高分子量普鲁兰多糖的高产菌株及利用该菌株生产高分子量普鲁兰多糖的方法

摘要

本发明涉及高分子量普鲁兰多糖的高产菌株及利用该菌株生产高分子量普鲁兰多糖的方法，所述高产菌株的分类命名为出芽短梗霉（Aureobasidium？pullulans）SWP35，于2015年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？NO.11602；将4℃斜面该菌转接到PDA培养基培养，将菌块接种于种子培养液培养制得种子液，以1~5%（V/V）接种于发酵培养液，于装液量40~70%的气升式发酵罐中发酵，发酵液后处理得到白色的普鲁兰多糖产品。本发明所用培养基无有机氮源，一方面降低培养基成本，另外一方面减少培养基中色素，缓解发酵后处理中普鲁兰多糖酒精脱色的压力，得到的出芽短梗霉CGMCC？No.11602能够发酵生产Mw>2？560？000的普鲁兰多糖，同时产量达到35g/L以上。

说明书

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种高分子量普鲁兰多糖的高产菌株及利用该菌株生产高分子量普鲁兰多糖的方法。

背景技术

普鲁兰多糖（Pullulan），又称短梗霉多糖、茁霉多糖，是由出芽短梗霉（Aureobacidiumpullulans）分泌的一类水溶性胞外中性多糖。该多糖是以α-1,6-糖苷键连接的聚麦芽三糖（含有少量麦芽四糖），一般没有分支结构，是直链多糖。普鲁兰多糖独特的糖苷键连接方式使得它具有高度的结构柔韧性及良好的水溶性，因而拥有其它多糖所没有的、独特的、优异的物理特性，包括良好的粘结性能、成纤维性、成膜性和可塑性。同时，普鲁兰多糖易进行化学改性以改变其水溶性或提供活性反应基团。因此，普鲁兰多糖及其衍生物被广泛地用于食品、医药、化工及电子等众多领域，是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品。

目前，普鲁兰多糖主要的应用是作为食品添加剂、胶囊材料及化妆品原料。近年来，由于普鲁兰多糖具有良好的生物相容性、高分子本身及降解产物均无毒、降解速度可控、适当的机械性能、优良的可成型性等特性，在药物包埋载体、微胶囊制备材料、组织工程应用和医药封装高分子材料中的应用研究获得大量关注。作为高分子生物材料，分子量及其分布是微生物多糖的重要参数，影响其应用产品（如组织工程支架等）的物理机械性能和降解速率。另一方面，高分子量产品可以显著提高溶液粘度。因此，生产高分子量的普鲁兰多糖可以大大拓展普鲁兰多糖应用领域，提高产品附加值。

微生物发酵是普鲁兰多糖主要的生产方法，因菌种的差异、培养基成分、发酵条件的不同，普鲁兰多糖的分子量也有很大的变化。关于不同分子量普鲁兰多糖的发酵生产方法也有很多报道。专利97121608.8公开一种发酵生产普鲁兰多糖的新方法，生产的普鲁兰多糖平均分子量为10万道尔顿；专利200810052070.6公开的一种生产普鲁兰多糖的发酵方法得到分子量20-60万道尔顿之间的普鲁兰多糖；专利200910148764.4公开了一种生产不同分子量普鲁兰多糖的方法，通过调节发酵培养基中有机氮源和无机氮源的浓度能够生产平均分子量在8万-48万之间的普鲁兰多糖。从这些及其他已公开的普鲁兰多糖生产方法的报道中，生产的普鲁兰多糖的分子量都较低，均在60万道尔顿以下，极大限制了普鲁兰多糖的生产和应用。目前，文献中仅有山东福瑞达生物科技有限公司（专利申请号：201210555219.9）通过调节培养基中磷酸盐的浓度和初始pH，得到分子量从50万到200万的普鲁兰多糖，但其针对高分子量普鲁兰多糖的产量未见报道，也没有针对不同分子量产品设计不同的培养方案。

由于高分子量普鲁兰多糖发酵液具有很高的粘度，尤其在发酵后期表现出典型的非牛顿性流体特性，从而影响到发酵后期的氧的传递，这也决定了整个发酵工艺的特殊性。目前，普鲁兰多糖的生产多采用机械搅拌式发酵罐；然而在高分子量普鲁兰多糖发酵后期会出现严重的溶氧限制，在搅拌桨外发酵液几乎处于静止状态，为了改善搅拌效果，不得不以消耗大量的电力为代价。

