定向诱导绒山羊毛囊干细胞向表皮细胞分化的方法

摘要

本发明公开了一种定向诱导绒山羊毛囊干细胞向表皮细胞分化的方法，属于绒山羊毛囊干细胞的诱导分化领域。本发明通过向绒山羊毛囊干细胞中加入不同浓度的褪黑素进行诱导，发现不同浓度的褪黑素对毛囊干细胞的增殖具有促进作用；其中，浓度为300pg/ml的褪黑素可以有效的促进毛囊干细胞向表皮细胞分化，而且诱导7d的效率最佳。本发明建立的外源褪黑素定向诱导绒山羊毛囊干细胞向表皮细胞高效分化的方法，不仅操作简便，可重复性好，而且对毛囊干细胞的体外培养，尤其是对于毛囊干细胞体外高效定向诱导的命运决定等相关研究及应用具有重要的实际意义。

说明书

技术领域

本发明涉及绒山羊毛囊干细胞，尤其涉及定向诱导绒山羊毛囊干细胞 向表皮细胞分化的方法，属于绒山羊毛囊干细胞的诱导分化领域。

背景技术

毛囊来源干细胞(hairfolliclestemcells，FSC)是指存在于毛囊里的 原始细胞，目前多数研究将定位于毛囊隆突部和外根鞘的角质形成干细胞 称为毛囊干细胞(Yasuyukietx1.,Implantedhairfolliclestemcellsform Schwanncellsthatsupportrepairofseveredperipheral nerves[J].PNAS,2005,102(49):17734-17738.)，这些干细胞具有增殖分化为 表皮、汗腺和皮脂腺等多种上皮组织的潜能。近年来，毛囊干细胞在再生 医学研究领域备受关注，毛囊干细胞在体内多处于静止状态，而在体外培 养或内环境作用下则表现出惊人的增殖与分化能力，通过不断的分裂分化 来维持组织在细胞数量和功能上的平衡。许多研究人员己经采用不同的方 法分离得到了毛囊干细胞，其方法主要有：流式细胞仪分选法、应用酶消 化法、组织块法、差速贴壁法、显微分离法和免疫磁珠法等。

褪黑素(melatonin,MLT)，学名为N-乙酸-5-甲氧基色胺，分子式 C₁₃H₁₆N₂O₂，相对分子质量为232.27，熔点116-118℃，主要由哺乳动物 及人类的松果体产生，是一种吲哚类化合物/胺类激素，其分泌量昼夜不 同，白天分泌量减少，夜晚分泌量增加。研究表明，不论在山羊生绒期还 是非生绒期，皮下埋置褪黑激素都可以促进绒毛的生长。另外，褪黑素可 以刺激体外培养的毛囊纤维生长。

目前，关于褪黑素对毛囊来源干细胞分化的影响尚未见报道。因此， 建立一种外源褪黑素定向诱导绒山羊毛囊干细胞向表皮细胞高效分化的 方法，对于毛囊干细胞体外高效定向诱导的命运决定等相关研究将具有重 要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种定向诱导绒山羊毛囊干细胞 向表皮细胞分化的方法，该方法利用褪黑素定向诱导绒山羊毛囊干细胞向 表皮细胞高效分化，操作简便，可重复性好，为毛囊干细胞体外培养及研 究应用的开展奠定了基础。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种定向诱导绒山羊毛囊干细胞向表皮细胞分化 的方法，包括：向绒山羊毛囊干细胞中加入褪黑素进行诱导，然后对诱导 分化的细胞进行鉴定，即得；其中，所述褪黑素的使用浓度为100-700pg/ml； 优选的，所述褪黑素的使用浓度为100-300pg/ml，最优选为300pg/ml。 本发明所述诱导的时间为1-21天，优选为3-14天，最优选为7天。本发 明所述绒山羊毛囊干细胞为内蒙古白绒山羊毛囊干细胞。

