一种福尔马林固定组织非靶标代谢组学研究的样品前处理方法

摘要

本发明公开了一种福尔马林固定组织非靶标代谢组学研究的样品前处理方法。采用本发明的方法能够直接使用福尔马林固定组织，以UPLC-Q-TOF？MSMS为分析平台进行组织代谢组学分析研究，解决了组织样本采集和保存中遇到的难题，方法简单快速。此外，采用本发明方法能同时提取组织中的极性和非极性物质，可以检测到更多的组织中的代谢产物，更有利于全面的观察组织代谢或病理的变化，同时发现更可靠的差异代谢产物及生物标志物，从而推动组织非靶标代谢组学的进展，并且有助于后期生物标志物的验证及相应检测试剂盒的开发。

说明书

技术领域

本发明涉及一种福尔马林固定组织非靶标代谢组学研究的样品前处理方法，特 别涉及一种以UPLC-Q-TOFMSMS为分析平台的新的、简便的、能同时提取福尔马 林固定组织中极性和非极性代谢产物的样品前处理方法。

背景技术

非靶标代谢组学可利用一系列的技术手段和检测方法全面考察生物体系受刺 激或扰动后，代谢物浓度和种类的动态变化，观察机体的代谢途径的变化和机体相 对应的生理病理改变。代谢组学研究样本包括体液样本，如血液、尿液和唾液等； 组织样本，如肝脏组织、肾脏等。组织代谢组学是代谢组学的重要组成部分，与其 他体液组学相比，更能清楚了解病变组织的病理生理变化。目前认为，组织代谢组 学研究最好选用新鲜组织，但新鲜组织获得有一定困难。福尔马林固定组织是一种 比较方便、常见的组织保存方式。尤其是关于肿瘤组织的研究，临床病理科通常将 术中切下的组织在10％福尔马林中固定后制成石蜡切片进行检查。因此，肿瘤研究 工作中所获得的样本绝大部分为病理检查剩余的福尔马林固定的组织。

目前，有关新鲜或冰冻组织、福尔马林-石蜡包埋组织的代谢组学研究的样本 前处理方法已有报道，但没有福尔马林固定样本的非靶标代谢组学研究的前处理方 法。不能从福尔马林固定组织样本中同时提取极性和非极性物质，不能满足代谢组 学分析组织中所有代谢产物的需求，不能全面系统的观察组织代谢改变的具体变化 和差异。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简便的能同时提取福尔马林固定组织 中的极性和非极性代谢产物的样品前处理的方法。

本发明的一种福尔马林固定组织非靶标代谢组学研究的样品前处理方法，其特 征在于包括以下步骤：

(1)取出浸泡于福尔马林组织浸泡液中的组织，放入研钵中加液氮研磨，充 分研磨组织后，用甲醇充分溶解已研磨的组织，提取组织中的代谢物质并同时沉淀 组织蛋白；

(2)将步骤(1)中的所有溶液全部转移至离心管中，涡旋1-5分钟后，4℃下 10000-12000rpm离心10-15分钟，取上清液；

(3)将步骤(2)得到的上清液转移至另外一个离心管中，氮气吹干，剩余固 体残余物以备重新复溶；

(4)用甲醇和福尔马林组织浸泡液的混合溶液复溶步骤(3)中的剩余固体残 余物，涡旋1-5分钟，静置5-10分钟后，4℃下，10000-12000rpm离心10-15分钟；

(5)移取步骤(4)的上清液，即为处理后的福尔马林固定组织非靶标代谢组 学研究样品。

在本发明中，优选的，甲醇和福尔马林组织浸泡液的混合溶液中甲醇和福尔马 林组织浸泡液的体积比为1:1。

其中，所述的福尔马林组织浸泡液是指临床上固定肿瘤组织的质量分数为 5％～15％的甲醛水溶液。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

1、采用液氮研磨组织，甲醇提取组织中的代谢产物并沉淀蛋白，操作简单易行；

2、用甲醇和福尔马林组织浸泡液的混合溶液(优选按照体积比1:1)复溶氮吹 残留物(步骤4)，好处在于：组织在福尔马林组织浸泡液中长期浸泡，组织中的大 多数极性代谢产物和少量非极性代谢产物溶于福尔马林组织浸泡液中，直接取福尔 马林组织浸泡液和甲醇混合溶液复溶氮气吹干残留物，节省极性物质提取步骤，减 少操作步骤和实验误差。

3、溶液多次经高速离心，尽可能的除掉了蛋白质等大颗粒物质对色谱柱的影 响，不经滤膜过滤，可直接进行色谱分离和检测。

4、本发明的一种福尔马林固定组织非靶标代谢组学研究的样品前处理方法能 够直接使用福尔马林固定组织进行组织非靶标代谢组学分析研究，解决了组织样本 采集和保存中遇到的难题，方法简单快速。能同时提取组织中的极性和非极性物质， 可以检测到更多的组织中的代谢产物，更有利于全面的观察组织代谢或病理的变 化，推动组织非靶标代谢组学的进展。同时发现更可靠的差异代谢产物及生物标志 物，有助于后期生物标志物的验证及相应检测试剂盒的开发。