发明内容

本发明的目的是提供一种高分子量普鲁兰多糖的高产菌株及利用该菌株生产高分子量普鲁兰多糖的方法，能大量获得高分子量普鲁兰多糖。

本发明所采用的技术方案为：

高分子量普鲁兰多糖的高产菌株，其特征在于：

所述高产菌株的分类命名为出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans）SWP35，于2015年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.11602。

利用所述的高分子量普鲁兰多糖的高产菌株生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于：

包括以下步骤：

（1）菌种活化：

将4℃斜面保藏菌种出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)SWP35转接到PDA培养基，28±2℃培养4~6天；

（2）种子培养：

选取纯培养的平板，使用无菌打孔器和无菌接种针，将菌块接种于种子培养液，于28±2℃，转速200±30rpm条件下培养24~48h，制得种子液；

（3）发酵培养：

将步骤（2）制得的种子液以1~5%（V/V）接种于发酵培养液，于装液量40~70%的气升式发酵罐中发酵，发酵温度28±2℃，通气量为0.5~1.5VVM，发酵60~96h；

（4）发酵液后处理：

发酵液稀释后经板框过滤除菌、澄清过滤、酒精沉淀、酒精洗涤，压滤或离心脱除有机溶剂得固形物，固形物经干燥和粉碎后即可得到白色的普鲁兰多糖产品。

步骤（1）中，PDA培养基的配方如下：

马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L，余量为水；

初始pH自然，121℃，20min灭菌。

步骤（2）中，种子培养液的配方如下：

葡萄糖50g/L，硫酸铵0.6g/L，酵母粉1.7g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸氢二钾5.0g/L；

初始pH6.5，121℃，20min灭菌。

步骤（3）中，发酵培养液的配方如下：

蔗糖50~100g/L，硫酸铵1.2~2.1g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸氢二钾5.0g/L，余量为水；

初始pH6.5，121±5℃，20min灭菌。

本发明具有以下优点：

利用本发明技术方案生产的高分子量普鲁兰多糖产量高（大于35g/L）,重均分子量大于200万，可用于水凝胶、人工骨等组织工程领域；用于食品增稠则可显著降低普鲁兰多糖添加量，降低使用成本。

本发明采用气升式发酵罐生产高分子量普鲁兰多糖，相比搅拌式发酵罐，耗能更低，获得的普鲁兰多糖分子量更高；本发明所用发酵培养基不含有机氮源，培养基成分明确，后提取工艺简单，能够大量获得高分子量普鲁兰多糖，适于工业化生产。

附图说明

图1为实施例一制备普鲁兰多糖红外色谱图。

图2为实施例二制备所得普鲁兰多糖红外图谱。

图3为普鲁兰多糖标准品（Sigma）红外图谱。

图4为普鲁兰多糖分子量标品（Sigma）GPC结果。

图5为通过三阶拟合获得的普鲁兰多糖分子量标准曲线。

图6为实施例一分子量测定图。

图6中，实施例一样品出峰时间为14.278，通过三阶拟合方程估算，制得的普鲁兰多糖分子量Mw=2359232。

图7为实施例二分子量测定图。

图7中，实施例二样品出峰时间为14.067，通过三阶拟合方程估算，获得的普鲁兰多糖分子量为3330502kDa。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

下述内容中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

本发明利用复合诱变技术筛选获得一株高分子量普鲁兰多糖的高产菌株，分类命名为出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans）SWP35，从我国陕西省洛川地区苹果表面分离获得的出芽短梗霉（Aureobsidiumpullulans）SW2009AP5为出发菌株进行紫外和亚硝酸盐复合诱变获得，于2015年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.11602。

利用上述高分子量普鲁兰多糖的高产菌株生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：

将4℃斜面保藏菌种出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)SWP35转接到PDA培养基，28±2℃培养4~6天；

（2）种子培养：

选取纯培养的平板，使用无菌打孔器和无菌接种针，将菌块接种于种子培养液，于28±2℃，转速200±30rpm条件下培养24~48h，制得种子液；

（3）发酵培养：

将步骤（2）制得的种子液以1~5%（V/V）接种于发酵培养液，于装液量40~70%的气升式发酵罐中发酵，发酵温度28±2℃，通气量为0.5~1.5VVM，发酵60~96h；

