74(2H,m,Η-3α,3β),2.25(IH,m,H-4),1.79(IH,m, H-5),0.76(3H,d,J＝6.68Hz,H-6),0.89(3H,d,J＝6.65Hz,H-7),6.40(IH, s,H-2'),2.65,2.64(2H,m,H-4'α,4'β),2.09(2H,m,H-5'),1.45(3H,s,H-7')

¹³CNMR谱(125MHz,CDCl₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ(ppm)178.3(C-1), 45.5(C-2),25.6(C-3),45.3(C-4),31.2(C-5),20.4(C-6),21.0(C-7),139.0 (C-1'),150.6(C-2'),69.0(C-3'),35.4(C-4'),37.1(C-5'),198.6(C-6'),27.6 (C-7')

质谱(HR-ESI-MS):mlz253.1468[M-H]^-(C₁₄H₂₁O₄的计算值, 253.1445)

3.化合物3的物理化学性质

((4R)-4-(3-羟基-3-甲基-6-氧代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)

式:

物理描述:黄色油状

比旋度:[α]_D^26.2＝-31.5(c3.0,MeOH)

UV(甲醇)λ最大:238nm

¹HNMR谱(600MHz,CDCl₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ(ppm)2.16(2H,m, H-2),1.95,1.65(2H,m,Η-3α,3β),2.53(IH,m,H-4),1.79(IH,m,H-5),0.77 (3H,d,J＝6.68Hz,H-6),0.86(3H,d,J＝6.65Hz,H-7),6.44(IH,s,H-2'), 2.66,2.44(2H,m,H-4'α,4'β),2.10(2H,m,H-5'),1.46(3H,s,H-7')

¹³CNMR谱(125MHz,CDCl₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ(ppm)178.2(C-1), 32.1(C-2),25.7(C-3),42.1(C-4),31.9(C-5),20.4(C-6),20.4(C-7),139.1 (C-1'),149.6(C-2'),69.1(C-3'),37.0(C-4'),35.2(C-5'),198.7(C-6'),27.5 (C-7')

质谱(HR-ESI-MS):mlz253.1480[M-H]^-(C₁₄H₂₁O₄的计算值, 253.1445)

4.化合物4的物理化学性质

((S)-4-(2-羟基-5-甲基苯基)-5-甲基己酸)

式:

物理描述:白色粉末

比旋度:[α]_D^25.0＝+20.0(c,0.72,CH₂Cl₂)

¹HNMR谱(600MHz,CDCI₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ(ppm)2.20,2.13 (2H,m,Η-2α,2β),1.81,2.18(2H,m,H-3α,3β),2.67(1H,m,H-4),1.86(1H, m,H-5),1.02(3H,d,J＝6.5Hz,H-6),0.74(3H,d,J＝6.5Hz,H-7),6.65(1H, d,J＝8.5Hz,H-3'),6.84(2H,d,J＝8.5Hz,H-4'),6.84(1H,s,H-6'),2.24 (3H,s,H-7')

¹³CNMR谱(125MHz,CDCl₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ(ppm)180.2(C-1), 32.2(C-2),27.6(C-3),44.3(C-4),32.9(C-5),20.9(C-6),21.3(C-7),130.1 (C-1'),151.8(C-2'),115.6(C-3'),127.4(C-4'),129.4(C-5'),128.6(C-6'), 20.8(C-7')

质谱(HR-ESI-MS):mlz235.1358[M-H]^-(C₁₄H₁₉O₃的计算值, 235.1339)

5.化合物5的物理化学性质

(4-(2-羟基-5-甲基苯基)-5-甲基己酸)

式:

物理描述:白色粉末

¹HNMR谱(600MHz,CDCl₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ(ppm)2.20,2.13 (2H,m,Η-2α,2β),1.82,2.18(2H,m,H-3α,3β),2.66(1H,m,H-4),1.87(1H, m,H-5),1.02(3H,d,J＝6.5Hz,H-6),0.74(3H,d,J＝6.5Hz,H-7),6.65 (1H,d,J＝8.5Hz,H-3'),6.85(1H,d,J＝8.5Hz,H-4'),6.85(1H,s,H-6'), 2.24(3H,s,H-7')

