口山酮化合物及其制备方法、药物组合物和用途

摘要

本发明涉及口山酮化合物及其制备方法、药物组合物和用途，涉及天然化合物领域，特别是涉及两种可从云树中提取获得的具有如下结构式的新化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药及其制备方法、药物组合物和用途：

说明书

技术领域

本发明涉及天然化合物领域，特别是涉及一种口山酮类化合物及其制备方法、药物组合 物和用途。

背景技术

恶性肿瘤是当前威胁人类健康和生命的主要疾病。在大多数发达国家，肿瘤是仅次 于心血管病的第二大死亡原因。肿瘤也是严重危害我国人民健康的重大疾病，我国的肿 瘤研究也受到政府的重视，控制肿瘤已成为我国卫生战略重点之一。

肿瘤的治疗方法包括外科手术和放化疗。当前临床应用的抗肿瘤药物的突出问题是 有效率低、选择性差(毒性大)和对耐药性肿瘤的不敏感。另外，复发和转移也是肿瘤 治疗的难点。因此，研究选择性好、疗效高、靶点明确以及对非靶器官无副作用的抗肿 瘤药物是药学工作者的重大研究课题。

云树(GarciniacowaRoxb.)是金丝桃科藤黄属的植物。分布于安达曼群岛、中南 半岛、孟加拉、印度、马来群岛以及中国大陆的云南等地。

发明内容

本发明的目的旨在提供两种可从云树中提取获得的抗肿瘤化合物及其制备方法和用途。

具体地说，本发明的第一方面是提供了一种化合物A，或其药学上可接受的盐、水合物 或前药，所述化合物A可从云树中提取获得且具有下列结构式(Ⅰ)：

本发明的第二方面是一种化合物B，或其药学上可接受的盐、水合物或前药，所述化合 物B可从云树中提取获得且具有下列结构式(Ⅱ)：

本发明的第三方面是提供了一种上述化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

a)首先将云树用丙酮浸泡提取，然后减压浓缩丙酮提取液至无丙酮味，再用二氯甲烷萃 取浓缩液，减压浓缩二氯甲烷萃取液得浸膏；

b)对所得浸膏进行硅胶柱层析分离：以二氯甲烷与甲醇按1:0～0:1的体积比形成的混合 溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；

c)对所收集的流份进行反相硅胶柱层析分离：以甲醇与水按65:35～90:10的体积比形成 的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，浓缩，干燥。

本发明的第四方面是提供了一种防治肿瘤的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的 上述化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药。

在一优选例中，所述肿瘤选自宫颈癌、胰腺癌和肺癌中的一种或多种。

本发明的第五方面是提供了一种防治肿瘤的保健品，所述保健品包含有效量的上述化合 物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药：

在一优选例中，所述肿瘤选自宫颈癌、胰腺癌和肺癌中的一种或多种。

本发明的第六方面是提供了上述化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备 肿瘤细胞细胞周期阻滞诱导剂中的应用。

在一优选例中，所述肿瘤细胞选自Hela宫颈癌细胞、PANC-1人胰腺癌细胞株和A549 人非小细胞肺癌细胞中的一种或多种。

本发明还提供了上述化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备预防或治疗 肿瘤的药物或保健品中的应用。

在一优选例中，所述肿瘤选自宫颈癌、胰腺癌和肺癌中的一种或多种。

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述， 本发明的特点、目的和优势将更为明显。

具体实施方式

本发明的问世是基于这样一个意外发现：从云树中提取的两种新的口山酮类化合物A和 B可以显著抑制多种肿瘤细胞的生长且可诱导肿瘤细胞的细胞周期发生阻滞。因此，化合物 A和B有望开发成为一种可预防或者治疗肿瘤的药物或保健品。

进而，本发明首先提供了一种具有下列结构式(Ⅰ)的化合物A和具有下列结构式(Ⅱ) 化合物B：

本发明还提供了上述化合物相应的所有药学上可以接受的盐、水合物或前药。这些盐可 以由化合物中带正电荷的部分(例如，胺基)与具有相反电性的带负电荷(例如，三氟醋酸) 形成；或者由化合物中带负电荷的部分(例如，羧基)与正电荷(例如，钠、钾、钙、镁) 形成。化合物可以含有一个非芳香性的双键，具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合 物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合 物、顺式或反式异构体存在。所有这些异构体都是可预期的。所述的“本发明的化合物的前 药”通常指一种物质，当用适当的方法施用后，可在受试者体内进行代谢或化学反应而转变 成本发明的化合物或其盐。

本发明的上述化合物可通过本领域的常规方法如醇提、层析等从藤黄属植物如云树 (GarciniacowaRoxb.)等中提取获得，亦可通过商业途径购买或者利用市售原料，通 过现有技术中传统的化合物合成方法合成获得。本领域的普通技术人员根据现有公知技 术可以合成本发明的上述化合物。合成的本发明的上述化合物可以进一步通过柱色谱 法、高效液相色谱法或结晶等方式进一步纯化。

