一种生物素化ATPS的储存试剂

摘要

本发明提供了一种生物素化ATPS的储存试剂，该储存试剂包括以下组分：Tris-HCl、氯化钠、EDTA和DTT，溶剂为去离子水。本发明提供的储存试剂能够延长生物素化ATPS的储存时间，减少反复冻融对其活性的影响；并且使得生物素化ATPS可以长期存放于-80℃、-20℃和4℃下，增加了其储存温度的选择性；还能够有效降低ATPS上生物素标签的脱落率。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物素化ATPS的储存试剂。

背景技术

ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase，ATPS，EC2.7.7.4)是一种可逆催化腺苷酰硫酸 (adenosine-5’-phosphosulfate，APS)与焦磷酸盐(pyrophosphate，PPi)反应生成三磷酸 腺苷(ATP)与硫酸盐的酶，在生物体硫代谢中发挥重要作用。ATPS广泛存在于植物、动物及 微生物中，但它在各种生物体当中的生物学作用略有不同。在植物和部分微生物中，是催化 硫酸盐同化反应第一步的关键酶。在ATPS的催化下，硫酸根离子与ATP反应，产生腺嘌呤- 5’-磷酸硫酸APS和焦磷酸盐PPi。而在一些化学自养菌和化能无机营养菌中，ATPS是催化硫 化氢氧化生成无机硫酸盐最后一步的酶，其作用是催化APS和PPi反应生成ATP和硫酸根离 子，即上述反应的逆反应。ATPS已经从产黄青霉菌、鼠肝、卷心菜等生物体中提取并纯化得 到，而且编码ATPS的基因也已经从原核生物、真核生物、动物和植物中克隆出来并在适当的 宿主中得到表达。不同来源的ATPS结构不同，大肠杆菌来源的ATPS是异源二聚体且需要GTP 激活，酵母、真菌以及植物来源的ATPS是单体或是同源寡聚体。在分子生物学方面，目前已 通过氨基酸修饰等手段研究其结构和功能的关系，加深了对ATPS作用机制的了解。偶连ATP 硫酸化酶可以应用于很多方面，如：PPi定量、RNA测定、DNA测序、DNA聚合酶酶活测定等，其 中ATPS在焦磷酸测序技术发挥重要作用。

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是利用DNA聚合酶(polymerase)、ATPS、荧光素 酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)四种酶催化的同一反应体系中的酶级联 化学发光反应进行DNA测序的技术，其实质是利用生物发光反应进行序列测定的技术。焦磷 酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和上述4种酶构成，反应底物为5’- 腺苷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)和荧光素(luciferin)。在每一轮测序反 应中，只加入四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的一种，若该dNTP能够与DNA模板的下一个碱 基配对，则会在DNA聚合酶的催化下，将其掺入到测序引物链的3’末端，同时释放出一分子 的PPi；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成等量的ATP；生成的ATP在荧 光素酶的催化下，可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，通过微弱光检测装 置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。如果加 入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰。反应 体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。待上一轮反应完成后， 加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

近年来出现了一种高通量光导纤维皮升级微反应池阵列焦测序技术，该技术一次 可以测定上百万个样品，其出现带来了测序技术的革命，这极大地推动了后基因组计划的 发展。这种高通量焦磷酸测序技术需要对ATPS进行生物素化修饰，使之便于固定在微球表 面。众所周知，酶活会直接关系到测序反应的准确度，而酶储存试剂的优劣又直接影响到酶 活。ATPS作为一种生物活性蛋白，在储存、运输和销售过程中易失活，目前常用的酶储存试 剂并不能有效保护生物素化ATPS的酶活，也没有一种专门针对生物素化ATPS的储存试剂。 因此，开发一种专门针对生物素化ATPS的储存试剂，保证其在储存、运输和销售过程中的稳 定性，是该酶工业化生产的应用基础。

发明内容

本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技 术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明中涉及的英文符号：

Tris-HCl指利用三羟甲基氨基甲烷(Tris)和盐酸配制的缓冲液；EDTA指乙二胺四 乙酸；DTT指二硫苏糖醇；Tris-Ac指利用三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制的缓冲液；BSA指牛 血清白蛋白；PVP指聚乙烯吡咯烷酮。

