一种利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的引物、试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开了一种利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的引物、试剂盒和检测方法。具体地，本发明涉及一组利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的引物，包括如序列表中SEQ？ID？No.2和SEQ？ID？No.3所示的扩增引物对，以及如序列表中SEQ？ID？No.4所示的测序引物。本发明还公开含有这些引物的检测试剂盒。本发明利用焦磷酸测序技术对斑点叉尾鮰病毒进行检测，具有高通量、快速、准确的优点，可以精确的进行短DNA序列分析，测序过程耗时短，便于构建标准化操作流程。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的引物、试剂盒和检测 方法，属分子生物学领域。

背景技术

斑点叉尾鮰病毒(Channelcatfishvirus，CCV)是一种有囊膜的双链DNA病毒， 又称鮰疱疹病毒I型(Ictaluridherpesvirus1)，国际病毒分类委员会第八次报告的最 新病毒分类系统将其归类为疱疹病毒科、鮰病毒属。该病毒引起的斑点叉尾鮰病毒病 (Channelcatfishvirusdisease，CCVD)是一种急性致死性传染病，可导致斑点叉尾 鮰养殖产业的严重损失，我国将其列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、 寄生虫病名录》的二类传染病。斑点叉尾鮰和其他鮰对CCV易感，天然水体中病毒 只感染鮰幼鱼和鱼苗，刚孵化育苗死亡率达100％。此病主要在北美流行，我国近年 来大规模养殖斑点叉尾鮰，但目前还未有CCV的确切报道。CCVD流行后，残存鱼 往往是隐形带毒者，一般无临床症状。建立CCV的快速检测预警技术，加强斑点叉 尾鮰苗种和成鱼类检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，有效切断病毒传 播，保障斑点叉尾鮰养殖业的健康持续发展具有重要意义。

目前为止，CCV检测的标准方法主要是用细胞分离培养病毒，然后用中和试验、 免疫荧光、ELISA或PCR等手段进行鉴定，对无临床症状的鱼感染CCV的判定是用 血清学的方法，通过测定鱼CCV抗体。血清学方法敏感性较低；PCR方法虽然灵敏， 但仍会有假阳性出现的可能；其他方法不能达到在分子水平上进行快速确证的目的。

焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，适于 对已知短序列的测序分析，无需荧光标记引物或核酸探针，无需电泳，具有分析快速、 准确、灵敏度高、经济、自动化和实时检测的特点。该方法在普通PCR的基础上， 对PCR产物进行测序，提高了检测的特异性，且给出了分子诊断的黄金标准—基因序 列，减少了由于PCR敏感性高而出现的假阳性结果，提高了检测的准确性。焦磷酸 测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于构建标 准化操作流程，因而颇受国内外研究者的欢迎，已广泛应用于病原微生物快速鉴定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒 的引物。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾 鮰病毒的试剂盒。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾 鮰病毒的检测方法。

为实现上述目的，本发明的主要原理是利用焦磷酸测序技术，通过DNA聚合酶 (DNAploymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase) 和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化待测序DNA单链和测序引物的酶级联化学发光反应， 反应底物为5’-邻酰硫酸(adenosine5’phosphosulfate，APS)和荧光素。在每一轮测序 反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中 并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动 荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，光 信号由CCD摄像机检测并由Pyrogram^TM反应为峰，每个光信号的峰高与反应中掺入的 核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应 体系，然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序即可从反应光强的信号峰中读出。

本发明提供了一组利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的引物，包括扩增引 物对和测序引物：

扩增引物对：上游引物：5’-GGCTTGGGCTTGATGGAC-3’(SEQIDNo.2)

下游引物：5’-Biotin-GAGGAGGACAACGCGACTG-3’(SEQID No.3)

测序引物：5’-CTTGGGCTTGATGGA-3’(SEQIDNo.4)