附图说明

图1为采用本发明的样品前处理方法得到的大肠肿瘤组织提取液总离子流色谱 图；

图2为采用对比例方法得到的大肠肿瘤组织提取液总离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1福尔马林固定组织非靶标代谢组学研究样品的前处理

按照以下方法进行：

1.取浸泡于福尔马林组织浸泡液(10％)中的大肠肿瘤组织100毫克，放入研 钵中加液氮研磨，充分研磨组织，用2毫升甲醇充分溶解已研磨的组织，提取组织 中的代谢物质并同时沉淀组织蛋白；

2.将步骤1所有溶液全部转移至2毫升离心管，涡旋2分钟后，4℃下12000rpm 离心10分钟；

3.取上清溶液于另外一个2毫升离心管中，氮气吹干，剩余固体残余物，以备 重新复溶；

4.用体积比1:1混合的甲醇和福尔马林组织浸泡液(10％)的混合溶液400微 升复溶步骤3氮气吹干物质，涡旋2分钟，静置10分钟后，4℃下，12000rpm离心 10分钟；

5.移取步骤4上清溶液，即为处理后的福尔马林固定组织非靶标代谢组学研 究样品。

实施例2前处理后样品的质谱检测(ULPLC/Q-TOFMSMS)

1、试剂

乙腈，甲醇(色谱纯)，甲酸(色谱纯)，超纯水水由纯水仪制取。

2、色谱分离条件：

液相色谱为美国Waters公司Acquity超高效液相色谱系统。色谱柱为(BEH)C18 柱(1.8μm,2.1×100mm)。液相色谱条件:流动相A为双蒸水(0.1％的甲酸溶液), 流动相B为乙腈,流速为0.35mL/min.以线性梯度洗脱，起始梯度为2％乙腈并维 持0.5min,0.5-1.5min乙腈2％-20％，1.5-6.0min乙腈20％-70％，6.0-10.0min乙腈 70％-98％，10.0-12.0min乙腈98％维持2min，然后2min内乙腈含量降回2％，平 衡色谱柱2min。每次进样量为2μL，柱温35℃，自动进样器温度维持在4℃。

3、质谱检测条件：

质谱仪为Waters公司MicromassQ-TOF串联四极杆-飞行时间质谱仪,配有 电喷雾离子源(ESI)。质谱以正离子模式进行检测,正离子模式条件为:毛细管电 压3000V；锥孔电压35V；碰撞势能6eV；脱溶剂气流速650L/h；锥孔气流速50L/h； 脱溶剂温度320℃；源温度110℃。使用全扫描模式，质量范围为50–1000amu。以 LockSpray的Centroid模式收集数据来确保准确性和重现性；以200pg/ml浓度的 亮氨酸脑啡肽(固定质荷比556.2771)作单点校正，流速8μL/min。lockspray频率 为0.48s，亮氨酸脑啡肽平均扫描超过10次以作校正。

4、样品：经实施例1方法处理后的福尔马林固定组织非靶标代谢组学研究样 品。

5、结果

福尔马林固定组织非靶标代谢组学研究样品提取液的总离子流色谱图，如图1 所示。

对比例

为了说明本发明的样品前处理方法能够同时提取更多的极性和非极性的物质， 本发明进行了以下对比试验，按照以下方法进行：

1.取浸泡于福尔马林组织浸泡液(10％)中的大肠肿瘤组织组织100毫克，放 入研钵中加液氮研磨，充分研磨组织，用2毫升甲醇充分溶解已研磨的组织，提取 组织中的代谢物质并同时沉淀组织蛋白；

2.将步骤1所有溶液全部转移至2毫升离心管，涡旋2分钟后，4℃下12000rpm 离心10分钟；

3.取上清溶液于另外一个2毫升离心管中，氮气吹干，剩余固体残余物，以备 重新复溶；

4.用400微升甲醇复溶步骤3氮气吹干物质，涡旋2分钟，静置10分钟后，4℃ 下，12000rpm离心10分钟；

5.移取步骤4上清溶液，即为处理后的福尔马林固定组织非靶标代谢组学研究 样品。

色谱分离条件和质谱检测条件一样。

结果：采用对比例方法处理的福尔马林固定组织非靶标代谢组学研究样品的质 谱图如图2所示，通过对比图1和图2可以发现，采用本发明的样品前处理方法能 同时提取组织中的极性和非极性物质，因此可以检测到更多的组织中的代谢产物。