绒山羊毛囊干细胞的制备方法为本领域技术人员所熟知，其方法主要 包括：流式细胞仪分选法、应用酶消化法、组织块法、差速贴壁法、显微 分离法和免疫磁珠法等，具体的绒山羊毛囊干细胞的制备方法可以参考文 献“内蒙古白绒山羊毛囊来源干细胞的分离鉴定及其褪黑素受体基因 cDNA的克隆，王宏，内蒙古农业大学硕士学位论文，2014”，该方法操 作简单，按照流程可以重复再现。本发明分离纯化获得了大量的内蒙古白 绒山羊毛囊来源干细胞，且经过成脂诱导、成骨诱导、成神经诱导以及毛 囊来源干细胞标记基因检测，鉴定为毛囊干细胞。

绒山羊毛囊干细胞可以在体内外分化为不同类型的细胞。本发明发现 褪黑素对毛囊干细胞的增殖有促进作用，100pg/ml～700pg/ml浓度的褪黑 素对毛囊干细胞增殖均具有促进作用。通过检测诱导分化过程中的毛囊干 细胞标记基因(β1整合素和SOX9)的表达量证明，其中500pg/ml褪黑 素为毛囊干细胞的最适增殖浓度，β1整合素和SOX9基因的相对表达水 平均显著高于其它浓度的褪黑素刺激组。

本发明通过检测褪黑素对毛囊干细胞诱导分化过程中的表皮细胞标 记基因(K1和K10)的表达量变化发现，100pg/ml～300pg/ml浓度的褪 黑素可以促进毛囊干细胞向表皮细胞分化，最适的浓度为300pg/ml，表皮 细胞标记基因K1和K10基因的表达量均显著高于其它浓度的褪黑素刺激 组。而且，300pg/ml褪黑素诱导定向诱导毛囊干细胞3-14天主要得到分 化的表皮细胞，而且诱导7d的效率最佳，表皮细胞标记基因K1和K10 基因的表达量均显著高于其它诱导时间。

本发明定向诱导绒山羊毛囊干细胞向表皮细胞分化的方法中，所述向 绒山羊毛囊干细胞中加入褪黑素进行诱导，包括以下步骤：(1)将绒山 羊毛囊干细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于细胞培养板，补足干细胞培 养液至500μl/孔，培养过夜；(2)次日，更换含有所述浓度褪黑素的干 细胞培养液，培养细胞，即得。其中，所述培养细胞为37℃，5％CO₂， 饱和湿度的培养箱中培养，每隔3-4天换液一次。所述干细胞培养液为： DMEM/F12+10％FBS+1％PS+EGF20ng/mL+ITSl0μl/mL。

本发明方法中，对诱导分化的细胞进行鉴定包括：提取诱导分化的细 胞的总RNA，反转录为cDNA；然后以cDNA为模板进行PCR扩增，例 如采用实时定量PCR扩增，检测表皮细胞标记基因的表达情况；如果检 测到表皮细胞标记基因呈阳性表达，则鉴定诱导分化的细胞为表皮细胞。 其中，所述表皮细胞标记基因为K1基因或K10基因中的任意一种或两种。 研究表明，表皮干细胞表达K19，短暂增殖细胞表达K5和K14，终末分 化细胞表达Kl和K10，因此K1和K10基因可以作为干细胞分化到表皮 细胞的标记物。本发明为保证实验结果真实稳定，用β-actin或GADPH 基因中的任意一种或两种作为内参基因。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明建立了一种外源褪黑素定向诱导绒山羊毛囊干细胞向表皮细 胞高效分化的方法，该方法不仅操作简便，可重复性好，而且为真正意义 上毛囊干细胞体外培养及相关研究应用的开展提供了技术基础，对于毛囊 干细胞体外高效定向诱导的命运决定等相关研究具有重要的意义。

附图说明

图1为毛囊来源干细胞的分离培养(100X)；其中，A：分离的毛囊； B：分离的毛囊；C：毛囊来源干细胞原代培养1h；D：毛囊来源干细胞 原代培养3d；

图2为毛囊来源干细胞的纯化培养(100X)；其中，A：毛囊来源干 细胞P1代6d(纯化前)；B，毛囊来源干细胞P2代6d(纯化后)；

图3为毛囊来源干细胞的传代培养(100X)；其中，A：毛囊来源干 细胞P3代6d；B：毛囊来源干细胞P5代6d；

图4为毛囊来源干细胞形成的单克隆(100X)；其中，A：P3(传代 培养的3代)毛囊来源干细胞单克隆；B：P5(传代培养的5代)毛囊来 源干细胞单克隆；C：P8(传代培养的8代)毛囊来源干细胞单克隆；