本发明要解决的一个问题是提供一种生物素化ATPS的储存试剂，该储存试剂包括 以下组分：Tris-HCl、氯化钠、EDTA和DTT，溶剂为去离子水。

上述储存试剂中，Tris-HCl的浓度为25～50mM；优选为30～40mM；进一步优选为32 ～36mM。

上述储存试剂中，Tris-HCl的pH值为7.0～8.0；优选为7.2～7.8；进一步优选为 7.4～7.6。

上述储存试剂中，氯化钠的浓度为10～35mM；优选为10～30mM；进一步优选为15～ 25mM。

上述储存试剂中，EDTA的浓度为0.02～0.08mM；优选为0.03～0.07mM；进一步优选 为0.04～0.07mM。

上述储存试剂中，DTT的浓度为0.02～0.08mM；优选为0.04～0.07mM；进一步优选 为0.04～0.06mM。

在某些优选的实施方案中，所述的生物素化ATPS的储存试剂中还包括：蔗糖、山梨 醇和硫代硫酸钠中的一种或多种。

所述的蔗糖的浓度为30～100mM；优选为40～90mM；进一步优选为50～80mM；再一 步优选为60～70mM。

所述的山梨醇的浓度为10～20mM；优选为12～18mM；进一步优选为14～16mM。

所述的硫代硫酸钠的浓度为0.4～0.8mM；优选为0.4～0.7mM；进一步优选为0.5～ 0.6mM。

本发明要解决的另一个问题是提供上述生物素化ATPS的储存试剂的使用方法：使 用时，先将生物素化ATPS与甘油按照1:2的体积比混匀，得到生物素化ATPS的甘油溶液；再 将该生物素化ATPS的甘油溶液与本发明所述的ATPS储存试剂按照3:1的体积比混合均匀。

本发明的有益效果：

本发明提供的生物素化ATPS储存试剂，对生物素化ATPS的活性有保护作用，是的 生物素化ATPS在-80℃、-20℃和4℃下放置1个月，活性几乎不变；在-80℃、-20℃和4℃下放 置3个月，分别能够维持>99％、>97％以及>92％的残余活力；在-80℃、-20℃和4℃下放置6 个月，分别能够维持>97％、>93％以及>90％的残余活力；在25℃、30℃和35℃下放置12h，能 够维持>97％的残余活力；在25℃、30℃和35℃下放置24h，能够维持>95％的残余活力；在25 ℃、30℃和35℃下放置48h，能够维持>93％的残余活力。本发明提供的生物素化ATPS储存试 剂在以上各个储存条件下对ATPS的活性保护均优于常规50％甘油的储存条件。

加入本发明提供的储存试剂后，生物素化ATPS在冻融1次和3次后，均能够维持> 93％的残余活力；在冻融5次后，均能够维持>97％的残余活力；在冻融10次后，均能够维持> 94％的残余活力。而在50％甘油中，生物素化ATPS在反复冻融10次后，仅剩13.1％的残余活 力；不加任何试剂的生物素化ATPS在反复冻融10次后，仅剩5.8％的残余活力。

综上所述，本发明提供的储存试剂能够延长生物素化ATPS的储存时间，减少反复 冻融对其活性的影响；并且使得生物素化ATPS可以长期存放于-80℃、-20℃和4℃下，增加 了其储存温度的选择性；还能够有效降低ATPS上生物素标签的脱落率。

具体实施方式

如无特殊说明，本发明涉及的化学或生物试剂均购自Sigma-Aldrich公司；生物发 光检测仪购自Promega公司，型号为GloMax20/20。

实施例1一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl25mMpH7.0、氯化钠10mM、EDTA0.02mM和DTT0.02mM，溶 剂为去离子水。

实施例2一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl30mMpH7.2、氯化钠15mM、EDTA0.03mM和DTT0.03mM，溶 剂为去离子水。

实施例3一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl35mMpH7.4、氯化钠20mM、EDTA0.04mM和DTT0.04mM，溶 剂为去离子水。

实施例4一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl40mMpH7.6、氯化钠25mM、EDTA0.05mM和DTT0.06mM，溶 剂为去离子水。

实施例5一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl45mMpH7.8、氯化钠30mM、EDTA0.06mM和DTT0.06mM，溶剂 为去离子水。

实施例6一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl50mMpH7.8、氯化钠35mM、EDTA0.07mM和DTT0.07mM，溶剂 为去离子水。

实施例7一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl50mMpH8.0、氯化钠35mM、EDTA0.08mM和DTT0.08mM，溶剂 为去离子水。

实施例8一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl32mMpH7.6、氯化钠22mM、EDTA0.05mM和DTT0.05mM，溶剂 为去离子水。

实施例9一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl36mMpH7.6、氯化钠22mM、EDTA0.06mM和DTT0.05mM，溶 剂为去离子水。

实施例10一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl25mMpH7.0、氯化钠10mM、EDTA0.02mM、DTT0.02mM和蔗糖 30mM，溶剂为去离子水。

实施例11一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl30mMpH7.2、氯化钠15mM、EDTA0.03mM、DTT0.03mM、蔗糖 40mM和山梨醇20mM，溶剂为去离子水。

