基于InDel标记的常规稻品种淮稻5号和淮稻18号的鉴定方法

摘要

本发明属生物鉴别技术领域，具体为一种基于InDel标记的常规稻品种淮稻5号和淮稻18号的鉴定方法，利用粳稻品种日本晴与籼稻品种93-11的全基因组DNA序列的比对而获得插入/缺失差异片段所设计的24对特异DNA引物，对淮稻5号和淮稻18号进行DNA提取、DNA片段扩增和电泳分离以及电泳图谱的分析来鉴定淮稻5号和淮稻18号品种。具体而言，利用24对InDel引物组合，对基于聚合酶链式反应和凝胶垂直板电泳获得的指纹图谱进行分析，根据24个InDel位点的电泳带型，进而确定是否是常规稻品种淮稻5号和淮稻18号。本发明需用检测样品量少，方法简便快捷，鉴定结果准确，应用到市场上对淮稻5号和淮稻18号的品种进行真伪鉴定。

说明书

技术领域

本发明属于生物鉴别技术领域，涉及一种基于InDel标记的常规稻品种淮稻5号和淮稻18号的鉴定方法，即一种利用水稻DNA插入或缺失分子标记鉴定常规稻品种淮稻5号和淮稻18号的方法。

背景技术

栽培稻（OryzasativaL.）是世界上最重要的粮食作物之一，具有丰富的遗传多样性。水稻品种鉴定对于水稻遗传研究和品种培育具有重要意义。已经报道的鉴定水稻品种的方法多为粳稻和籼稻亚种的鉴定，如以形态鉴定为基础的“程氏指数法”（包括六个性状：稃毛、酚反应、穗节长、稻壳色、叶毛和谷粒长宽比）和基于分子标记的粳稻-籼稻鉴定方法等。对某一具体品种是否为特定的水稻品种进行鉴定的方法则限于SNP芯片的一种方法，但SNP芯片价格昂贵，分析周期较长，后续的数据处理繁琐，不能当天得到检测结果。

淮稻5号系江苏省徐淮地区淮阴农科所选育而成，是一个集高产、稳产、优质于一体的迟熟中粳稻新品种。2000年通过江苏省审定，审定编号为苏种审字第358号。该品种株型较紧凑，茎秆粗壮抗倒。叶片挺立。分蘖性中上等，最高茎蘖数28万/亩。茎蘖生长整齐，成穗率高达80％以上。穗粒协调，一般每亩成穗数22万，每穗总粒数为110－130粒，结实率90％以上，千粒重28克左右。对白叶枯病、稻瘟病、纹枯病均表现良好的抗性，稻曲病轻。全生育期150天左右，与武育粳3号相仿。后期转色好，熟色熟相俱佳，较难脱粒。米质优良，米饭洁白有光泽，口感好。适合我省淮南地区中上等肥力条件下种植。

淮稻18号由江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所和淮阴师范学院以淮66/徐23121杂交，于2010年育成，属迟熟中粳稻品种。适宜江苏省苏中地区及宁镇扬丘陵地区种植。该品种株型紧凑，长势较旺，穗型中等，分蘖力较强，叶色中绿，后期灌浆快，熟色好，抗倒性较强；省区试平均结果：每亩有效穗22.4万，每穗实粒数114.1粒，结实率93.8%，千粒重28.3克，株高96.0厘米，全生育期154.6天，比对照淮稻9号迟熟2天。病害鉴定：穗颈瘟损失率3级、穗颈瘟综合抗性指数4.25，中感白叶枯病，抗纹枯病、条纹叶枯病，米质理化指标经农业部食品质量检测中心2014年检测：整精米率73.7%，垩白率11%，垩白度3.2%，胶稠度69毫米，直链淀粉含量18.2%，达到国标三级优质稻谷标准。