¹³CNMR谱(125MHz,CDCl₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ(ppm)180.2(C-l), 32.2(C-2),27.6(C-3),44.3(C-4),32.9(C-5),20.7(C-6),21.3(C-7),130.1 (C-l'),151.8(C-2'),115.6(C-3'),127.4(C-4'),129.4(C-5'),128.6(C-6'),20.9 (C-7')

实施例2从益智仁分离化合物1的方法

粗粉碎后，在回流下用95％的醇水溶液对风干的益智仁果实萃取三 次，萃取溶液用旋转蒸发器在水浴中干燥。然后将干燥的益智仁粗提取 物悬浮在乙醇中并吸附至硅胶。除去乙醇后，将干燥的硅胶依次用石油 醚、乙酸乙酯和乙醇萃取，分别得到石油醚部分、乙酸乙酯部分和乙醇 部分。生物测定表明，乙酸乙酯部分是最具生物活性的，因此被选择用 于进一步的分析。将乙酸乙酯部分通过正相硅胶柱层析法用混有从0％至 20％的增加量的甲醇的氯仿进行进一步分离，得到13种级分(级分A-M)。 生物测定表明，级分G是最具生物活性的。通过硅胶柱层析洗脱混有从 0％至2％的增加量的甲醇的氯仿对级分G进行分级，得到五个主要的子 级分GS1、GS2、GS3、GS4和GS5。子级分GS2通过交联葡聚糖(Sephadex) LH-20被进一步分级，使用100％甲醇从洗脱液得到化合物1。通过用碘 作为指示剂的薄层色谱来监测化合物1的纯度。

实施例3从益智仁分离化合物2和3的方法

如实施例2所示，通过准备的高效液相色谱法对最具活性的级分G 进行分级，用25％的乙腈洗脱获得化合物2和3。通过在254nm的UV 监测化合物2和3的纯度。

本发明提供了证据以支持化合物1、2和3作为用于控制益智仁的质 量的参考化学标记物的用途。

实施例4合成化合物1、4和5的方法

化合物1连同其手性异构体化合物4和外消旋化合物5的合成，如 方案(I)所示:

方案(I)

1)合成1-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-2-甲基丙-1-酮(b)

在0℃将化合物a即4-甲基苯甲醚(76.4g，625mmol，1.0当量)逐滴 加入AlCl₃(100g，750mmol，1.2当量)在DCM(1000mL)中的溶液，然后 将异丁酰氯(80.0g，750mmol，1.2当量)逐滴加到该溶液中，同时保持温 度低于5℃。将混合物在室温下搅拌过夜。然后将混合物倒入粉碎的冰 (2.0kg)中；将有机层用H₂O和饱和NaCl水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过 滤并最后干燥，得到棕色油状的化合物b(110g，92％)。

¹HNMR(400MHz,CDC1₃):δ1.14(d,J＝6.8Hz,6H),2.05(s,3H), 3.44-3.51(m,1H),3.85(s,3H),6.85(d,J＝8.4Hz,1H),7.22(d,J＝8.4Hz, 1H),7.31(s,1H).

2)合成(2E)-3-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-4-甲基戊-2-烯酸乙酯(c)

向NaH(34.3g，858mmol，1.5当量，60％在矿物油中)在THF(1000mL) 中的悬浮液中逐滴加入磷酰基乙酸三乙酯(192g，858mmol，1.5当量)， 同时保持温度低于10℃40分钟，然后将溶液在0℃下搅拌30分钟。逐 滴加入化合物b(110g，572mmol，1.0当量)，同时保持温度低于10℃20 分钟。将混合物回流过夜。用NH₄Cl水溶液猝灭反应，并将得到的有机 层用H₂O和饱和NaCl水溶液洗涤；用硫酸钠干燥，过滤，并蒸发，经硅 胶上柱色谱法(PE/EtOAc＝100/1～30/1)纯化残余物，得到无色油状的粗 化合物c(150g)，其含有化合物b和化合物c。

¹HNMR(400MHz,CDC1₃):δ0.81-1.18(m,9H),2.20(s,3H), 2.53-2.59(m,1H),3.67(s,3H),3.89(q,J＝7.2Hz,2H),5.83(s,1H),6.67(s, 1H),6.71(d,J＝8.4Hz,1H),6.98(d,J＝8.4Hz,1H).

