一种筛选天然产物中具有遗传毒性的成分的方法

摘要

本发明提供了一种筛选天然产物中具有遗传毒性的成分的方法，该方法基于DNA加合物技术，利用高效液相色谱-质谱联用法进行检测，能够高效的筛选天然产物中具有遗传毒性的成分。

说明书

技术领域

本发明属于中医药领域，涉及检测天然产物中具有遗传毒性的成分的方法，具体地说本发明涉及一种利用DNA加合物检测发现天然产物中具有遗传毒性成分的方法。

背景技术

DNA加合物是亲电性的化合物或其代谢产物和生物体内DNA分子形成共价相连的化合物，是DNA化学损伤的最重要和最普遍的形式。这种加合物一旦逃避自身的修复，就可能成为致突、致畸、致癌的最小因子。因此DNA加合物的形成被认为是致肿瘤过程的一个重要起始阶段。研究表明许多化学品的致突变、致畸及致癌效应与DNA加合物的形成有关。通过DNA加合物与致突变和致癌关系的研究，人们认识到DNA加合物可能是化学致癌物与癌症之间的一个分子桥梁。

研究DNA加合物有助于理解化学有毒物的致癌致突变的分子生物学机制。另一方面，DNA加合物的发现对于药物的致癌、致突变性来说可能具有早期发现和诊断的意义。目前已被发现产生DNA加合物的成分包括马兜铃酸(AA)和吡咯里西啶生物碱(PAs)等。天然产物中具有繁多的组分，而且大部分组分含量很少，很难通过常规的方法来检测或筛选具有遗传毒性的成分。因此，本领域技术人员致力于开发能够高效地筛选天然产物中具有遗传毒性成分的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选天然产物中具有遗传毒性的成分的方法及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种检测天然产物中具有遗传毒性的成分的方法，包括步骤：

配制反应体系并进行温孵反应，所述反应体系包括：待测样本、脱氧核苷和同位素标记的脱氧核苷；

终止反应后，采用高效液相色谱-质谱联用法检测反应体系中DNA加合物的形成。所述方法包括，采用高效液相色谱-质谱联用法获取反应体系中各种物质的分子量；如果在质谱图中存在准分子离子相差为n的物质X和物质X’(即，n＝物质X'准分子离子-物质X准分子离子)，n为脱氧核苷和同位素标记的脱氧核苷的分子量差值，则初步判定该物质X为可形成DNA加合物的成分(即，指示了有遗传毒性的成分)。进一步地，所述方法包括步骤：获取该物质X和物质X’的子离子的准分子离子，如果存在相差为n的物质X的子离子和物质X’的子离子，则可以进一步判定所述物质X为具有遗传毒性的成分。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(1)DNA加合物的初步筛选

配制反应体系，所述反应体系包括：待测样本、肝微粒体(包括肝S9)、脱氧核苷、同位素标记的脱氧核苷和还原型辅酶Ⅱ；

将所述反应体系在37℃条件下孵育进行反应；

反应完成后加入等体积冰乙腈终止反应；

HPLC-MS/MS检测DNA加合物的形成。

在另一优选例中，所述待测样本为天然提取物，所述天然提取物中包含至少1种(优选地≥3种；更优选地≥5种；最优选地≥8种)成分(化合物)。

在另一优选例中，步骤(1)中加入等体积冰乙腈终止反应后，离心、过滤，或经过固相萃取柱等方法进行处理。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(2)：

(2)配制包括待测样本、肝微粒体(或动物肝S9)、小牛胸腺DNA和还原型辅酶Ⅱ的反应体系；将所述反应体系在37℃条件下孵育进行反应；反应完成后提取DNA；酶解或酸水解，固相萃取，HPLC-MS/MS检测DNA加合物的形成；

所述待测样本为步骤(1)检测获得的能够形成DNA加合物的物质(物质X)。

在另一优选例中，所述步骤(1)的反应体系中，各组分的含量如下：

待测样本浓度≥20μg/ml；肝微粒体蛋白浓度≥0.1mg/ml；脱氧核苷含量≥20μg/ml；同位素标记的脱氧核苷含量≥20μg/ml；还原型辅酶Ⅱ或氧化型辅酶-Ⅱ含量0.5-2.0mmol/L。