其中，下游引物的5’端标记生物素。

本发明所述的斑点叉尾鮰病毒特异性引物及焦磷酸测序引物是根据斑点叉尾鮰 病毒蛋白激酶(proteinkinase，PK)基因的保守区域序列，通过AssayDesignSW软 件设计的，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列(特 异目标序列SEQIDNo.1所示)设计焦磷酸测序引物以确定斑点叉尾鮰病毒。斑点叉 尾鮰病毒PK基因的目标序列：CCGGTCGTGTCGGTGTCGGTGGCTGTGTCG GCTTCCGTTTCACCG(SEQIDNo.1)；其PCR扩增片段长度为144bp。

本发明还提供一种利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的试剂盒，该试剂盒 包括上述检测斑点叉尾鮰病毒的引物组，即扩增引物对和测序引物。进一步地，该试 剂盒还包括完成PCR反应和焦磷酸测序所需材料和试剂，例如DNA提取试剂(可以 按照现有技术中公开的方法自行配制，也可以使用商业化购买的试剂盒)；PCR反应 试剂(可以按照现有技术中公开的方法自行配制，也可以使用商业化购买的试剂盒)； 单链模板制备试剂；焦磷酸测序试剂(可以按照现有技术中公开的方法自行配制，也 可以使用商业化购买的试剂盒)等，上述材料和试剂可以混合包装，也可以单独包装， 优选地，为单独包装。

本发明还提供了一种利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的检测方法，该方 法包括：

(1)提取待测样品DNA作为模板，可以使用现有技术中已知的提取方法或商业 化试剂盒进行提取；

(2)使用上述扩增引物对进行PCR扩增反应；

(3)若斑点叉尾鮰病毒特异PCR反应为阳性，即扩增片段为144bp，则回收PCR 扩增产物，制备焦磷酸测序单链模板，然后使用上述测序引物进行焦磷酸测序，若目 的序列与CCGGTCGTGTCGGTGTCGGTGGCTGTGTCGGCTTCCGTTTCACCG (SEQIDNo.1)特异目标序列一致，则待测样品中含有斑点叉尾鮰病毒；若斑点叉 尾鮰病毒特异PCR反应为阴性，则判定样品为非斑点叉尾鮰病毒。

本发明的优点是：本发明利用焦磷酸测序技术对斑点叉尾鮰病毒进行检测，与现 有技术相比，该技术具有高通量、快速、准确的优点，可以精确的进行短DNA序列 分析，测序过程耗时短，便于构建标准化操作流程。PCR产物可直接用于测序，不需 进行产物纯化等二次处理，操作简便，所需样品量少。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开 内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为本发明对斑点叉尾鮰病毒PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳结果；其中M为 DNAMarker，1为斑点叉尾鮰病毒，2为阴性对照。

图2为本发明对斑点叉尾鮰病毒PCR扩增产物进行焦磷酸测序的结果。

图3为本发明对样品组织DNA的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果；其中M 为DNAMarker，1为斑点叉尾鮰病毒感染的鮰鱼组织样品，2为正常鮰鱼样品，3为 阴性对照。

图4为本发明对斑点叉尾鮰病毒感染的鮰鱼组织DNAPCR扩增产物的测序结果。

图5为本发明对斑点叉尾鮰病毒PCR扩增产物进行焦磷酸测序的敏感性检测结果。其 中，A-G依次为斑点叉尾鮰病毒模板从10^-1稀释至10^-7PCR扩增产物的焦磷酸测序检测 结果。

图6为本发明对斑点叉尾鮰病毒进行PCR扩增特异性检测的琼脂糖凝胶电泳结果。其中 M为DNAMarker，1为斑点叉尾鮰病毒，2为金鱼造血器官坏死病毒，3为锦鲤疱疹病毒， 4为流行性造血器官坏死病毒，5为甲鱼虹彩病毒，6为阴性对照。