3)合成3-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-4-甲基戊酸乙酯(d)

室温H₂气氛下将化合物c(150g，粗品)和Pd/C(15g，10％)在 EtOH(500mL)中的混合物搅拌过夜，然后过滤。将滤液蒸发，得到无色 油状的粗化合物d(110g，2步骤中61％产率)，其含有化合物d(84％，w/w) 和化合物b(16％，w/w)。

¹HNMR(400MHz,CDC1₃):δ0.76(d,J＝6.8Hz,3H),0.79(d,＝6.8 Hz,3H),1.06(t,J＝7.2Hz,3H),1.92-1.97(m,IH),2.25(s,3H),2.61-2.75 (m,2H),3.22-3.28(m,IH),3.77(s,3H),3.95(q,J＝7.2Hz,2H),6.72(d,J＝ 8.4Hz,IH),6.88(s,IH),6.94(d,J＝8.4Hz,IH).

4)合成3-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-4-甲基戊-1-醇(e)

在0℃于30分钟内将化合物d(80.0g，255mmol，1.0当量，84％w/w) 逐滴加到LAH(13.8g，363mmol，1.43当量)在THF(500mL)的悬浮液中， 然后在室温下搅拌1.5小时。依次用H₂O(13.8g)、NaOH水溶液(13.8mL， 15％)和H₂O(41.4g)猝灭反应，然后通过硅藻土过滤并浓缩。通过在硅胶 上柱色谱法(PE/EtOAc＝50:1～20/1)纯化残余物，得到无色油状的化合物 e(41.4g，73％)。

¹HNMR(300MHz,CDC1₃):δ0.73(d,J＝6.6Hz,3H),1.03(d,J＝ 6.6Hz,3H),1.27-1.65(m,IH),1.87-1.94(m,2H),2.10-2.17(m,IH),2.29(s, 3H),2.86-2.93(m,IH),3.21-3.24(m,IH),3.26-3.50(m,IH),3.80(s,3H), 6.78(d,J＝8.1Hz,IH),6.93(s,IH),6.97(d,J＝8.1Hz,IH).

5)合成3-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-4-甲基戊基甲基磺酸盐(f)

在0℃下将MsCl(42.6g，558mmol，2.0当量)逐滴加入化合物e(41.4g， 186mmol，1.0当量)和TEA(56.5g，558mmol，3.0当量)在DCM(750mL) 中的溶液，将溶液在室温下搅拌2小时。2小时后，将混合物用H₂O然 后用NaCl水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到棕色油状的化 合物f(55.8g，100％)。

¹HNMR(400MHz,CDC1₃):δ0.72(d,J＝6.4Hz,3H),0.97(d,J＝6.4 Hz,3H),1.84-1.91(m,1H),1.97-2.06(m,1H),2.18-2.26(m,4H),2.83-3.14 (m,4H),3.75(s,3H),3.88-3.94(m,1H),4.00-4.05(m,1H),6.74(d,J＝8.4 Hz,1H),6.86(s,1H),6.96(d,J＝8.4Hz,1H).

6)合成4-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-5-甲基己腈(g)

在75℃下将化合物f(55.8g，186mmol，1.0当量)和NaCN(18.2g， 372mmol，2.0当量)在DMF(300mL)中的混合物搅拌过夜，并分配到EtOAc 和H₂O中。将有机层用H₂O和饱和NaCl水溶液洗涤，用硫酸钠干燥， 过滤并蒸发，得到无色油状的化合物g(38.5g，90％)。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ0.71(d,J＝6.8Hz,3H),0.99(d,J＝6.8 Hz,3H),1.85-2.17(m,5H),2.28(s,3H),2.75-2.81(m,1H),3.76(s,3H), 6.75(d,J＝8.4Hz,1H),6.84(s,1H),6.98(d,J＝8.4Hz,1H).