图5为毛囊来源干细胞的形态观察；其中，A：毛囊来源干细胞d0 (即第0天)(100X)；B：毛囊来源干细胞d0(即第0天)(400X)； C：毛囊来源干细胞d2(即第2天)(100X)；D：毛囊来源干细胞d2 (即第2天)(400X)；

图6为毛囊来源干细胞的染色观察(100X)；其中，A：毛囊来源干 细胞罗丹明染色；B：毛囊来源干细胞吉姆萨染色；C和D：为毛囊来源 干细胞单克隆罗丹明染色；E：毛囊来源干细胞克隆簇罗丹明染色；F： 毛囊来源干细胞克隆簇吉姆萨染色；

图7为毛囊来源干细胞成脂诱导(200X)；其中，A为FSCs未诱导d8， 未染色；A’为FSCs未诱导d8，油红O染色阴性；B为FSCs成脂诱导d8， 未染色；B’为FSCs成脂诱导d8，油红O染色阳性；C为FSCs未诱导d12， 未染色；C’为FSCs未诱导d12，油红O染色阴性；D为FSCs成脂诱导d12， 未染色；D’为FSCs成脂诱导d12，油红O染色阳性；

图8为毛囊来源干细胞成骨诱导(200X)；其中，A为FSCs未诱导d16， 未染色；A’为FSCs未诱导d16，茜素红染色阴性；B为FSCs成骨诱导d16， 未染色；B’为FSCs成骨诱导d16，茜素红染色阳性；C为FSCs未诱导d21， 未染色；C’为FSCs未诱导d21，茜素红染色阴性；D为FSCs成骨诱导d21， 未染色；D’为FSCs成骨诱导d21，茜素红染色阳性；

图9为毛囊来源干细胞成神经诱导(200X)；其中，A为诱导前的FSCs， 未染色；A’为诱导前的FSCs，尼氏染色阳性；B为FSCs成神经诱导48h， 未染色(200×)；B’为FSCs成神经诱导48h，尼氏染色阳性；C为FSCs成神 经诱导72h，未染色；C’为FSCs成神经诱导72h，尼氏染色阳性；

图10为毛囊来源干细胞成脂诱导(基因检测)；其中，FAS和PPARγ-2 为脂肪细胞发育特异表达基因；β-actin为内参基因；

图11为毛囊来源干细胞成骨诱导(基因检测)；其中，ALPL和COLI 为成骨细胞发育特异表达基因；β-actin为内参基因；

图12为毛囊干细胞成神经诱导(基因检测)；其中，NSE和β-Tubulin Ⅲ为神经细胞发育特异表达基因；β-actin为内参基因；

图13为毛囊来源干细胞标记基因检测；其中，Oct4、Sox2、Nanog 为胚胎干细胞标记物基因；Sox9、integrin-β1、CD34、CD200、CK19、 CK15为毛囊干细胞标记物基因；β-actin为内参；

图14为细胞总RNA的鉴定；各泳道标注分别表示为0pg/ml处理组(空 白对照)，100pg/ml褪黑素刺激组、300pg/ml褪黑素刺激组、500pg/ml 褪黑素刺激组、700pg/ml褪黑素刺激组；

图15为RT-PCR扩增结果；各泳道标注分别表示为0pg/ml处理组(空 白对照)，100pg/ml褪黑素刺激组、300pg/ml褪黑素刺激组、500pg/ml 褪黑素刺激组、700pg/ml褪黑素刺激组；

图16为目的基因片段的PCR扩增结果；其中，A、B、C、D各泳道 标注分别表示为0pg/ml处理组(空白对照)，100pg/ml褪黑素刺激组、 300pg/ml褪黑素刺激组、500pg/ml褪黑素刺激组、700pg/ml褪黑素刺激 组；

