用于制备去甲伪麻黄碱的方法

摘要

本发明涉及用于制备去甲伪麻黄碱（(1S,2S)–去甲伪麻黄碱）的方法，其中在第一反应步骤中借助(S)-选择性裂解酶使苯甲醛与式(1)的乙酰基给体反应生成式(2)和(3)的对映异构体混合物，，并且在第二步骤中借助(S)-选择性转氨酶使式(3)的化合物与胺给体反应生成(1S,2S)–去甲伪麻黄碱。

说明书

本发明涉及用于制备去甲伪麻黄碱（Cathin）的方法。

去甲伪麻黄碱（(1S,2S)–去甲伪麻黄碱）可以由卡塔叶灌木的叶片获得，并且通常用作食欲抑制剂。由于交感神经的刺激植物性神经系统的功能，其用作心血管药物。

对于合成制备，根据现有技术已知各种方法。

例如在出版物“StereoselectiveSynthesisofNorephedrineandNorpseudoephedrinebyUsingAsymmetricTransferHydrogenationAccompaniedbyDynamicKinticResolution”，Hyeon-KyuLee等人，JournalofOrganicChemistry2012，第5454-5460页已知一种7步合成。

出版物“EfficientSynthesisofEphedraAlkaloidAnalogousUsinganEnantiomericallyPureN-[(R)-(+)-α-Methylbenzyl]aziridine-2-carboxaldehyde”，Gwon-IlHwang等人，J.Org.Chem.1996，61，6183-6188公开了一种以高的对映异构体过量制备去甲伪麻黄碱的方法，其来源于对映异构体纯物质且是非常昂贵的。

如在MasaakiNishimura等人的出版物“AsymetricN1UnitTransfertoOlefinswithaChiralNitridomanganeseComplex:NovelStereoselectivePathwaystoAziridinesorOxazolines”中描述的其它方法公开了其中形成去甲伪麻黄碱作为副产物的方法。

因此本发明的目的是提供去甲伪麻黄碱的简单的制备方法，其克服现有技术缺点，实现少的反应步骤，且是成本有利的，实现高的对映异构体纯度和非对映异构体纯度以及高的产率和需要尽可能少的后处理步骤。该方法可以简单地更大规模地转化。

以权利要求1的上位概念为出发点，该目的根据本发明通过权利要求1所标示部分中给出的特征来实现。

使用本发明的方法，可以以>99%的对映异构体纯度和70%，在一个有利的实施方案中最多97%的非对映异构体纯度制备去甲伪麻黄碱。可以实现90%的转化率。在此可以使用可商业购得的反应物。该方法需要少的后处理步骤，可以很高地标度（skalieren）并且可以以一锅法反应的形式进行。

本发明有利的扩展实施方案示于从属权利要求中。

以下应以其普遍形式描述本发明。

在本发明的意义上，(S)-选择性酶是导致(S)-构型产物的酶。

在第一反应步骤中，在体外借助(S)-选择性裂解酶使苯甲醛与式(1)的乙酰基给体反应生成式(2)和(3)的化合物的对映异构体混合物，

其中缩写PAC表示苯基乙酰基甲醇。

式(1)的乙酰基给体在此可以是乙醛，其中R=H；或可以是丙酮酸，其中R=COOH。

反应路线示例性展示于图1中。

裂解酶可以例如是来自醋菌，尤其巴氏醋酸杆菌（Acetobacterpasteurianus）的(S)-选择性裂解酶，特别是变体ApPDC-E469G。

优选使用提纯和亲脂化的酶。该亲脂化的优点是，酶是稳定的，并且可以使用高的酶浓度，此外提纯的酶导致明显更高的光学纯度，即产物的更高的对映异构体过量和非对映异构体过量。