具体实施方式

实施例1检测斑点叉尾鮰病毒的引物的设计

通过对美国国立生物信息中心NCBI基因库(GenBank)中已公布的斑点叉尾鮰 病毒基因序列进行对比分析，根据CCVPK基因的特异性序列设计特异PCR引物对 和焦磷酸测序引物，筛选出一组最佳引物进行后续的PCR反应和测序工作。

本发明根据斑点叉尾鮰病毒PK基因的特异区域序列设计的斑点叉尾鮰病毒特异 性引物可针对斑点叉尾鮰病毒DNA扩增出特异性单一条带，其PCR扩增片段长度为 144bp。再根据扩增区域中包含的特异核苷酸序列(特异目标序列SEQIDNo.1所示) 设计焦磷酸测序引物以确定斑点叉尾鮰病毒。斑点叉尾鮰病毒PK基因的目标序列： CCGGTCGTGTCGGTGTCGGTGGCTGTGTCGGCTTCCGTTTCACCG(SEQID No.1)。

本发明经过筛选，设计得到的斑点叉尾鮰病毒特异PCR扩增引物对及测序引物分 别为：

扩增引物对：上游引物(CCVF)：5’-GGCTTGGGCTTGATGGAC-3’(SEQID No.2)；

下游引物(CCVR)：5’-Biotin-GAGGAGGACAACGCGACTG-3’(5’端标记生物 素)(SEQIDNo.3)；

测序引物(CCVS)：5’-CTTGGGCTTGATGGA-3’(SEQIDNo.4)。

实施例2试剂盒组成

该试剂盒包括实施例1设计的检测斑点叉尾鮰病毒的引物组，即扩增引物对和测 序引物。该试剂盒还包括完成PCR反应和焦磷酸测序所需材料和试剂，例如DNA提 取试剂(DNeasyBlood&TissueKit，QIAGEN公司)、PCR反应试剂(PyroMarkPCR Kit，QIAGEN公司)、单链模板制备试剂(链霉亲和素包被的磁珠，GE公司)，焦磷 酸测序试剂(PyroMarkGoldQ96SQAReagents、变性缓冲液、冲洗缓冲液，QIAGEN 公司)等，上述材料和试剂可以混合包装，也可以单独包装，优选地，为单独包装。

实施例3检测方法的建立

1、斑点叉尾鮰病毒DNA的提取

以CCV(本实验室保存)为原料，采用DNeasyBlood&TissueKit(QIAGEN公 司，货号69506)提取DNA，试剂盒操作步骤为：

(1)吸取20μl蛋白酶K至1.5ml离心管的底部。(2)加入200μl待提取基因组的 病毒液(病毒滴度为10⁷TCID₅₀/0.1ml)至离心管中。(3)加入200μlBufferAL至样品 中，涡旋振荡15s混匀。(4)56℃孵育10min。(5)快速离心，去除残留在1.5ml离心 管盖子中的液滴。(6)加入200μl(样品等体积)的乙醇(96-100％)，涡旋振荡15s 混匀。振荡完毕后，快速离心，去除残留在1.5ml离心管盖子中的液滴。(7)将步骤6 得到的混合物转移至QIAampMini离心管柱。扣上盖子，6000g离心1min。(8)将 QIAampMin离心柱放入一个新的干净2ml接收管中，将滤液连同使用过的收集管丢 弃。(9)小心打开QIAampMini离心柱，加入500μlBufferAW1。盖紧盖子，6000g离 心1min。将QIAampMini离心柱转移至一个新的2ml收集管中，将滤液连同使用过的 收集管丢弃。弃滤液，小心打开QIAampMini离心柱，加入500μlBufferAW2。盖紧 盖子，最大转速离心3min。(10)将QIAampMini离心柱转移到一个新的1.5ml收集管。 小心打开离心柱，加入50μlBufferAE或双蒸水。室温(15-25℃)孵育1min，然后6000g 离心1min。-20℃冰箱保存备用。