7)合成4-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-5-甲基己酰胺(h)

在室温下将H₂O₂(32.0g，282mmol，1.5当量，30％在H₂O中)逐滴加 入化合物g(43.5g，188mmol，1.0当量)和K₂CO₃(10.4g，75.2mmol，0.4 当量)在DMSO(220mL)的悬浮液中，然后在室温下搅拌该溶液3小时。 在室温下1小时内将额外的H₂O₂(32.0g，282mmol，1.5当量，30％在H₂O 中)逐滴加入。在EtOAc和H₂O之间分离混合物，将有机层用H₂O然后 用饱和NaCl水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到白色固体的 化合物h(46.9g，100％)。

¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ0.72(d,J＝6.6Hz,3H),1.00(d,J＝6.6 Hz,3H),1.73-2.21(m,5H),2.28(s,3H),2.79-2.84(m,1H),3.79(s,3H), 5.38(brs,2H),6.76(d,J＝8.4Hz,1H),6.85(s,1H),6.97(d,J＝8.4Hz,1H).

8)合成4-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-5-甲基己酸(i)

将化合物h(46.9g，188mmol，1.0当量)、NaOH(30.1g，752mmol， 4.0当量)和H₂O(100mL)在EtOH(400mL)中的混合物回流过夜并浓缩。将 残余物的pH用1NHCl调节至2，然后用EtOAc萃取残余物。将有机层 用NaCl水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到棕色油状的化合 物i(47.1g，100％)。

¹HNMR(300MHz,CDC1₃):δ0.74(d,J＝6.6Hz,3H),1.01(d,J＝6.6 Hz,3H),1.78-1.94(m,2H),2.04-2.20(m,3H),2.28(s,3H),2.76-2.82(m, 1H),3.76(s,3H),6.76(d,J＝8.4Hz,1H),6.89(s,1H),6.97(d,J＝8.4Hz, 1H).

9)合成(R)-4-(2-羟基-5-甲基苯基)-5-甲基己酸(1)和(S)-4-(2-羟基-5-甲 基苯基)-5-甲基己酸(4)

在室温下将HBr(235mL，33％在AcOH中)溶液逐滴加入到化合物i (47.1g，188mmol)在AcOH(235mL)中的溶液，然后回流过夜。将混合物 用EtOAc和水稀释。将有机层用H₂O和饱和NaCl水溶液洗涤，随后浓 缩。将残余物用EtOH(400mL)和H₂O(40mL)稀释，加入LiOH.H₂O(31.6g， 752mmol)；将混合物在室温下搅拌1.5小时，然后浓缩。将残余物稀释， 并用1NHCl酸化至pH2-3。将有机层用H₂O洗涤，然后用NaCl水溶液 洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发。通过硅胶上柱色谱法(PE/EtOAc＝ 100/1至10/1)纯化残余物，得到白色固体的化合物5(22.2g，50％)。通过 手性制备HPLC分离11.0g化合物5，得到4.5g化合物1和3.8g化合物4。

化合物1：¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.68(d,J＝6.4Hz,3H), 0.92(d,J＝6.4Hz,3H),1.68-1.97(m,5H),2.17(s,3H),2.65-2.68(m,1H), 6.66(d,J＝7.6Hz,1H),6.76-6.79(m,2H),8.83(s,1H),11.84(s,1H)；¹H NMR(600MHz,CDCl₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ6.66(d,J＝8.52Hz,2H),6.85 (d,J＝8.52Hz,2H),6.85(s,1H),2.67(m,1H),1.80,2.17(m,2H),2.18, 2.11(m,2H),1.85(m,1H),1.01(d,J＝6.58Hz,3H),0.74(d,J＝6.65Hz, 3H),2.27(s,3H)；LCMS[流动相：在6分钟内从95％水(0.01％NH₄Ac)和 5％CH₃CN至5％水(0.01％NH₄Ac)和95％CH₃CN，最后在这些条件下0.5 分钟]纯度为>95％，Rt＝3.847分钟；MS计算值：236；MS实测值：237([M +H]⁺)；手性HPLC(ChiralcelOJ-H柱)：Rt＝7.16分钟(己烷/叔丁醇/TFA＝ 95:5:0.3)，ee＝100％；[α]_D²⁵＝-19.4(c0.72，CH₂C1₂)。