此外，可以使用用于(S)-选择性裂解酶的辅因子，其提高转化率。

例如，可以使用例如硫酸镁或氯化镁形式的镁离子与二磷酸硫胺素作为辅因子。

在使用硫酸镁和二磷酸硫胺素作为辅因子的情况下，对于硫酸镁优选1-5mM的浓度范围，优选2.5mM，对于二磷酸硫胺素优选5-300μM的浓度范围，优选100μM。

该反应可以在5至8，优选6至7.5的pH-值下进行。

对此例如可以使用磷酸钾-缓冲剂。然而也可以考虑诸如HEPES、MOPS、TEA或TRIS-HCl的缓冲剂。

优选的温度范围为室温，然而也可以在20℃至30℃，特别是25℃下很好地进行该反应。

优选在大气压下进行该反应。

替代地，可以在体内进行该酶促反应。这具有优点，即可以成本有利地制备作为催化剂的酶。

对此，可以使用大肠杆菌作为生产生物体。

在此，可以将为第一步骤中的裂解酶编码的基因连接到载体中。

大肠杆菌菌种优选为重组的，并含有携带用于(S)-选择性裂解酶的基因的质粒。

该质粒可以优选包含用于上述裂解酶的基因。

例如可以使用包含相应的裂解酶基因的pET22b或pKK233-基体（Grundk?rper）作为质粒。

所述生产生物体将所希望的式(2)和(3)的产物分泌到水溶液中。

在本发明方法的一个优选实施方案中，借助苯甲醛裂解酶使不希望的式(2)的化合物反应生成苯甲醛和乙醛。

该反应方案示于图2中。

这具有优点，即该不希望的式(2)的副产物裂解，所产生的苯甲醛和乙醛引回该方法中，所希望的式(3)的产物的产率提高。式3的(S)-PAC的对映异构体过量可以提高至总共>97%。在该步骤中基于所用PAC总量的产率为95%。

在式(2)的化合物反应时，在反应过程中过量添加乙酰基给体是有利的，从而为产生所希望的式(3)的中间化合物的进一步反应提供足够的乙酰基给体。这特别在挥发性乙酰基给体例如乙醛的情况下是有利的。例如可以相对于苯甲醛使用10倍的过量的乙酰基给体。

优选分离所述中间产物。为此，在使用石油醚:乙酸乙酯（90:10）作为分离液体的情况下使用硅胶进行柱色谱法。

在第二反应步骤中，借助(S)-选择性转氨酶使如此获得的式(3)的化合物与胺给体反应生成最终产物去甲伪麻黄碱（(1S,2S)-去甲伪麻黄碱）。该反应示意性示于图3中。

对于化学还原性胺化的第二反应步骤，可以使用转化底物且为(S)-选择性的转氨酶。该转氨酶可以来自色杆菌，例如紫色色杆菌，优选为CV2025。此外，可以使用来自反硝化产碱菌（Alcaligensdenitrificans）、柠檬节杆菌（Arthrobactercitreus）、巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）、荧光假单胞菌（Pseudomonasfluoreszens）、河弧菌（Vibrioflurialis）或新月柄杆菌（Caulobactercrescentus）的转氨酶。