淮稻5号和淮稻18遗传背景相似，可能在生产中产生品种混淆，用传统形态鉴定方法时间周期长，出错机率高，有必要建立基于基因型的快速鉴定方法。

InDel标记（insertion-deletionlengthpolymorphism），也叫插入缺失长度多态性，是由于碱基序列的相对插入或者缺失造成的，在基因组中分布广泛，长度从一个核苷酸到几百甚至几万不等。对InDel标记临侧保守的序列设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示InDel位点在不同个体间的多态性，从而达到鉴定的目的。与应用较广的SSR标记相比，InDel标记具有以下优点：（1）数量十分丰富，广泛分布于各条染色体上；（2）是共显性标记，符合孟德尔遗传规律；（3）设计简单，易于操作，技术重复性好，结果可靠。

发明内容

针对传统形态观察难区分品种差异的技术缺陷，本发明的目的是提供一种基于InDel标记的常规稻品种淮稻5号和淮稻18号的鉴定方法，通过开发的24对特异性引物用以鉴定常规稻品种淮稻5号和淮稻18号，旨在快速鉴定某特定品种是否为新培育的优质常规稻品种淮稻5号和淮稻18号，对待鉴定品种进行基因组DNA的提取，使用本研究报道的特定引物对组合对其进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色，当天即可得到品种的鉴定结果，高效、准确、可靠。

本发明是通过以下技术方案实现的：利用粳稻品种日本晴与籼稻品种93-11的全基因组DNA序列的比对而获得插入/缺失差异片段所设计的24对特异DNA引物，对淮稻5号和淮稻18号进行DNA提取、DNA片段扩增和电泳分离以及电泳图谱的分析来鉴定淮稻5号和淮稻18号品种；具体而言，利用24对InDel引物组合，对基于聚合酶链式反应和凝胶垂直板电泳获得的指纹图谱进行分析，根据24个InDel位点的电泳带型，进而确定是否是常规稻品种淮稻5号和淮稻18号；其特征是：基于InDel标记的常规稻品种淮稻5号和淮稻18号的鉴定用InDel特异引物对对应如下列表所述：

编号引物对名称正向引物序列 （5'->3'）反向引物序列（5'->3'）1_1chr01-1gttgttcagtcaaaagtttcagctccttatgtgaagtggaagtataac1_2chr01-2atcggtagcactaaatctttccgatagggttttaggtttttcgag2_1chr02-1gtaagactagctgtttcaatcacaggtatgaggtatagacatgggagaac2_2chr02-2agttgagatgaatagctagatggagaacttgaggaggatcggtatc3_1chr03-1ggatcaagtagcacgataagcacctattggttgtgtgtcttgtag3_2chr03-2tgtctcattcagagtatggagttcttagattggagctatagttgaggac4_1chr04-1cattgacttttcaacacattggcataaatttccaggccatatactac4_2chr04-2aacaaccgaaaggtatatgacacgaatccttaaaattgtaccgtagtg5_1chr05-1gaactcttgctcttcatagaaaatgtaatactcatcctctccgatcc5_2chr05-2cctaaaacctttatcccaaagcgatcatgtagaaatgaacggc6_1chr06-1cacttagacagcacaaaaatataccactaattaaagtcgacacatgacag6_2chr06-2ctaatttgctacacttctgtcgtctgtaaagcatatagcaccaagttac7_1chr07-1gtgtgccagttatatttcactttagctgagttgacattgagaaaacaatc7_2chr07-2gcgatcaaagtctataaaacatctgatatctgcagtagctgtcaaaaag8_1chr08-1ttctattaaagtcacaaggctcacaatacaggcatatctaaaggttgtc8_2chr08-2gtaaagtttgtgtgttcaaaggagagtcgagtacgtctatcacacatc9_1chr09-1tagggtgttgtataaatggtattgcccattagtttacatgtggaatgtc9_2chr09-2cacatttcgttgtcttatctgagatctttgacctggcactcttac10_1chr10-1ggtaaaactaatcatatcgaggaagtactgttatatgttggatggtgaac10_2chr10-2gacgatcttaaactaaaacatgagcatccaacaacaggatattactatgg11_1chr11-1agtgagaaccaatgttgagatgcattataaaagaacccatagagagc11_2chr11-2aactaaacccataagtcagtgtagcctattcactactcacctaccatgtc12_1chr12-1atcctatatcatgtgtttcacaccatatcactttgacctttttccctc12_2chr12-2cttagcctcttctgttgaaaattggcaactgaaactacatgactagaag