图17为整合素(β1-integrin)的测序结果；

图18为Sox9基因的测序结果；

图19为K1基因的测序结果；

图20为K10基因的测序结果；

图21为不同浓度的褪黑素对毛囊干细胞增殖(β1整合素)的促进作 用；其中A、B分别以β-actin和GADPH为内参基因；同一天各组标注** 表示p<0.01，*表示p<0.05；

图22为不同浓度的褪黑素对毛囊干细胞增殖(SOX9)的促进作用； 其中A、B分别以β-actin和GADPH为内参基因；**表示p<0.01，*表 示p<0.05；

图23为不同浓度的褪黑素促进毛囊干细胞向表皮细胞(K1)方向分 化；其中A、B分别以β-actin和GADPH为内参基因；**表示p<0.01， *表示p<0.05；

图24为不同浓度的褪黑素促进毛囊干细胞向表皮细胞(K10)方向 分化；其中A、B分别以β-actin和GADPH为内参基因；**表示p<0.01， *表示p<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明 的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的 精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这 些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、试剂及溶液的配制

DMEM/F12(SH30023.01B，Hyclone)；胎牛血清(FBS)(SV30087.01， Hyclone)；表皮生长因子(EGF)(E9644，Sigma)； Insulin-Transferrin-Selenium(907606，GIBCO)；胰蛋白酶(T4799，Sigma)； Ⅳ型胶原(C5533，Sigma)；青霉素(00212226，华北制药)；链霉素 (03032507，华北制药)；褪黑激素(M5250，Sigma)。

PBS缓冲液的配制：NaCI4g，KCI0.1g，Na₂HPO₄0.575g，KH₂PO₄0.1g溶于500ml三蒸水中，0.22μm过滤除菌，4℃储存。

0.25％胰蛋白酶的配制：胰蛋白酶0.25g，EDTA0.01g，Clucase0.1g， Pyr0.0036g磁力搅拌溶于100mLPBS中，0.22μm过滤，分装，-20℃保 存。

双抗(PS)的配制：青霉素用5m1三蒸水溶解，链霉素用5ml三蒸 水溶解，各取4ml混匀后制成80万单位双抗，0.22μm过滤除菌，分装 -20℃保存。

普通培养液的配制：DMEM/F12+10％FBS+1％PS混匀，4℃储存。

干细胞培养液的配制：DMEM/F12+10％FBS+1％PS+EGF20ng/mL +ITSl0μl/mL，混匀，4℃储存。

Ⅳ型胶原液的配制：每毫克Ⅳ型胶原粉末溶于1ml0.5M的乙酸溶液 中，-20℃储存，使用时0.5M乙酸稀释为50μg/mL。

实施例1绒山羊毛囊干细胞的高效纯化

(1)选取健康的内蒙古白绒山羊(本发明人实验室自购)，用剪毛 剪去荐部皮肤的绒毛，再用刮毛刀剃除干净，暴露皮肤。

(2)碘仿酒精消毒，灭菌镊子提拉皮肤，用无菌的手术剪切取指甲 盖大小的皮肤样本，将其置于PBS缓冲液(含青霉素-链霉素)中迅速带 回实验室。

(3)用无菌手术刀去掉脂肪结缔组织，PBS冲洗3遍，之后加入95％ 乙醇置于超净台中，2-3分钟后生理盐水洗3次，将皮肤样本切成宽约 0.8cm的皮条。

(4)将皮条置于0.2％中性蛋白酶中37℃消化2h左右，接着在体式 显微镜下用镊子将毛囊取下，并切取毛囊中段(见图1A和B)。

(5)将收集好的毛囊中段置于0.25％的胰酶+0.02％EDTA中，37℃， 5％CO₂饱和湿度的培养箱箱中消化30min，不时反复吹打。

(6)用普通培养液中止消化后，1500rpm离心5min收集细胞，添 加培养液后加入到Ⅳ型胶原包被好的60mm培养皿中，放于37℃，5％CO₂培养箱中黏附20min，去除未粘附细胞及其他，添加干细胞培养液培养(见 图1C和D)。对于分离的得到的细胞进行显微观察发现：在细胞中既存 在克隆样生长的毛囊来源干细胞，也存在非毛囊来源干细胞的生长，且毛 囊来源干细胞与其它细胞之间存在明显的界限(见图2A)。为了去除非毛囊 来源干细胞的干扰，将毛囊来源干细胞进行纯化。