（4）发酵液后处理：

发酵液稀释后经板框过滤除菌、澄清过滤、酒精沉淀、酒精洗涤，压滤或离心脱除有机溶剂得固形物，固形物经干燥和粉碎后即可得到白色的普鲁兰多糖产品。

步骤（1）中，PDA培养基的配方如下：

马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L，余量为水；

初始pH自然，121℃，20min灭菌。

步骤（2）中，种子培养液的配方如下：

葡萄糖50g/L，硫酸铵0.6g/L，酵母粉1.7g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸氢二钾5.0g/L；

初始pH6.5，121℃，20min灭菌。

步骤（3）中，发酵培养液的配方如下：

蔗糖50~100g/L，硫酸铵1.2~2.1g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸氢二钾5.0g/L，余量为水；

初始pH6.5，121±5℃，20min灭菌。

高分子量普鲁兰多糖高产菌株的获得：

（1）原始菌株SW2009AP5及其特性：原始菌株SW2009AP5是从从我国陕西省洛川地区苹果表面分离获得的出芽短梗霉（Aureobsidiumpullulans）。该菌株在平板上生长时，菌落初期为灰白色，后逐渐转暗至褐色，呈皮革状，有褶皱，菌落湿润，显微观察菌体呈菌丝状。采用含有机氮源培养基液体培养96小时后发酵液颜色呈黄褐色，菌体多呈酵母状，胞外多糖产量达到23.5g/L，蔗糖转化率47%，获得普鲁兰多糖的重均分子量约20万。

（2）诱变菌株的获得：原始菌株SW2009AP5经紫外和亚硝酸复合诱变处理获得诱变菌株SWP35。

1）孢子悬液的制备：将斜面菌种接种于液体培养基中，28℃，230r/min培养48h，达到对数期。放入装有玻璃球的三角瓶中振荡10~15min，打碎孢子团块，以脱脂棉过滤，经过10000r/min离心10min，取无菌生理盐水洗剂两次，采用血球计数板及平板涂布的方法计数，调整孢子浓度到10⁷个/mL，制成供诱变处理的孢子悬液。

2）紫外诱变处理：取以上制备好的孢子悬液5mL于9cm的灭菌平皿中。15W紫外灯打开预热20min，将盛有孢子悬液的平皿放到磁力搅拌器上，距离灯管20cm，打开皿盖，照射1~4min，边搅边照射。处理后的孢子悬液在超净工作台内进行不同倍数稀释，然后涂布平板，培养3天观察结果，计算致死率，并挑选那些生长快，菌落大，菌落周边呈稠厚胶状，颜色淡化的菌株进行保藏，采用含有机氮源培养基进行产普鲁兰多糖能力的评估。

3）亚硝酸盐诱变处理：经过紫外诱变处理筛出菌株制备孢子悬液2mL，加入1mL0.1mol/LNaNO₂溶液，再加入1mL1mol/LpH4.5醋酸缓冲液（NaNO₂浓度为0.025mol/L），28℃保温30~120min。处理一定时间后，取2mL处理液加入pH8.6的Na₂HPO₄溶液，调整pH为7.0，诱变作用终止。按不同倍数稀释后涂平板，培养3天观察结果，计算致死率，并挑选生长快、菌落大、菌落周边呈稠厚胶状、颜色淡化的菌株进行保藏，采用不含有机氮源培养基进行产普鲁兰多糖能力的评估。

4）诱变菌株产普鲁兰多糖能力评估：将2）或3）中筛选的菌株分别接种到种子培养基中，在28℃，220r/min下，振荡培养48h，以5%的接种量接入发酵培养基中，28℃、220r/min下发酵4d，测定普鲁兰多糖的产量、纯度以及分子量，复筛出高分子量普鲁兰多糖高产菌株swp35。

5）发酵培养基分为含有机氮源培养基和不含有机氮源培养基。含有机氮源培养基用于紫外诱变处理后菌株的产普鲁兰多糖能力评估；不含有机氮源培养基用于亚硝酸盐诱变处理后菌株的产普鲁兰多糖能力评估。

含有机氮源培养基：蔗糖50g/L，硫酸铵0.6g/L，酵母粉1.7g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸氢二钾5.0g/L；

不含有机氮源培养基：蔗糖100g/L，硫酸铵0.6g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸氢二钾5.0g/L。