实施例12一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl35mMpH7.4、氯化钠20mM、EDTA0.04mM、DTT0.04mM和蔗 糖50mM，溶剂为去离子水。

实施例13一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl40mMpH7.6、氯化钠25mM、EDTA0.05mM、DTT0.06mM和蔗 糖60mM，溶剂为去离子水。

实施例14一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl45mMpH7.8、氯化钠30mM、EDTA0.06mM、DTT0.06mM、蔗糖 70mM和山梨醇12mM，溶剂为去离子水。

实施例15一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl50mMpH7.8、氯化钠35mM、EDTA0.07mM、DTT0.07mM和蔗糖 80mM，溶剂为去离子水。

实施例16一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl25mMpH7.0、氯化钠10mM、EDTA0.02mM、DTT0.02mM和蔗 糖100mM，溶剂为去离子水。

实施例17一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl30mMpH7.2、氯化钠15mM、EDTA0.03mM、DTT0.03mM、蔗糖 90mM和山梨醇10mM，溶剂为去离子水。

实施例18一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl35mMpH7.4、氯化钠20mM、EDTA0.04mM、DTT0.04Mm、蔗糖 50mM和山梨醇14mM，溶剂为去离子水。

实施例19一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl35mMpH7.4、氯化钠20mM、EDTA0.04mM、DTT0.04mM和山 梨醇18mM，溶剂为去离子水。

实施例20一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl50mMpH8.0、氯化钠35mM、EDTA0.08mM、DTT0.08mM和山梨 醇16mM，溶剂为去离子水。

实施例21一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl40mMpH7.6、氯化钠25mM、EDTA0.05mM、DTT0.06mM和硫 代硫酸钠0.4mM，溶剂为去离子水。

实施例22一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl35mMpH7.4、氯化钠20mM、EDTA0.04mM、DTT0.04mM和硫 代硫酸钠0.5mM，溶剂为去离子水。

实施例23一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl25mMpH7.0、氯化钠10mM、EDTA0.02mM、DTT0.02mM、蔗糖 100mM和硫代硫酸钠0.6mM，溶剂为去离子水。

实施例24一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl50mMpH7.8、氯化钠35mM、EDTA0.07mM、DTT0.07mM、蔗糖 80mM和硫代硫酸钠0.7mM，溶剂为去离子水。

实施例25一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl36mMpH7.6、氯化钠22mM、EDTA0.06mM、DTT0.05mM、山梨 醇14mM和硫代硫酸钠0.6mM，溶剂为去离子水。

实施例26一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：Tris-HCl32mMpH7.6、氯化钠22mM、EDTA0.05mM、DTT0.05mM、蔗糖 70mM、山梨醇14mM和硫代硫酸钠0.5mM，溶剂为去离子水。

对比例1一种生物素化ATPS的储存试剂

包括以下组分：甘油100％。

实验例1储存试剂对生物素化ATPS活性的保护作用

将生物素化ATPS按照下述使用方法加入到实施例1-26和对比例1所述的储存试剂 中所得的样品分别编号为样品1-27。

使用方法：先将生物素化ATPS与甘油按照1:2的体积比混匀，得到生物素化ATPS的 甘油溶液；再将该生物素化ATPS的甘油溶液与储存试剂按照3:1的体积比混合均匀。

将样品1-27分别于-80℃、-20℃和4℃放置1、3、6个月，于25℃、30℃和35℃下放置 12、24、48h。测定放置前和放置后的ATPS活性，按下式计算残余活力a_r：

a_r(％)＝放置后活性/放置前活性×100％

ATPS活性测定方法：

利用ATPS和荧光素酶两步偶联反应测定ATPS的酶活。

标准测活反应液的组成为：0.1mMTris-Ac(pH7.75)、0.5mMEDTA、5mMMgAc₂、 0.4mg/mLPVP、0.02％(w/v)BSA、1mMDTT、4μMPPi、4μMAPS、0.4mMd-虫荧光素和1.46μg/ mL荧光素酶。

活性测定方法：取上述标准测活反应液50μL于生物发光检测仪中进行基线测定； 然后快速加入1μL浓度为6×10^-5mg/mL的ATPS酶液，混合均匀后置于生物发光检测仪中进行 实时测定。

实验结果见下表：

表1储存试剂对生物素化ATPS活性的保护作用

实验例2反复冻融对生物素化ATPS活性的影响

将不加任何试剂的生物素化ATPS编号为样品28，将样品28和实验例中的样品1-27 分别反复冻融1、3、5、10次后，测定残余活力a_r。残余活力计算公式为a_r(％)＝冻融n次后的 活性/冻融0次的活性×100％(其中n＝1、3、5或10)；ATPS活性测定方法同实验例1。

实验结果见下表

表2反复冻融对生物素化ATPS活性的影响