化合物4:¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.68(d,J＝6.4Hz,3H), 0.92(d,J＝6.4Hz,3H),1.66-2.01(m,5H),2.17(s,3H),2.65-2.67(m,1H), 6.66(d,J＝8.4Hz,IH),6.76-6.79(m,2H),8.79-8.84(brs,1H),11.79-11.86 (brs,IH)；¹HNMR(600MHz,CDC1₃,δ_TMS＝0.00ppm):δ6.65(d,J＝8.5 Hz,2H),6.84(d,J＝8.5Hz,2H),6.84(1H,s,H-5),2.67(m,1H),1.81,2.18 (m,2H),2.20,2.13(m,2H),1.86(m,IH),1.02(d,J＝6.5Hz,3H),0.74(d,J ＝6.5Hz,3H),2.24(s,3H)；LCMS[流动相：在6分钟内从95％水 (0.01％NH₄Ac)和5％CH₃CN至5％水(0.01％NH₄Ac)和95％CH₃CN，最后 在这些条件下0.5分钟]纯度为>95％，Rt＝3.849分钟；MS计算值：236； MS实测值：237([M+H]⁺)；手性HPLC(ChiralcelOJ-H柱)：Rt＝10.24 分钟(己烷/叔丁醇/TFA＝95:5:0.3)，对映异构体：Rt＝7.31分钟)，ee＝98％； [α]_D²⁵＝+20.0(c0.72，CH₂C1₂)。

化合物5:¹HNMR谱(600MHz,CDCl₃,δ_TMs＝0.00ppm):δ6.65(d,J ＝8.5Hz,2H),6.85(d,J＝8.5Hz,2H),6.85(s,1H),2.66(m,1H),1.82,2.18 (m,2H),2.20,2.13(m,2H),1.87(m,1H),1.02(d,J＝6.5Hz,3H),0.74(d,J ＝6.5Hz,3H),2.24(s,3H).

实施例5对保护免受MPP⁺诱导的CGN损伤的作用的研究

N-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)是1-甲基-4-苯基吡啶(MPP⁺) 的前体，一种通过多巴胺能分解酶单胺氧化酶B由MPTP产生的线粒体 电子传递链(ETC)复合物I抑制剂。多巴胺能神经元中MPP⁺的积累导致 ATP不足、线粒体膜电位崩溃，线粒体通透性转换孔(mPTP)的开启和ROS 的产生，从而导致细胞凋亡。MPTP/MPP⁺已经被广泛地在体外和体内的 神经元损伤中用来模拟帕金森氏症的多巴胺能神经变性特性。

从8日龄斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley)大鼠制备原代小脑颗粒神 经元(CGN)，如之前的出版物(Du,Balesetal.1997)中所描述。体外培养7 天的CGN用系列浓度分别为6μΜ至50μΜ的化合物1-5预处理2小时， 载体组用0.1％DMSO温育。然后将细胞与150μΜMPP⁺作用36小时。 对于细胞活力的评定，将15μl5mg/ml的MTT溶液加入至每个孔含细胞 的100μl培养基中，将板在37℃加湿培养箱中温育4小时。温育后，加 入100μl绝对DMSO，并温育10分钟。用酶标仪测定各孔在570nm处 的吸光度。

图1显示，化合物1-5预防了MPP⁺诱导的CGN损伤。化合物1显 示以剂量依赖方式对MPP⁺诱导的原代SD大鼠CGN损伤的神经保护作 用，E_最大的浓度是50μΜ。化合物2对MPP⁺诱导的原代SD大鼠CGN损 伤有神经保护作用，E_最大的浓度是50μΜ。化合物3对MPP⁺诱导的原代 SD大鼠CGN损伤有神经保护作用，E_最大的浓度是25μΜ。化合物4对 MPP⁺诱导的原代SD大鼠CGN损伤有神经保护作用，E_最大的浓度是12μΜ 的。化合物5以剂量依赖方式对MPP⁺诱导的原代SD大鼠CGN损伤有 神经保护作用，E_最大的浓度是50μΜ。

如示于图1，在用不同浓度的化合物1-5预处理后，CGN的细胞活 力已显著增加。因此，图1显示化合物1-5可以防止MPP⁺诱导的神经元 损伤，并且可用于治疗神经变性疾病。