在另一优选例中，所述步骤(1)的反应体系中，各组分的含量如下：

待测样本浓度为20μg/ml～5mg/ml(优选为，0.4mg/ml～1.0mg/ml)；肝微粒体蛋白浓度为0.1mg/ml～5mg/ml(优选为1.0mg/ml～3.5mg/ml)；脱氧核苷含量为20μg/ml～5mg/ml(优选为，1.0mg/ml～3mg/ml)；同位素标记的脱氧核苷含量为20μg/ml～3mg/ml(优选为，0.5mg/ml～2mg/ml)；还原型辅酶Ⅱ或氧化型辅酶-Ⅱ含量0.8mmol/L～1.5mmol/L(优选为，1mmol/L)。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，孵育反应时间为1-24h。

在另一优选例中，所述步骤(2)的反应体系中，各组分的含量如下：

待测样本浓度≥20μg/ml；肝微粒体蛋白浓度≥0.1mg/ml；小牛胸腺DNA含量≥0.5mg/ml；还原型辅酶Ⅱ含量为1mmol/L。

在另一优选例中，所述步骤(2)的反应体系中，各组分的含量如下：

待测样本浓度为20μg/ml～5mg/ml(优选为，0.4mg/ml～1.0mg/ml)；肝微粒体蛋白浓度为0.1mg/ml～5mg/ml(优选为，1.0mg/ml～3.5mg/ml)；小牛胸腺DNA含量为0.1mg/ml～5mg/ml(优选为，0.5mg/ml～3mg/ml)；还原型辅酶Ⅱ或氧化型辅酶-Ⅱ含量0.8mmol/L～1.5mmol/L(优选为，1mmol/L)。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，孵育反应时间为1-24h。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，酶解中使用的酶选自：脱氧核糖核酸酶、核酸酶P1、碱性磷酸酶、磷酸二酯酶、或其组合；优选地，酸水解使用的酸选自甲酸、盐酸或其组合。

在另一优选例中，所述高效液相色谱-质谱联用法包括高效液相色谱-三重四级杆质谱和高效液相色谱-高分辨质谱；优选地，所述高效液相色谱-三重四级杆质谱采用中性丢失扫描检测DNA加合物；优选地，利用高效液相色谱-高分辨质谱的质量亏损过滤技术，或精确中性丢失检测DNA加合物；优选地，高效液相色谱包括高效液相色谱、超高效液相色谱、nano-高效液相色谱及二维高效液相色谱等；优选地，在与小牛胸腺DNA的反应中，HPLC-MS采用高效液相色谱-三重四级杆质谱的多反应监测(MRM)或高效液相色谱-高分辨质谱以精确分子量进行检测。

在另一优选例中，所述同位素选自：碳同位素、氮同位素、氧同位素、氢同位素或其组合。

在另一优选例中，所述同位素标记的脱氧核苷中含有一个或多个同位素标记。

在另一优选例中，所述还原型辅酶Ⅱ包括NADPH，或NADP⁺及其再生系统。

在另一优选例中，所述脱氧核苷包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、脱氧胸苷及其三磷酸物(包括其金属盐)。

在另一优选例中，所述待测样本为天然产物。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(3)对能够形成DNA加合物的成分进行提取分离。

在另一优选例中，所述待测样本为植物提取物，优选为中药植物提取物。

在另一优选例中，所述待测样本为中药提取物。

在另一优选例中，所述植物选自下组：独活、和丹参。

在另一优选例中，所述具有遗传毒性的成分为蛇床子素、或丹参酮IIA。

本发明的第二方面，提供了一种检测中药或提取物中有遗传毒性成分的试剂盒，所述试剂盒中包括：肝微粒体(或肝S9)、脱氧核苷、同位素标记的脱氧核苷和还原型辅酶Ⅱ(或氧化型辅酶Ⅱ)及还原型辅酶Ⅱ再生系统所需试剂。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：小牛胸腺DNA。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括酶解试剂，所述酶解试剂选自：脱氧核糖核酸酶、核酸酶P1、碱性磷酸酶、磷酸二酯酶、或其组合。