上述基于InDel标记的常规稻品种淮稻5号和淮稻18号的鉴定方法包括步骤如下：

步骤一、选取水稻植株的任何器官或组织提取总DNA；

步骤二、用引物对扩增步骤一所述DNA；

步骤三、对步骤二所述扩增的产物进行凝胶电泳分析，24个位点的结果完全一致，则为常规稻品种淮稻5号和淮稻18号。

其中，步骤一中，所述提取总DNA具体是指用CTAB法提取核基因组DNA。

其中，步骤二中，所述扩增体系：20μL，包括30-50ng的模板的DNA，0.25个单位的DNA聚合酶（申能博彩），2.0μL的10×Buffer（含Mg²⁺），2.0mMdNTPs2μL；

所述扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸7min。

其中，步骤三中，凝胶电泳分析具体为：加入适量上样缓冲液于步骤二所述扩增的产物中，在22V/cM恒定电场强度下，经12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳100分钟后，银染显色；含有水稻DNA的样品在前述24对引物组合时，能分别在不同位点（引物对）上扩增出现明显的多态性带型（下面的两条主带和上面的重组带）。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、利用水稻全基因组特异位点上的InDel片段差异设计的特异引物，籼-粳杂合带型来鉴定常规稻淮稻5号和淮稻18号，方法简便，样品用量少，准确性高，速度快；

2、基于PCR扩增反应，利用籼-粳稻24个位点上的InDel片段序列差异和PCR反应的快速高效性，在短时间内能精确鉴定常规稻品种淮稻5号和淮稻18号，方法简便、快捷，有很好的应用推广前景；

3、对InDel标记旁邻保守的序列设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示InDel位点在不同个体间的多态性，从而达到鉴定的目的；

4、使用的聚合酶链式扩增体系为常规PCR体系，不需要特殊的PCR仪和特殊的反应试剂，任何公司生产的PCR仪和任何生物试剂公司生产的试剂均可使用而达到目的。

附图说明

通过阅读参照附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为PCR电泳图，泳道1至泳道7分别为水稻品种9311、II优084、淮稻18号、粤泰A、粤优938、淮稻5号、日本晴；从图1可以看出，淮稻18号基因型主要为粳稻背景（日本晴），与淮稻5号具有较近的亲缘关系，淮稻18号与淮稻5号仅在引物5-1有差异，也说明本发明具有好的检测特异性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Smbrook等分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

所述水稻24个InDel标记为水稻品种日本晴序列和水稻品种93-11序列所示核苷酸序列，共同构成的DNA序列差异。

实施例1：水稻DNA的抽提

利用该发明所用的引物对和基于PCR扩增进行基因组多态性分析；

使用扩增体系为：20μL，包括30-50ng的模板的DNA，0.25个单位的DNA聚合酶（申能博彩），2.0μL的10×Buffer（含Mg2+），2.0mMdNTPs2μL；

使用扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸7min；

电泳检测：加入适量上样缓冲液于所述扩增的产物中，在22V/cM恒定电场强度下，经12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳100分钟后，银染显色；含有水稻DNA的样品在前述24对引物组合时，能分别在不同位点（引物对）上扩增出现明显的多态性带型。