优选使用提纯和亲脂化的酶。该亲脂化的优点是，酶是稳定的，可以使用高的酶浓度，此外提纯的酶导致明显更高的光学纯度，即产物的更高的对映异构体过量和非对映异构体过量。

可以例如使用(S)-α-甲基苄胺、苄胺、异丙胺、L-丙氨酸、(±)-1-甲基-3苯基丙胺或(±)-1-氨基茚满作为胺给体。

可以使用5′-磷酸吡哆醛作为辅因子。

优选为100-200μM的5′-磷酸吡哆醛浓度。

该反应可以在水介质中在6至11的pH-范围中，优选pH7.5至8.5下进行。

对此，可以使用合适的缓冲剂，例如HEPES、磷酸钾、MOPS、TEA或TRIS-HCl。

优选的温度范围为25℃，然而该反应也可以在20℃-30℃下很好进行。

优选在大气压下进行该反应。

替代地，可以用该(S)选择性转氨酶在体内进行该酶促反应。

为此，可以使用大肠杆菌作为生产生物体。

在此可以将为转氨酶编码的基因连接到媒介物中。

该大肠杆菌菌种优选为重组的，并含有携带用于(S)-选择性转氨酶的基因的质粒。

该质粒优选可以包含用于上述转氨酶的基因。

例如可以使用包含相应的转氨酶基因的pET29a或pKK233-基体作为质粒。

该生产生物体将所希望的式(3)的产物分泌到水溶液中。

可以在本发明的方法中在体内仅对于第一或者第二反应步骤或者对于反应步骤1和2两者进行反应。对于各个步骤，可以正如对于体外酶促反应那样选择其余条件。

图4展示了图1和3的步骤的总结。

实施例：

通过在第一步骤中的来自生物体巴氏醋酸杆菌的(S)-选择性裂解酶ApPDC-E469G和在第二步骤中的来自生物体紫色色杆菌的(S)-选择性转氨酶CV2025的组合，成功进行了该2-步合成。在第一步骤中，以约70%的对映异构体纯度使乙醛直接与苯甲醛或使丙酮酸在脱羧成为乙醛之后与苯甲醛连接形成(S)-PAC。在后处理之后的产率为95%，ee为约70%。在第二反应步骤中的产率为95%。总之，可是如此通过这两个反应步骤产生约90%的形成去甲伪麻黄碱的总转化率与ee>99%和de约为70%的光学纯度。

反应条件：

步骤1（裂解酶-反应，图1）：

40mM苯甲醛、400mM丙酮酸、2.5mM硫酸镁、100μm二磷酸硫胺素、0.5mg/mLApPDC-E469G（提纯的亲脂化的酶）、100mM磷酸钾-缓冲剂，25℃，反应时间48h。随后进行萃取和柱色谱提纯产物（(S)-PAC）。产率为95%。替代地，也可以用乙醛代替丙酮酸进行该反应，和/或用整个细胞代替提纯的酶进行该反应，在该整个细胞中酶ApPDC-E469G过表达地存在。

步骤2（转氨酶反应，图3）

10mM(S)-PAC、10mM(S)-α-甲基苄胺、1mg/ml提纯的酶，25℃，100mMHEPES与0.1mM5′-磷酸吡哆醛，pH7.5，反应时间24h。转化率为95%。替代地，也可以用亲脂化的整个细胞催化该反应，其中该(S)-选择性转氨酶过表达地存在。

通过该裂解酶反应之后的额外步骤，可以任选地提高中间体（(S)-PAC）的对映异构体纯度。向提纯的(S)-PAC（ee约70%）中添加丙酮酸、ApPDC-E469G和来自生物体荧光假单胞菌的苯甲醛裂解酶。该苯甲醛裂解酶催化由(R)-PAC形成苯甲醛和乙醛的选择性裂解反应。所产生的苯甲醛类似于反应步骤1用作底物，该底物用于接着由酶ApPDC-E469G催化苯甲醛和丙酮酸的碳连接反应（Carboligationsreaktion）以形成(S)-PAC。当苯甲醛裂解酶和ApPDC-E469G均存在于反应配方（Reaktionsansatz）中时，如此可以将产物的ee提高到ee>97%(S)PAC。基于该步骤中所用PAC的总量计，产率为>91%。

提高图2中的(S)-PAC的对映异构体纯度：

a)11.2mM(S)-PAC（ee约70%）、200mM丙酮酸、2.1mg/mLApPDC-E469G、2mg/mLBAL（苯甲醛裂解酶）、2.5mM硫酸镁、100μM二磷酸硫胺素、100μM磷酸钾-缓冲剂，25℃，反应时间：48h。产率：91.6%，ee（(S)-PAC）=97.4%。

b)20.7mM(S)-PAC（ee约70%）、300mM丙酮酸、2.1mg/mLApPDC-E469G、2mg/mLBAL（苯甲醛裂解酶）、2.5mM硫酸镁、100μM二磷酸硫胺素、100μM磷酸钾-缓冲剂，25℃，反应时间48h。产率93.7%，ee（(S)-PAC）=96.7%。