实施例6对保护PC12细胞免受6-OHDA诱导的神经元损伤的作用 的研究

大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)的细胞以1.5～2×l0⁶细胞/皿的密度接种 在皿中。在具有低血清水平(0.5％FBS的F-12K培养基)的培养基 中培养24小时后，将细胞用系列浓度为6μΜ至50μΜ的化合物1预处理 12小时。然后将细胞与1mM6-OHDA作用2小时。类似于实施例5所 述，评估细胞的细胞活力。如图2A所示，用化合物1预处理的PC12细 胞在所有测试浓度没有显示出任何细胞毒性。6-OHDA对PC12细胞有细 胞毒性，但化合物1可以剂量依赖方式减轻细胞毒性作用，如图2B所示。 化合物1在50μΜ对6-OHDA处理的PC12表现出显著和最大的神经保护 作用。已经证明黄芩素，即从黄芩(SBG)的根中提取的主要黄酮之一，防 止对在帕金森氏症的体外和体内模型中由6-OHDA或MPTP诱导的神经 元损伤(Im,Jooetal.2005；Lee,Nohetal.2005；Cheng,Heetal.2008；Mu, Heetal.2009；Mu,Heetal.2011)。这里黄芩素用作阳性对照，其在100μΜ 的浓度明显保护PC12细胞免受6-OHDA诱导的神经元损伤。

因此，图2A和2B显示化合物1对6-OHDA处理的PC12可具有神 经保护作用。此外，化合物1以剂量依赖方式对6-OHDA诱导的PC12 细胞损伤具有神经保护作用，且在50μΜ的浓度功效最大(E最大)。

实施例7对减弱MPTP诱导的DA神经元损伤的作用的研究

在受精后(dpf)1天对斑马鱼胚胎脱氯(dechorinated)，并在200μΜ MPTP和各种浓度的化合物1的共同处理下培养48小时。此后，将斑马 鱼固定在PBS中的4％多聚甲醛5小时，冲洗并在-20℃下储存在100％的 EtOH中。用标准方法(Bitzur,Kametal.1994)完成整装的免疫染色。化合 物1以剂量依赖性方式减弱MPTP诱导的DA神经元损伤，如图3D-F所 示。此外，化合物1能以剂量依赖性方式防止斑马鱼中MPTP诱导的多 巴胺能神经元损失，E_最大的浓度是5μΜ，如图3G所示，其中结果定量表 达为TH阳性细胞相比未处理的对照组的面积百分比。因而图3G显示了 化合物1可以防止TH阳性细胞的损失。

实施例8对减弱MPTP诱导的斑马鱼幼体的总行进距离减少的作 用的研究

用200μΜMPTP和各种浓度的化合物1共处理该受精后(dpf)3天斑 马鱼幼体4天。在受精后(dpf)7天，用填充有200μl胚胎培养基的96孔 板(1鱼/孔和每组12幼虫)记录幼体行进的总距离。数据采集之前幼体被 允许容纳在该系统中一小时。记录各幼体的游动模式10分钟，共3次， 每次记录期间分别为10分钟。行进的总距离估计为幼体在一个期间(10 分钟)内已游动的距离(单位mm)。如图4A和4B所示，化合物1以剂量 依赖性方式减弱MPTP诱导的幼虫行进总距离的减少。

实施例9化合物1和白杨素的协同神经保护作用的研究

如所述(Zhangetal.，2012)从8日龄斯普拉格-杜勒大鼠制备原代小脑 颗粒神经元(CGN)。已在体外培养7天的CGN用系列浓度为3μg/ml至 50μg/ml的化合物1预处理2小时或用0.1％DMSO(载体组)预处理。估计 细胞活力与实施例5类似。

如图5所示，化合物1和白杨素都以剂量依赖性方式防止CGN中 MPP⁺诱导的细胞损伤。当细胞用25μΜ和50μΜ化合物1以及用12μΜ 和25μΜ白杨素处理时，与单独用MPP⁺处理的对照组相比，细胞活力显 著增强(p<0.05)。CGN还被化合物1和白杨素共同处理，以探讨两种化合 物之间的药物相互作用。从这发现，在较高浓度如25μΜ和50μΜ，共处 理没有发挥任何神经保护作用，但对CGN施加了毒性(数据未显示)。相 反，在3μΜ和6μΜ的较低浓度，与仅用MPP⁺、MPP⁺/化合物1和MPP⁺/ 白杨素处理的细胞相比，化合物1和白杨素显示显著的协同神经保护作 用。