水稻样品扩增的电泳产物为：1）籼稻参考材料9311；2）II优084；3）淮稻18号；4）粤泰A；5）粤优938；6）淮稻5号；7）粳稻参考材料日本晴。

实施例2：水稻品种淮稻5号和淮稻18号基因型鉴定

以本发明下述引物对用于水稻品种淮稻5号和淮稻18号的鉴定；

编号引物对名称正向引物序列 （5'->3'）反向引物序列（5'->3'）1-1chr01-1gttgttcagtcaaaagtttcagctccttatgtgaagtggaagtataac1-2chr01-2atcggtagcactaaatctttccgatagggttttaggtttttcgag2-1chr02-1gtaagactagctgtttcaatcacaggtatgaggtatagacatgggagaac2-2chr02-2agttgagatgaatagctagatggagaacttgaggaggatcggtatc3-1chr03-1ggatcaagtagcacgataagcacctattggttgtgtgtcttgtag3-2chr03-2tgtctcattcagagtatggagttcttagattggagctatagttgaggac4-1chr04-1cattgacttttcaacacattggcataaatttccaggccatatactac4-2chr04-2aacaaccgaaaggtatatgacacgaatccttaaaattgtaccgtagtg5-1chr05-1gaactcttgctcttcatagaaaatgtaatactcatcctctccgatcc5-2chr05-2cctaaaacctttatcccaaagcgatcatgtagaaatgaacggc6-1chr06-1cacttagacagcacaaaaatataccactaattaaagtcgacacatgacag6-2chr06-2ctaatttgctacacttctgtcgtctgtaaagcatatagcaccaagttac7-1chr07-1gtgtgccagttatatttcactttagctgagttgacattgagaaaacaatc7-2chr07-2gcgatcaaagtctataaaacatctgatatctgcagtagctgtcaaaaag8-1chr08-1ttctattaaagtcacaaggctcacaatacaggcatatctaaaggttgtc8-2chr08-2gtaaagtttgtgtgttcaaaggagagtcgagtacgtctatcacacatc9-1chr09-1tagggtgttgtataaatggtattgcccattagtttacatgtggaatgtc9-2chr09-2cacatttcgttgtcttatctgagatctttgacctggcactcttac10-1chr10-1ggtaaaactaatcatatcgaggaagtactgttatatgttggatggtgaac10-2chr10-2gacgatcttaaactaaaacatgagcatccaacaacaggatattactatgg11-1chr11-1agtgagaaccaatgttgagatgcattataaaagaacccatagagagc11-2chr11-2aactaaacccataagtcagtgtagcctattcactactcacctaccatgtc12-1chr12-1atcctatatcatgtgtttcacaccatatcactttgacctttttccctc12-2chr12-2cttagcctcttctgttgaaaattggcaactgaaactacatgactagaag

利用InDel分子标记鉴定水稻品种9311、II优084、淮稻18号、粤泰A、粤优938、淮稻5号、日本晴；

使用扩增体系为：20μL，包括30-50ng的模板的DNA，0.25个单位的DNA聚合酶（申能博彩），2.0μL的10×Buffer（含Mg²⁺），2.0mMdNTPs2μL；

使用扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，32个循环；最后72℃延伸7min；

电泳检测：加入适量上样缓冲液于所述扩增的产物中，在22V/cM恒定电场强度下，经12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳100分钟后，银染显色；含有水稻DNA的样品在前述24对引物组合时，能分别在不同位点（引物对）上扩增出现明显的多态性带型。

水稻样品扩增的电泳产物为：1）籼稻参考材料9311；2）II优084；3）淮稻5号和淮稻18号；4）粤泰A；5）粤优938；6）淮稻5号；7）粳稻参考材料日本晴。

图1：利用本发明的24对引物对的组合（电泳条带包括两条主带和重组带）对淮稻5号和淮稻18号进行准确的鉴定，单独某个引物对并不具有说服力。

由上述结果可见，同一水稻品种在24个InDel特异位点上表现出的籼稻和粳稻基因型是不一样的，淮稻5号和淮稻18号主要为粳稻基因带型，通过对所有特异位点带型的读取记录和统计，确定样品是否为淮稻5号和淮稻18号。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。