本发明的第三方面，提供了一种检测独活提取物的遗传毒性的方法，所述方法包括步骤：检测独活提取物中蛇床子素的含量。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)测定所述独活提取物中蛇床子素的含量C2，并与预定值C0进行比较；

(b)当所述含量C2高于C0时，则判定所述产品的质量不合格；当所述含量C2低于或等于C0时，则判定所述产品的质量合格。

在另一优选例中，所述C2为蛇床子素在所述独活提取物中的重量百分比。

在另一优选例中，所述C0≤10％(w/w)，优选地，所述C0≤5％(w/w)，更优选地，所述C0≤1％，所述C0可以为0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、5％、10％。

本发明的第四方面，提供了一种检测丹参提取物的遗传毒性的方法，所述方法包括步骤：检测丹参提取物中丹参酮IIA的含量。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)测定所述丹参提取物中丹参酮IIA的含量D2，并与预定值D0进行比较；

(b)当所述含量D2高于D0时，则判定所述产品的质量不合格；当所述含量D2低于或等于D0时，则判定所述产品的质量合格。

在另一优选例中，所述D2为丹参酮IIA在所述丹参提取物中的重量百分比。

在另一优选例中，所述D0≤10％(w/w)，优选地，所述D0≤5％(w/w)，更优选地，所述D0≤1％，所述D0可以为0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、5％、10％。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了蛇床子素DNA加合物HPLC-MS检测的结果。a.蛇床子素+脱氧核苷中性丢失扫描质谱图；b.蛇床子素疑似加合物[M+H]⁺产物离子图；c.蛇床子素疑似加合物[M+Na]⁺产物离子图；d.蛇床子素疑似加合物[M+Na]⁺同位素峰产物离子图；e.蛇床子素与小牛胸腺DNA反应体系中DNA加合物多反应监测(MRM)图。

图2显示了丹参酮ⅡA-DNA加合物HPLC-MS检测的结果。a.丹参酮ⅡA+脱氧核苷中性丢失扫描质谱图；b.丹参酮ⅡA疑似加合物[M+H]⁺产物离子图；c.丹参酮ⅡA疑似加合物[M+H]⁺同位素峰产物离子图；d.丹参酮ⅡA与小牛胸腺DNA反应体系中DNA加合物多反应监测(MRM)图；e.DNA加合物多反应监测阴性对照。

图3显示了彗星试验研究丹参酮ⅡA对HepG2细胞遗传毒性结果。a为丹参酮ⅡA实验组；b.阴性对照组。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种筛选天然产物中具有遗传毒性的成分的方法，该方法基于脱氧核苷和同位素标记的脱氧核苷在分子量上的差值，利用高效液相色谱-质谱联用法进行检测，能够高效的筛选天然产物中具有遗传毒性的成分，在此基础上完成了本发明。

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种利用高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)检测DNA加合物，从而筛选天然产物中具有遗传毒性的成分。

本发明提供了一种通过检测DNA加合物的形成来筛选天然产物中具有遗传毒性的成分的方法。利用高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)进行DNA加合物检测，高效液相色谱-质谱联用法包括高效液相色谱-三重四级杆质谱及高效液相色谱-高分辨质谱，优选地所述高效液相色谱-三重四级杆质谱采用中性丢失扫描检测DNA加合物，利用高效液相色谱-高分辨质谱的质量亏损过滤技术，或精确中性丢失检测DNA加合物。对形成DNA加合物的成分进行分离，得到具有遗传毒性的成分。

如本文所用，术语“高效液相色谱-质谱联用法”包括高效液相色谱-三重四级杆质谱及高效液相色谱-高分辨质谱，其中所述高效液相色谱-三重四级杆质谱采用中性丢失扫描检测DNA加合物，利用高效液相色谱-高分辨质谱的质量亏损过滤技术，或精确中性丢失检测DNA加合物。并且根据检测到的DNA加合物的准分子离子和产物离子信息分析该DNA加合物的结构，及形成DNA加合物的成分结构信息，并对该成分进行分离。