合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助 的，并且是现有技术中公知的技术，如R.Larock,ComprehensiveOrganicTransformations, VCHPublishers(1989)；T.W.GreeneandP.G.M.Wuts,ProtectiveGroupsinOrganic Synthesis,3^rdEd.,JohnWileyandSons(1999)；L.FieserandM.Fieser,Fieserand Fieser’sReagentsforOrganicSynthesis,JohnWileyandSons(1994)；andL.Paquette,ed., EncyclopediaofReagentsforOrganicSynthesis,JohnWileyandSons(1995)中都有公 开。

本发明的上述化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药可以有效地抑制多种 肿瘤细胞的生长，故而本发明的上述化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药可 用于制备防治肿瘤的药物和保健品。

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括本发明的化合物A或化合物B， 或其药学上可接受的盐、水合物或前药，与药学上可接受的载体，该药物组合物可用于防治 肿瘤。

本发明还提供了一种药物制剂，该药物制剂包括本发明的化合物A或化合物B，或其 药学上可接受的盐、水合物或前药，该药物制剂可用于治疗肿瘤。

本发明的化合物A或化合物B，或其药学上可接受的盐、水合物或前药在组合物或药 物制剂中的含量例如0.0001-50wt％；较佳的0.001-30wt％；更佳的0.01-20wt％。

治疗有效量(即可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量)的本 发明的化合物A或化合物B与药学上可以接受的载体(用于治疗给药的载体，它们本身并 不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性)可以组成药物制剂，这些药物制剂可以制 备成口服制剂、注射剂、片剂、粉制剂、胶囊剂、分散片、缓释制剂等。

治疗有效量的本发明的药物组合物的用量介于0.001-500mg/kg体重/天之间，任何介于 上述范围之内的用量皆为本发明的药物组合物的有效量。优选的，本发明的药物组合物的用 量介于0.005-300mg/kg体重/天之间；更优选的，本发明的药物组合物的用量介于 0.0l-100mg/kg体重/天之间。所述的“治疗有效量”可用于相关疾病的单一用药或联合用药 治疗。本领域的专业人员能够理解，在实际给药时的用量可高于或低于上述剂量范围。针对 某一对象(如哺乳动物—人)的“治疗有效量”和具体治疗方案可受诸多因素的影响，包括 所用本发明的化合物A或化合物B，或其前药的药效活性、给药对象的年龄、体重、一般 情况、性别、饮食、给药时间、疾病易感性、疾病进程以及收治医师的判断等。所述的“治 疗”指的是给予机体(含有肿瘤、具有肿瘤的症状或者具有肿瘤的前兆)本发明的化合物A 或化合物B，以治疗、减轻、减缓、改变、治愈、影响、改善其肿瘤、肿瘤的症状或肿瘤的 前兆。

本发明的化合物A或化合物B，或其药学上可接受的盐、水合物或前药或其组合物或 其药物制剂可以通过口服、静脉内、肌肉内、皮下、鼻腔内、直肠内等途径给药。固体载体 如：淀粉、乳糖、磷酸二醇、微晶纤维素、黑糖和白陶土，而液态载体如：无菌水、聚乙二 醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性 和所需要的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，如，调 味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

这些活性化合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤 维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还 可在甘油、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制 剂中含有防腐剂以防止微生物的生长。

适用于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射液 或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在 制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物如细菌和真菌的污染和影响。载体可 以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇、它们的适当混合物和植物油。

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述， 本发明的特点、目的和优势将更为明显。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按 照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量 计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较 佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示 的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或 相似特征的一般性例子。

实施例一、制备并鉴定新化合物A和B纯品

a)将云树用丙酮浸泡提取，每次浸泡使用的丙酮体积为云树待提取的云树药材质量的 5倍，每次浸泡一星期，共浸泡提取3次；合并丙酮浸泡提取液，减压浓缩至无丙酮味；采 用二氯甲烷萃取浓缩液4次，减压浓缩二氯甲烷萃取液得浸膏；

b)对所得浸膏采用硅胶柱层析分离：以二氯甲烷与甲醇按1:0-0:1的体积比形成的混合 溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有新化合物A或B的流份；

c)对所收集的流份进行经反相硅胶柱层析分离：以甲醇与水按15:35-90:10的体积比形 成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有新化合物A或B的流份；

d)采用HPLC纯化新化合物A或B：采用waters2535Series，色谱柱XbridgePrepC18 OBDcolumn(19×250mm，5μm)，洗脱液是以乙腈与水按25:75的体积比形成的混合溶液， 且混合溶液中还含有0.1wt％三氟乙酸(TFA)，流速为16ml/min。收集保留时间为12.1分钟 的化合物A和保留时间为15.6分钟化合物B。