实施例10对化合物1在注射MPTP的小鼠中的神经保护作用的研 究

动物和药物处理

该研究中使用成年雄性C57BL/6J小鼠(8-10周龄，18-22g)。将动物 保持在12/12光/暗周期，允许其随意获得食物和水。他们被允许在处理 前适应环境7天。如图6所示，注射MPTP前对所有动物进行行为训练(爬 杆，旋转杆运行和足迹法)共4天。然后对小鼠腹膜内注射(i.p.)20mg/kg MPTP盐酸盐(SigmaAldrich,St.Louis,MO)，每隔2小时注射一次，共4 次。正常对照组通过腹膜内注射接受盐水(0.1mL/10g)。每次MPTP注射 前一小时，通过灌胃施用化合物1(5、10和20mg/kg)、雷沙吉兰(1mg/kg) 和等体积载体(橄榄油，0.1mL/10g)。然后，化合物1、雷沙吉兰或载体通 过灌胃每日一次给药，共7天(第1-7天)。六组各由10只小鼠组成。

行为测试

最后剂量的药物给药(第8天，如图6)后24小时，通过爬杆试验、 旋转试验和足迹试验观察小鼠的神经行为变化。所有试验均在在正常动 物房照明下上午9点至下午2点之间进行。

进行爬杆试验以检测肢体运动的障碍。将乒乓球(直径5cm)装在垂直 杆(长55cm，直径1cm)的顶部。杆包裹有双层纱布以避免打滑。将动物 头朝上置于的乒乓球上。动物向下爬到地板上花费的时间用来指示性能。 进对每只动物行三次重复试验，平均值用于统计学分析。

旋转试验可揭示运动协调能力。旋转杆系统(YLS-4C，中国，山东省， 医学科学院)以5rpm的启动速度至40rpm的最终速度的加速程序进行设 定。让小鼠调整自己的姿势，以在速度加快期间保持旋转杆上的平衡。 红外光束被用来检测小鼠何时落到旋转杆之下的基础网格。系统将下落 记录为对那只小鼠实验的结束，并记录旋转杆上的总时间。为了测试， 同时测试5只小鼠。计算杆上的平均停留时间。

在足迹试验中，训练小鼠用红墨水着色的前爪和后爪走过5cm宽、 100cm长的走廊。它们的脚步被记录在白色的吸水纸上。

组织制备

如图6所述，在第9天将小鼠处死用于组织制备。对各组小鼠进行 麻醉并用含有肝素的0.9％氯化钠心内灌注，然后用4％多聚甲醛(PFA)固 定。除去每个脑，用梯度醇脱水并包埋在石蜡中，冠状切片5μΜ。脑的 吻侧和尾侧被分开用于黑质致密部(SNpc)免疫组织化学。

抗酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学

如前所述进行免疫组织化学(Lee,Kimetal.2011；Levites,Weinrebet al,2001)。简言之，将切片在二甲苯中脱蜡并在梯度醇系列中再水化。将 切片在室温下用3％过氧化氢(H₂O₂)温育10分钟以使内源性过氧化物酶 活性失活，随后在95℃下在微波炉中在柠檬酸盐缓冲液中抗原修复15分 钟。非特异性蛋白结合被PBS(0.01M，pH7.4)中的10％牛血清阻断。每 次处理之间，将载玻片用去离子水洗涤5分钟至少三次。然后将切片在 室温下用在免疫染色一级抗体稀释缓冲液中稀释的兔抗小鼠TH多克隆 抗体(1:1000；Millipore，美国)温育1小时。然后将切片用生物素化的HRP 缀合的二级抗体在室温下温育30分钟。然后使用DAB试剂盒根据制造 商的说明(上海，基因公司，中国)使TH阳性神经元可视化。3分钟后停 止过氧化物酶反应。最后，用中性树胶对切片盖玻片。在立体显微镜(BX51, OlympusCorp.Japan)上以×10的放大倍数通过对TH阳性细胞的数目进行 计数，来分析结果。由对药物处理不知情的操作者在每只小鼠的8位匹 配切片中进行TH阳性细胞手动计数。每个切片TH阳性细胞的平均数用 于表示多巴胺能神经元的存活率。