本发明的筛选天然产物中具有遗传毒性的成分的方法，包括以下步骤：①疑似DNA加合物的发现：孵育体系中加入肝微粒体，欲检测的天然产物，脱氧核苷，同位素标记的脱氧核苷，还原型辅酶Ⅱ，37℃孵育，加入等体积冰乙腈终止反应，离心，过滤，HPLC-MS检测，疑似加合物应同时具有相应的同位素峰，对疑似加合物的离子进行产物离子扫描；②验证：孵育方法同上，以小牛胸腺DNA代替脱氧核苷及同位素标记的脱氧核苷，37℃孵育后，高速离心，取上清液，提取DNA，酶解，固相萃取，HPLC-MS检测，与步骤①制备的样品进行比较，分析目标成分或提取物是否能在体外与小牛胸腺DNA形成DNA加合物，如果在天然产物提取物中检测到DNA加合物，就对提取物进行分离，将分离后的各成分按步骤①操作(不加同位素标记的脱氧核苷)，直至分离得到能形成疑似加合物的成分。并对该成分进行遗传毒性研究。

本发明的主要优点在于：

(1)使用本发明的方法能够高效的检测出天然产物中具有遗传毒性的成分；

(2)针对天然产物成分复杂、活性成分含量低的特点，本发明的检测方法，样品需求量少，操作简单，检测结果准确。

(3)本发明的方法可用于高效的发现DNA加合物。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1独活中遗传毒性成分的筛选

独活为伞形科植物重齿毛当归AngelicapubescensMaxim.f.biserrataShanetYuan的干燥根，具有祛风除湿，通痹止痛的功效，临床用于风寒湿痹，腰膝疼痛，少阴伏风头痛，风寒挟湿头痛等。本发明人对北豆根提取物及其所含蛇床子素、花椒毒素，补骨脂素，伞形花内酯，二氢欧山芹素当归酸酯进行了研究。蛇床子素、花椒毒素，补骨脂素，伞形花内酯，二氢欧山芹素当归酸酯结构如下：

a.蛇床子素；b.花椒毒素；c.补骨脂素；d.伞形花内酯；e.二氢欧山芹素当归酸酯。

1.1独活提取物及对照品疑似DNA加合物检测

独活药材100g，粉碎，过筛，10倍量的80％乙醇提取2次，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加双蒸水稀释，过滤，滤液加至已活化的D101大孔树脂柱，双蒸水洗脱，洗脱液弃去，再分别用20％、40％、60％、80％、95％乙醇洗脱，减压浓缩洗脱液。

将各部分洗脱浓缩液及蛇床子素、花椒毒素、补骨脂素、伞形花内酯、二氢欧山芹素当归酸酯，作为待测样本，分别进行检测：

分析条件色谱条件AgilentProshellC18色谱柱(4.6mm*50mm，2.7μm)；流动相为乙腈-0.2％乙酸(25：75)；体积流量0.4mL/min；柱温30℃；进样量2μL。

质谱条件电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描；检测方式：中性丢失扫描(116u，ce值为10，20，30ev)及产物离子扫描；干燥气温度350℃；干燥气体积流量10L/min；雾化器压力45psi(1psi＝6.895kPa)；鞘气温度400℃；鞘气体积流量11L/min。

孵育体系0.5ml，加入大鼠肝微粒体2mg/ml，分别加入待测样本0.5-1mg、脱氧腺苷2mg、同位素标记的脱氧腺苷(15N₅)0.5mg，还原型辅酶Ⅱ1mmol/L，磷酸盐缓冲液补足体积至0.5ml，体系中有机溶剂含量不超过5％，37℃孵育3h，加入同体积冰乙腈停止反应，涡旋振荡，3000r离心10min，0.22μm微孔滤膜过滤，高效液相色谱-三重四级杆质谱采用中性丢失扫描进行检测。同时设立对照组，对照组中不添加脱氧核苷及同位素标记的脱氧核苷。