2、PCR反应体系及条件

以提取的CCVDNA为模板，用PyroMarkPCRKit(QIAGEN公司，货号978703) 进行PCR，扩增目的片段，上下游引物为实施例1设计得到的CCVF和CCVR引物， PCR反应体系如下：

反应程序为：95℃预变性15min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃退火30s， 共循环45次；然后72℃再延伸10min。

3、琼脂糖凝胶电泳

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取0.6g琼脂糖，于30ml1×TAE电泳缓冲液中加 热，充分熔化，加入GoldView^TMDNA染料10000倍稀释的溶液2μl，制胶，在电泳槽 中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；取5μlPCR扩增产物分别和1μl6×Loading Buffer混合后，点样；10V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，停止电 泳，将凝胶置于紫外凝胶成像系统下观察电泳结果，电泳结果见图1。

4、制备焦磷酸测序单链模板

使用20μl标记有生物素的PCR产物与30μlddH₂O混合后再与200μg链霉亲和素包 被的磁珠混合，室温下置震荡器上1400rpm震荡孵育15min，用真空吸附泵将与磁珠 结合后的PCR产物吸起，然后依次通过70％乙醇5s；变性缓冲液5s；冲洗缓冲液5s， 最后移至预先每孔加入45μl含有0.3mol/L测序引物的结合缓冲液的PSQ96孔板上方， 释放磁珠，将96孔板放入80℃烘箱中加热2min后，取出冷却至室温。

5、焦磷酸测序

在焦磷酸测序仪(PYROMARKQ96)上进行反应，在20-28℃下，所采用的碱基 加入顺序为15(ATGC)，每轮测序检测运行时间为65min，引物链随着不同dNTP的 加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，斑点叉尾鮰病毒特 异焦磷酸测序结果见图2，读取的序列为CGGTCGTGTCGGTGTCGGT GGCTGTGTCGGCTTCCGTTTCACCG(SEQIDNo.1)。

6、结果判定

PCR产物的电泳结果表明扩增出了144bp目的片段，与标准一致；经过焦磷酸测 序，测定的目的序列与斑点叉尾鮰病毒PK基因的特异目标序列一致，为CGGTCGTGT CGGTGTCGGTGGCTGTGTCGGCTTCCGTTTCACCG(SEQIDNo.1)，因此可判定 为斑点叉尾鮰病毒。

实施例4利用焦磷酸测序技术检测样品

取1份斑点叉尾鮰病毒感染的鮰鱼组织样品和1份正常鮰鱼组织样品，采用实施 例3的方法对样品进行检测。

1、斑点叉尾鮰组织样品DNA的提取

采用DNeasyBlood&TissueKit(QIAGEN公司，货号69506)提取斑点叉尾鮰 组织样品基因组DNA，-20℃冰箱保存备用。参见实施例3步骤1。

2、PCR反应体系及条件

PCR反应体系及条件参见实施例3的相应步骤。以提取的斑点叉尾鮰组织样品 DNA为模板，用PyroMarkPCRKit(QIAGEN公司，货号978703)进行PCR，扩增 目的片段。

3、琼脂糖凝胶电泳

电泳方法参见实施例3的步骤3。本实施例的电泳结果见图3。

4、制备焦磷酸测序单链模板

方法参见实施例3的步骤4。

5、焦磷酸测序

在焦磷酸测序仪(PYROMARKQ96)上进行反应，在20-28℃下，所采用的碱基 加入顺序为15(ATGC)，每轮测序检测运行时间为65min，引物链随着不同dNTP的 加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，感染CCV的鮰鱼 组织DNAPCR扩增产物焦磷酸测序结果见图4，读取的序列为CGGTCGTGT CGGTGTCGGTGGCTGTGTCGGCTTCCGTTTCACCG(SEQIDNo.1)。