（3）诱变菌株swp35特性：该菌株在平板上生长时，菌落颜色为白色，菌落呈圆形，中心隆起，表面光滑，菌落湿润，显微观察菌体呈菌丝状。采用不含有机氮源培养基液体培养96小时后发酵液颜色呈浅粉色，菌体多呈酵母状，胞外多糖产量达到32.8g/L，蔗糖转化率32.8%，获得普鲁兰多糖的重均分子量达到200万以上。

实施例一：

（1）将4℃斜面保藏菌种出芽短梗霉（Aureobsidiumpullulans）CGMCCNo.11602使用PDA培养基活化，活化温度28℃，活化时间4天；

（2）通过无菌打孔器和接种针，将纯培养的菌块接种于种子培养液（配方同上），28℃，转速200rpm条件下培养48h，制得种子液；

（3）将制备好的种子液按照5%（V/V）的量接种于装有200mL发酵培养液的1L三角瓶中，其中培养基成分为：蔗糖75g/L，硫酸铵1.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸氢二钾5.0g/L，初始pH6.5，121℃灭菌20min，转速180rpm摇床28℃发酵培养96h；

（4）使用等体积的水将发酵液稀释1倍，搅拌均匀，转速6000rpm，常温离心20min，弃沉淀留上清液，将所得发酵液上清进行硅藻土澄清过滤，去除离心过程中未去除掉的细微固形物；

（5）在澄清滤液中加入1.5倍体积的95%工业酒精沉淀，沉淀操作温度为25℃，沉淀时间为5小时；离心分离，固形物再用少量95%工业酒精洗涤1次，抽滤脱除有机溶剂得固形物，固形物经真空干燥和粉碎后得到普鲁兰多糖产品；

（6）出芽短梗霉（Aureobsidiumpullulans）CGMCCNo.11602发酵生产普鲁兰多糖产量为30g/L，普鲁兰酶酶解后采用DNS法分析麦芽三糖含量表明制备所得普鲁兰多糖纯度达到96.8%。红外色谱测定表明，制备所得普鲁兰多糖与Sigma标品普鲁兰多糖红外图谱一致；GPC测定表明，重均分子量235万。

实施例二：

（1）将4℃斜面保藏菌种出芽短梗霉（Aureobsidiumpullulans）CGMCCNo.11602使用PDA培养基活化，活化温度28℃，活化时间4天；

（2）通过无菌打孔器和接种针，将纯培养的菌块接种于种子培养液（配方同上），28℃，转速200rpm条件下培养48h，制得种子液；

（3）将制备好的种子液按照5%（V/V）的量接种于装有7L发酵培养液的10L气升式发酵罐中，其中培养基成分为：蔗糖100g/L，硫酸铵1.8g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钠1.0g/L，磷酸氢二钾5.0g/L，初始pH6.5，121℃灭菌20min，28℃，通气量1VVM，罐压0.5Mpa，发酵培养72h；

（4）在储罐中使用等体积的水将发酵液稀释1倍，搅拌均匀，采用板框过滤处理去除菌体，然后采用硅藻土过滤机对所得发酵液上清进行澄清过滤；

（5）在澄清滤液中加入1.5倍体积的95%工业酒精沉淀，沉淀操作温度为20℃，沉淀时间为5小时；采用压滤使固液两相分离，固形物再用少量上述相应乙醇洗涤1次，压滤脱除有机溶剂得固形物，固形物经真空干燥和粉碎后得到普鲁兰多糖产品；

（6）出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans）CGMCCNo.11602发酵生产普鲁兰多糖产量为35g/L，普鲁兰酶酶解后采用DNS法分析麦芽三糖含量表明制备所得普鲁兰多糖纯度达到97.5%。红外色谱测定表明，制备所得普鲁兰多糖与Sigma标品普鲁兰多糖红外图谱一致；GPC测定表明，制备所得普鲁兰多糖重均分子量333万。

本发明所用培养基无有机氮源，一方面降低培养基成本，另外一方面减少培养基中色素，缓解发酵后处理中普鲁兰多糖酒精脱色的压力。采用该培养基，出芽短梗霉CGMCCNo.11602能够发酵生产Mw>2560000的普鲁兰多糖，同时产量达到35g/L以上。在以往的研究中，通常都是牺牲产量换取高分子量，从而造成生产成本偏高，本授权使用的菌株无色素，采用气升式发酵罐，减少搅拌产生的能源消耗，生产的普鲁兰多糖在满足高分子的同时，保证高产，适合作为新型超高分子聚合物在生物材料、药物载体、美容等领域进行产业化开发。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。