检测结果如图1所示，结果表明，在60％、80％、95％洗脱液及蛇床子素孵育体系中均检测到疑似DNA加合物。在花椒毒素、补骨脂素、伞形花内酯、二氢欧山芹素孵育体系中未检测到DNA加合物。独活60％、80％、95％洗脱液孵育体系中，检测到的疑似DNA加合物[M+H]⁺m/z493.9，同位素峰m/z498.0，[M+Na]⁺m/z515.8，同位素峰m/z520.9，在蛇床子素孵育体系中也检测到疑似DNA加合物[M+H]⁺m/z493.9，同位素峰m/z498.0，[M+Na]⁺m/z515.8，同位素峰m/z520.9。

在同时设立的未加脱氧核苷及同位素标记的脱氧核苷对照组中未检测到相应疑似加合物，在未加同位素标记的脱氧核苷对照组中，未检测到相应同位素峰。

通过对比保留时间和产物离子信息，发明人发现独活3个洗脱液孵育体系中检测到的疑似DNA加合物与蛇床子素孵育体系中的疑似DNA加合物的保留时间和产物离子均相同，因此确定独活提取物孵育体系中检测到的疑似DNA加合物由蛇床子素或其代谢产物形成。[M+H]⁺m/z493.9的产物离子m/z377.8，为[M+H]⁺脱去脱氧核糖的碎片离子；m/z135.9，为脱氧核苷碱基的碎片离子；m/z242.9，为蛇床子素的片段离子。[M+Na]⁺m/z515.8的产物离子m/z400.2，为[M+Na]⁺m/z515.8脱去脱氧核糖的碎片离子；[M+H]⁺m/z493.9的产物离子为m/z377.8；m/z157.9，为脱氧核苷碱基碎片离子的加钠峰，m/z265.1，为蛇床子素碎片离子的加钠峰。[M+Na]⁺同位素峰m/z521.5的产物离子m/z405.2，比[M+Na]⁺m/z515.8脱去脱氧核糖的碎片离子形成的m/z400.2多5u，为其同位素峰，m/z243.0为为蛇床子素的片段离子，m/z265.1，为蛇床子素碎片离子的加钠峰，m/z163.0为脱氧核苷碱基m/z157.9碎片离子的同位素峰。由上可见，该疑似加合物由脱氧核苷和蛇床子素两部分组成。

1.2蛇床子素与小牛胸腺DNA的反应

孵育体系0.5ml，加入小牛胸腺DNA0.5mg，还原型辅酶Ⅱ1mmol/L，蛇床子素0.5mg，磷酸盐缓冲液补足体积，体系中有机溶剂含量不超过5％，37℃孵育3h，按组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)说明书记载方法提取DNA。取100μgDNA，加入脱氧核糖核酸酶I(DnaseI)15μL(20mg/Ml，4℃，现用现配，生工生物工程(上海)股份有限公司，600U)，35μL10mMMgCl2和10mMTris缓冲液，用10mMTris缓冲液补体积至200μL。37℃孵育2h后向酶解体系中加入197μL0.2MTris和2μL磷酸二酯酶I(100mU/μL，-20℃，生工)和1.3μL碱性磷酸酶(1.25U/μL，4度冰箱，sigma)。孵育24h后取出，进行固相萃取。CleanertPEP-2固相萃取柱(1ml)，活化：固相萃取柱加1ml甲醇洗脱后，再加1ml双蒸水洗脱，将酶解后的DNA样品上到活化后的固相萃取柱中，1ml双蒸水洗脱，洗脱液弃去，再用1ml甲醇洗脱，洗脱液吹干，加100μl甲醇定容，过滤，HPLC-MS采用多反应监测(MRM)进行检测。同时设立对照组，对照组中不添加蛇床子素。