化合物A的结构鉴定数据：

CowaxanthoneI(1)

HRESI-MS：393.1326；

UV(MeOH)：λmax(logε)334(3.15)，58(4.45)nm；

IR(KBr)：νmax3440，2973，2919，1647，1633，1587，1442，1288，1188，1122cm^–1；

H¹-NMR(600MHzinCD₃OD)和¹³C-NMR(150MHzinCD₃OD)数据见表1。

化合物B的结构鉴定数据：

CowaxanthoneJ(2)

HRESI-MS：395.1486

UV(MeOH)：λmax(logε)327(3.20)，253(4.61)nm；

IR(KBr)：νmax3419，2919，1649，1608，1585，1284，1207，1159cm^–1；

H¹-NMR(600MHzinCD₃OD)和C¹³-NMR(150MHzinDMSO-d₆)数据见表1。

表1化合物A和化合物B的¹H-NMR、¹³C-NMR数据

实施例二、采用MTT法验证新化合物A和B的体外活性

在细胞水平上检测新化合物A或B对多种肿瘤细胞的生长抑制作用。

实验材料：

人肿瘤细胞株及其培养：Hela宫颈癌细胞、PANC-1人胰腺癌细胞株、A549人非小细胞 肺癌细胞株及HL-7702人肝细胞株等均购自中科院生化细胞研究所。细胞于含10％胎牛血清 (Gibco)的RPMI-1640(Gibco)培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养。

新化合物A和B按实施例1的方法制备并纯化；其他试剂：MTT及DMSO等均为Sigma 公司产品。

实验方法：

新化合物A和B对上述多种肿瘤细胞株的细胞毒性通过MTT法测得。具体步骤如下：

1.样品制备：将新化合物A或B分别溶解月DMSO中，得到浓度为1mg/ml的溶液；

2.细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，经胎盘蓝染 色排除法计或细胞数，并调节细胞悬浮液密度至1×10⁵细胞/ml。

3.在平底96孔板中，每孔加入100微升细胞，每孔中细胞总数为1×10⁴。于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。

4.每孔加入5微升以细胞生长培养基稀释的样品，使反应终浓度分别为0、0.3、1、3、 10、30和100ug/ml。经相应量的DMSO加入不加药的细胞中作为对照，不加药物及DMSO 的含细胞孔作为背景。每点做三个平行实验。

5.将加药细胞在37℃、5％CO₂细胞培养箱中保温48小时。

6.每孔中加入10ul5mg/mlMTT溶液，继续在培养箱中保温3-4小时。

7.将细胞板于1000rpm离心15分钟，真空吸去培养液，加入150ulPBS洗涤后离心并小 心地吸去溶液。

8.每孔加入150ulDMSO，置于摇床上以150rpm摇动15分钟，使生成的甲簪晶体充分 溶解。测定492nm光吸收值。

9.根据光吸收值计算新化合物A或B处理后细胞相对存活率。

细胞相对存活率＝(药物处理组的光吸收值－背景吸收值)/(DMSO处理组的光吸收 值－背景吸收值)

表2新化合物对三种癌株的细胞毒性(IC₅₀(μM))

由表2可见：新化合物A或B对Hela宫颈癌细胞、PANC-1人胰腺癌细胞株以及A549 人非小细胞肺癌细胞株的生长均具有明显抑制作用，强于阳性对照药Etoposide(依托泊甙)， 抗肿瘤活性显著，可望作为活性成分用于制备抗肿瘤药物制剂，具有药用前景。

实施例三、采用流式细胞术验证新化合物A和B影响细胞周期的活性

取对数生长期HeLa宫颈癌细胞以1×10⁶/mL接种于6孔板中，接种体积为2ml，置37℃、 5％CO₂孵箱中培养24h；分别设细胞对照组和3个浓度的实验组(15、5、1.67μM)；培养 24h后吸取培养液，加入胰酶消化，并用PBS洗一次；加入4℃70％乙醇固定30分钟后，用 PBS润洗并加入RNase(10μg/ml)，37℃孵育15分钟；最后加入碘化丙啶(propidiumiodide) 并用FACSCalibur(BD，美国)检测细胞周期。检测结果见表3所示。

表3新化合物A和B对Hela细胞细胞周期的影响

由表3可见：化合物A能诱导HeLa细胞S期阻滞，作用效果呈浓度依赖性提高。化合 物B能诱导HeLa细胞阻滞于G2/M期，抗肿瘤活性显著。两者均有望作为活性成分用于制 备抗肿瘤药物制剂，具有药用前景。

本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神 之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申 请所附权利要求的覆盖范围。