(7)将培养着的毛囊来源干细胞用0.25％胰蛋白酶消化，添加适量 普通培养液制成细胞悬液。

(8)取少量细胞悬液，台盼蓝染色后计算活细胞数，然后做连续倍 数稀释。

(9)先制备浓度为1000个细胞/mL的细胞悬液，经百倍稀释，即为 10个细胞/mL，再经2倍稀释，即为5个细胞/mL。

(10)而后采用96孔板有限稀释法将稀释好的细胞悬液以每孔 0.15mL接种于96孔板中，对毛囊来源干细胞进行纯化培养。

(11)隔日显微镜观察找出只有一个细胞的孔，继续培养。

(12)即可获得在96孔板中生长的毛囊来源干细胞单克隆，克隆边 缘比较整齐且细胞大小一致(见图2B)。

(13)一周之后，待细胞克隆铺至皿底1/3～1/2时，进行扩大培养(见 图3-图4)，且经过鉴定为毛囊干细胞(见图5-图13)，具体实验方法见 文献“内蒙古白绒山羊毛囊来源干细胞的分离鉴定及其褪黑素受体基因 cDNA的克隆，王宏，内蒙古农业大学硕士学位论文，2014年6月”。

实施例2外源褪黑素诱导绒山羊毛囊干细胞定向分化为表皮细胞

1、实验方法

1.1毛囊干细胞的解冻

常规方法解冻毛囊干细胞(本发明实施例1纯化培养)，即从液态中 取出毛囊干细胞37℃水浴解冻后1500rpm离心5min，弃上清后，向离心 管中加入1ml的干细胞培养液重悬细胞，接种到用IV胶原处理好的60mm 培养皿中，次日换液。

1.2褪黑素对毛囊干细胞的刺激诱导浓度

(1)待毛囊干细胞长到80％汇合时，弃掉培养皿中的干细胞培养液， 用PBS清洗两次后，加入0.25％的胰蛋白酶消化。

(2)显微镜下观察待有大量细胞悬浮后加入含血清10％的干细胞培养 液终止消化，然后用移液枪轻轻吹打使未悬浮的细胞，然后将细胞悬液移入 离心管中，1500rpm离心5min并收集细胞。之后将收集的细胞重悬并计数。

(3)将计数的细胞悬液以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于24孔培养板中， 补足干细胞培养液至500μl/孔。次日，将24孔培养板的细胞随机的分配为5 组：空白对照组(0M褪黑素)、100pg/ml褪黑素刺激组、300pg/ml褪黑素 刺激组、500pg/ml褪黑素刺激组、700pg/ml褪黑素刺激组。并更换对应干细 胞培养基，放置于37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养，每隔3-4天换 液一次。

1.3褪黑素对毛囊干细胞的刺激诱导时长

(1)完成一个完整细胞生长周期(即21天)的刺激诱导。

(2)提取褪黑素未刺激之前与刺激之后的d1、d3、d5、d7、d14及d21 (即第1、3、5、7、14、21天)各组细胞总RNA，用来检测诱导分化过程 中的毛囊干细胞标记基因(β1整合素和SOX9)、表皮细胞标记基因(K1和 K10)的表达量变化情况。为保证实验结果真实稳定，特使用β-actin和GADPH 双内参。

1.4诱导分化为表皮细胞的表面标记的分子鉴定

1.4.1总RNA的提取

(1)弃掉培养皿中液体，在培养皿中加入适量PBS洗2-3遍，尽量 吸干残余液体。在二十四孔板中每孔加入0.5mlRNAisoPlus细胞裂解液， 放置5分钟后用无酶枪头轻轻吹打，至无细胞团时将细胞匀浆移入无酶离 心管中。