检测结果如图1所示，在蛇床子素与小牛胸腺DNA的反应体系中，检测到了相应加合物。表明蛇床子素在孵育体系中与小牛胸腺DNA能形成DNA加合物。

1.3Ames试验(细菌回复突变试验)研究蛇床子素的致突变作用

选取TA98和TA100两个菌株。试验前均经鉴定合格。采用Ames微量波动试验考察蛇床子素的致突变作用。-S9条件下，TA98和TA100菌株的阳性对照分别2-Nitroflucrene4μg/mL和Nitrofurantoin0.25μg/mL；在+S9条件下，TA98和TA100菌株的阳性对照均为2-aminoanthracene，浓度分别为2和5μg/mL。取10μL供试品液、240μL暴露培养基与菌液的混合液加入24孔板中，每个剂量3复孔，置于37℃恒温摇床150rpm/min，孵育90min。孵育结束后，每孔加入2.8mL指示培养基，混合均匀，每孔取50μL加到384孔板中，每孔对应加48个孔(384板孔)。将384孔培养板置于设定在37℃恒温培养箱培养约48-72h。培养到期后，取出培养板，用肉眼观察菌落进行计数，黄色孔为回复突变的菌落生长孔，紫色孔为无突变菌落的生长孔。蛇床子素采用1.3、10.30、100、300μg/ml浓度(在1000和5000μg/mL剂量下有严重沉淀，在300μg/mL有少量沉淀。故不设定1000和5000μg/mL剂量)，

有效试验标准：至少应包含4个可用于结果分析的剂量；TA98菌株阴性对照的回复突变孔数平均值≤10个/48孔，TA100菌株阴性对照的回复突变孔数平均值≤12个/48孔，阳性对照的回复突变孔数平均值≥25个/48孔。

评价突变作用标准

(1)将阴性对照组的回复突变孔数的Mean+SD值设为baseline，所有测试组的回复突变孔数平均值小于baseline2倍，判为阴性。

(2)测试组的回复突变孔数平均值大于baseline2倍，则进行Student'st-test(1sided，unpaired)检测，仍无显著意义，则可判为阴性。若具有显著性差异(P<0.05)可参照剂量关系和生物学意义，供试品所诱发的回复突变孔数出现浓度依赖性的增加或在多个浓度组上出现可重复性的增加，可判断阳性。

结果

(1)阴性对照组和阳性对照组的回复突变孔数平均值均符合要求。

(2)在供试品加样处理过程中，蛇床子素在300μg/mL剂量下有少量沉淀产生，在≥1000μg/mL剂量下有较多沉淀产生。

(3)蛇床子素在各剂量下对TA100菌株均未发生回复突变孔数的增加，未超过baseline的2倍；在+S₉条件下对TA98菌株在100和300μg/mL菌落回变数呈现剂量依赖性增加，且超过baseline的2倍，分别为baseline的3.7倍和7.6倍。

结论：在本实验条件下，认为蛇床子素在+S9条件下对鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株具有诱发突变的作用。

实施例2丹参中遗传毒性成分筛选

丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，癥瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。本发明人对丹参提取物进行了研究。

2.1丹参提取物疑似DNA加合物检测

丹参药材50g，粉碎，过筛，50％乙醇提取2次，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味，用乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液减压浓缩。将萃取后的水层、乙酸乙酯部分、正丁醇部分及丹参素钠、丹参酮ⅡA、隐丹参酮作为待测样本，分别进行检测：

分析条件色谱条件AgilentProshellC18色谱柱(4.6mm*50mm，2.7μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱(0-15min，10％-90％B；体积流量0.4mL/min；柱温30℃；进样量2μL。

质谱条件电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描；检测方式：中性丢失扫描(116u，ce值为10，20，30ev)及产物离子扫描；干燥气温度350℃；干燥气体积流量10L/min；雾化器压力45psi(1psi＝6.895kPa)；鞘气温度400℃；鞘气体积流量11L/min。

孵育体系具体可参考实施例1的1.1。

检测结果如图2所示，结果表明，在乙酸乙酯部分及丹参酮ⅡA孵育体系中检测到疑似DNA加合物，检测到的疑似DNA加合物m/z544.1，同位素峰m/z549.4。在同时设立的未加脱氧核苷对照组中未检测到相应疑似加合物，在未加同位素标记的脱氧核苷对照组中，未检测到相应同位素峰。

通过对比保留时间和产物离子信息，本发明人发现丹参提取物孵育体系中检测到的疑似DNA加合物m/z544.1，同位素峰m/z549.4与丹参酮ⅡA及隐丹参酮孵育体系中的疑似DNA加合物保留时间和产物离子均相同，经查阅文献，丹参酮ⅡA为隐丹参酮的代谢产物，因此确定丹参提取物孵育体系中检测到的疑似DNA加合物m/z544.1由丹参酮ⅡA或其代谢产物形成。m/z544.1产物离子m/z427.9，为m/z544.1脱去脱氧核糖的碎片离子。同位素峰m/z549.4产物离子m/z433.2，为m/z549.4脱去脱氧核糖的碎片离子，为m/z427.9的同位素峰。