结果

化合物1改善MPTP处理的小鼠的运动障碍

SNpcDA神经元的损失是PD中观察到的运动异常的部分原因。评 估MPTP注射后小鼠的运动。图7A至7D显示MPTP显著增加从杆顶点 爬下的时间(图7A)，延迟经过走廊的时间(图7B)，减少小鼠在旋转杆上 的时间(图7C)，并由此导致小鼠失去正常的步态，缩短步幅(图7D)。因 此，图7A至7D显示化合物1处理以剂量依赖性方式很大程度上纠正了 运动异常。

化合物1对MPTP处理的小鼠的SNpcDA神经元损失的作用

每2小时注射MPTP(20mg/kg)，在1天的8小时期间共给药四次， 导致在注射后7天时在SNpc约40％的TH阳性DA神经元损失，且TH 阳性细胞的损失在中间比在吻侧和尾侧部分发生得更显著(图8A和8B)。 用化合物1的预处理和后处理以剂量依赖性方式显著减少了MPTP诱导 的TH-阳性细胞体的损失(图8A至图8C)。相同安排用于雷沙吉兰，批准 用于治疗PD患者的选择性MAO-B抑制剂，也防止了MPTP诱导的TH- 阳性细胞的损失。

结论

本发明提供了三种从益智仁分离和纯化的化合物:1((R)-4-(2-羟基-5- 甲基苯基)-5-甲基己酸)，2((4S)-4-(3-羟基-3-甲基-6-氧代环己-1-烯基)-5- 甲基己酸)和3((4R)-4-(3-羟基-3-甲基-6-氧代环己-1-烯基)-5-甲基己酸)， 其神经保护作用如在上述实施例所示；具有神经保护作用的两种合成化 合物：4((S)-4-(2-羟基-5-甲基苯基)-5-甲基己酸)和5(4-(2-羟基-5-甲基苯 基)-5-甲基己酸)。这五种先导化合物具有可被开发成用于神经变性疾病 (如帕金森氏症)的治疗剂的神经保护作用。另外，本发明提供了一种从益 智仁提取和纯化这三种新化合物1-3的简单容易的方法和用于合成化合 物1、4和5的详细流程。还显示了化合物1-5对CGN的体外神经保护 活性。此外，本发明表明化合物1对PC12细胞和斑马鱼具有体内和体 外神经保护活性。

本文中所提供的数据表明，对MPP⁺诱导的原代培养脑颗粒神经元 (CGN)的损伤，化合物1-5显示在6-50μΜ浓度的浓度依赖性神经保护作 用。此外，化合物1能保护PC12细胞免受6-OHDA诱导的神经毒性； 保护斑马鱼免受MPTP诱导的多巴胺能神经元损失；改善斑马鱼中由 MPTP诱导的游泳行为障碍。化合物1还可以改善MPTP处理的小鼠的 运动障碍并减少MPTP诱导的TH-阳性细胞体的损失。此外，化合物1 和白杨素(从益智仁分离的另一种已知的类黄酮化合物)显示对MPP⁺诱导 的CGN损伤的协同神经保护作用。这些结果表明，化合物1-5单独或与 其它神经活性化合物的组合可以用作治疗神经变性疾病如帕金森氏症的 药物。

除了如上所述的单一化合物治疗方法，化合物1和白杨素的组合显 示协同作用。本领域技术人员在开发治疗方案的过程中无需过度实验即 能够确定使用以上化合物的一种或组合施用至患者的最佳治疗剂量。

因此本发明的示例性实施方案已被完整地描述了。尽管说明书提到 具体实施方案，但本领域技术人员清楚，可以用这些具体细节的变化来 实施本发明。因此本发明不应被解释为限于这里阐述的实施方案。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领 域中普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似或等同于本文描述的 那些的任何方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但现在描述了优 选的方法和材料。本文提及的所有出版物在此通过引用并入本文以一起 描述和公开该文献被引用的特定信息。

以上引用的所有参考文献和以下的说明都通过引用并入本文。本发 明的实践体现在以下非限制性实施例中。本发明的范围仅由所附的权利 要求限定，其不以任何方式受限于实施例的内容和范围。

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