(2)室温下静置5min，加入与无酶离心管比较后1/5体积的氯仿， 剧烈震荡混匀，使其充分乳化；

(3)室温静置5min，12000g4℃离心15min。

(4)将上清液移入新无酶离心管中(切勿吸出白色中间层)，加入 等体积异丙醇；上下颠倒无酶离心管充分混匀，室温静置10min。

(5)12000g4℃离心10min。

(6)小心弃去上清，缓慢延壁管加入1ml75％乙醇(切勿触及沉淀)， 轻轻上下颠倒数次。

(7)12000g4℃离心5min。

(8)弃掉乙醇，尽量弃干，室温下开盖放置2-5min，待乙醇挥发干 净时加入适量无酶水溶解RNA沉淀，待沉淀完全溶解后于80℃保存。注 意：(在整个提取RNA的过程中要求整个操作过程用到的器材必须是灭 过菌的，枪头离心管都必须是无酶的)。

1.4.2细胞总RNA的鉴定

浓度测定、纯度分析和完整性鉴定：吸取所提取的RNA利用Agilent 2100Bioanalyser，检测其浓度含量、OD260/OD280的比值和其完整性。 1.4.3RT-PCR扩增

RNA反转录cDNA体系见表1。

表1反转录PCR反应体系

反应条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃。

1.4.4荧光定量PCR引物设计与合成

根据Genbank中所公布的的各个基因序列，利用Priemer5.0软件设 计引物，由上海生工公司合成(见表2、3)。

表2定量PCR引物序列(干性基因)

表3定量PCR引物序列(表皮细胞基因)

1.4.5目的基因片段PCR扩增

(1)PCR反应体系及条件

表4PCR反应体系

(2)PCR扩增反应条件：

(3)电泳

各基因PCR产物20μL点在2％琼脂糖凝胶上，电压120V，电流110 A电泳45min左右，凝胶成像系统观察并拍摄照片。对扩增基因进行测 序。

1.4.6Real-timePCR检测各基因的表达

(1)目的基因标准曲线的绘制

利用获得的目的片段为模板，进行浓度的稀释进行实时定量PCR反 应，分别绘制各目的基因的标准曲线，具体反应体系见表5：

表5相对定量PCR反应体系

各目的基因实时定量PCR扩增条件：

Stage1：预变性，95℃，30s；

Stage2：PCR反应，95℃，30s，A℃，30s，72℃，30s，40cycle；

Stage3：熔解曲线，60℃～95℃，每秒上升0.5℃。

(2)各目的基因在各组中的表达检测

以空白对照组及不同浓度褪黑素处理的毛囊干细胞在d0、d1、d3、 d5、d7、d14、d21的cDNA为模板，对个基因进行了实时定量PCR扩增， 每个样本设三个重复。同时记录各基因在PCR过程中的扩增曲线和溶解 曲线。

计算公式：

①扩增效率E＝10^-1/Slope。(Slope：斜率)

②％效率＝(E-1)×100％。

％效率∈[80％---120％]属于有效扩增；％效率∈[90％---105％]属于优 化扩增。

③

△Ct＝Ct(目的基因)-Ct(内参基因)

④

△△Ct＝△Ct(SP组)-△Ct(对照组)

2、实验结果

2.1细胞总RNA的鉴定

鉴定结果表明(图14)，所提取的RNA纯度较高，完整性好。

2.2RT-PCR扩增

RNA反转录cDNA的结果见图15。

2.3目的基因片段PCR扩增

目的基因片段PCR扩增结果见图16。

2.4扩增基因的测序结果

整合素(β1-integrin)的测序结果见图17；Sox9基因的测序结果见图 18；K1基因的测序结果见图19；K10基因的测序结果见图20。

通过测序表明，扩增基因为所设计的目的基因。

2.5褪黑素对毛囊干细胞的刺激结果

(1)100pg/ml～700pg/ml浓度的褪黑素对毛囊干细胞增殖(β1整合 素和SOX9)均具有促进作用，其中，500pg/ml为最适增殖浓度(图21- 图22)。

(2)褪黑素可以促进毛囊干细胞向表皮细胞(K1和K10)方向分化 的最适浓度为300pg/ml(图23-图24)。300pg/ml褪黑素诱导刺激毛囊干 细胞3-14天均会得到分化的表皮细胞，但刺激7d效率最佳。