2.2丹参酮ⅡA与小牛胸腺DNA的反应

使用实施例1的1.2的方法，检测丹参酮ⅡA与小牛胸腺DNA的反应，HPLC-MS采用多反应监测(MRM)进行检测。同时设立对照组，对照组中不添加丹参酮ⅡA。在丹参酮ⅡA与小牛胸腺DNA的反应体系中，检测到相应加合物，结果如图3所示。空白对照组中未检测到相应加合物。表明丹参酮ⅡA与小牛胸腺DNA能形成DNA加合物。

碱性彗星试验研究丹参酮ⅡA的遗传毒性

HepG2细胞含10％小牛血清及双抗(1×10⁵U/L青霉素，100mg/L链霉素)的MEM/EBSS培养基中，在空气中含5％CO₂，37℃的培养箱中培养、传代，取对数生长期细胞用于试验。

对数期生长细胞用胰酶消化收获，加入不同浓度的丹参酮ⅡA及阳性对照H₂O₂，37℃悬浮培养1h,台盼蓝染色检测细胞存活率，Hoechst33342染色检测细胞的凋亡率，离心去上清，加PBS洗涤细胞两次，最后将细胞调至10⁶/mL。

制片：第一层凝胶制备：将熔融的1.5％NMA200μl滴在磨砂载玻片上，盖上盖玻片，4℃冰箱放置10min。第二层凝胶制备：按1：8的比例将上述细胞悬液与1％LMA在37℃混匀，迅速将上述混合液80μL滴加在第一层凝胶上，盖上盖玻片，4℃冰箱放置10min。

裂解：移去盖玻片，将载玻片水平浸入新鲜配制的细胞裂解(含2.5mol/LNaCL,100mol/LEDTA,10mol/LTris,1％TritonX-100和10％DMSO,pH＝10)中，裂解1.5h。

电泳：将载玻片从裂解液中取出，吸干裂解液并置于水平电泳槽阳极端，电泳槽中加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液(NaOH300mmol/L,EDTA1mmol/L,pH＝13)，放置20min解螺旋。在电压18V，电流强度200mA下，电泳30min。

中和及染色：电泳后将胶片于0.4mol/LTris-HCL(pH7.5)缓冲液浸洗3次，每次5min，向胶片上滴加20g/mL溴化乙啶(EB)染液50μl，盖上盖玻片，5min后观察结果。

观察及评价：在荧光显微镜(激发波长549nm,发射波长590nm)下阅片。图象直接输入计算机，保存为tif文件。观察50个随机选择的细胞，利用CAPS软件分析。

彗星试验中，10、50、100μmol/L的丹参酮ⅡA和阳性对照物H2O2(20μmol/L)与HepG2细胞接触1h后，各组细胞存活率均在90％以上，无凋亡的细胞。EB染色后，在荧光显微镜下，HepG2细胞未断裂的DNA只有一个完整的头部，断裂的DNA形成拖尾，随着丹参酮ⅡA剂量的增加，拖尾越来越明显。见表1。

表1丹参酮ⅡA对HepG2细胞DNA链断裂程度的影响

受试物DNA拖尾率(％)尾长(μm)012.44±1.363.16±0.35丹参酮ⅡA 10μmol/L16.54±1.01^*4.10±0.10^**丹参酮ⅡA 50μmol/L21.66±2.55^**17.17±3.39^**丹参酮ⅡA 100μmol/L34.35±11.63^**29.50±13.55H₂O₂(20μmol/L)28.68±7.58^**21.31±3.95^**

注：^**与对照比较P＜0.01，^*P＜0.05

图3显示了彗星试验研究丹参酮ⅡA对HepG2细胞遗传毒性结果。a为丹参酮ⅡA实验组；b.阴性对照组。可见，丹参酮ⅡA对HepG2有显著的遗传毒性作用。

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