6、结果判定

PCR产物的电泳结果表明斑点叉尾鮰病毒感染的鮰鱼组织扩增出了144bp目的片 段，与CCV的检测结果一致；经过焦磷酸测序，测定的目的序列与斑点叉尾鮰病毒 PK基因的特异目标序列一致，为CGGTCGTGTCGGTGTCGGTGGCTGTGTCG GCTTCCGTTTCACCG(SEQIDNo.1)，因此可判定1号样品为斑点叉尾鮰病毒感染。 正常鮰鱼组织未扩增出144bp的目的片段，因此可判定2号样品中无斑点叉尾鮰病毒。

实施例5利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的敏感性实验

以实施例3中提取的CCVDNA为模板，依次进行10倍比稀释至10^-7，同时设阴 性对照。采用实施例3中的步骤进行敏感性检测。

1、PCR反应体系及条件

PCR反应体系及条件参见实施例3的相应步骤。以稀释的病毒DNA为模板，用 PyroMarkPCRKit(QIAGEN公司，货号978703)进行PCR扩增，其反应体系、反 应程序均参见实施例3。

3、琼脂糖凝胶电泳

电泳方法参见实施例3的步骤3。

4、制备焦磷酸测序单链模板

方法参见实施例3的步骤4。

5、焦磷酸测序

在焦磷酸测序仪(PYROMARKQ96)上进行反应，在20-28℃下，所采用的碱基 加入顺序为15(ATGC)，每轮测序检测运行时间为65min，引物链随着不同dNTP的 加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，CCVDNAPCR扩 增产物焦磷酸测序结果见图5，读取的序列为CGGTCGTGTCGGTGTCGGT GGCTGTGTCGGCTTCCGTTTCACCG(SEQIDNo.1)。

6、结果判定

电泳结果表明CCVDNA模板从10^-1稀释至10^-7后仍扩增出144bp的目的片段，条 带亮度逐渐减弱；经过焦磷酸测序，CCVDNA模板稀释至10^-6，测定的CCV目的序列 与PK基因的特异目标序列一致，为CGGTCGTGTCGGTGTCGGTGGCTGTGTCG GCTTCCGTTTCACCG(SEQIDNo.1)；稀释至10^-7时，经焦磷酸测序未测出特异目 标序列。本实施例说明本发明建立的利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的方法 敏感性较强，可稀释至10^-6，即20TCID₅₀。

实施例6利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的特异性实验

分别提取金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、流行性造 血器官坏死病毒(EHNV)和甲鱼虹彩病毒(STIV)的DNA(均为本实验室保存)， 以实施例3中提取的CCVDNA为阳性对照，同时设阴性对照。采用实施例3中的步 骤进行特异性检测。

1、病毒样品DNA的提取

采用DNeasyBlood&TissueKit(QIAGEN公司，69506)提取病毒DNA，试剂 盒操作步骤参见实施例3的步骤1。

2、PCR反应体系及条件

以提取的病毒和对照病毒样品DNA为模板，用PyroMarkPCRKit(QIAGEN公 司，978703)进行PCR扩增，其反应体系、反应程序均参见实施例3的步骤2。

3、琼脂糖凝胶电泳

电泳方法参见实施例3的步骤3。本实施例的电泳结果见图6。

4、制备焦磷酸测序单链模板

方法参见实施例3的步骤4。

5、焦磷酸测序

在焦磷酸测序仪(PYROMARKQ96)上进行反应，在20-28℃下，所采用的碱基 加入顺序为15(ATGC)，每轮测序检测运行时间为65min，引物链随着不同dNTP的 加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，CCVDNAPCR扩 增产物焦磷酸测序结果如图2所示，读取的序列为CGGTCGTGTCGGTGTCGGT GGCTGTGTCGGCTTCCGTTTCACCG(SEQIDNo.1)。

6、结果判定

电泳结果表明GFHNV、KHV、EHNV和STIV均未扩增出144bp的目的片段； CCV扩增出了144bp目的片段，与标准一致；经过焦磷酸测序，测定的CCV目的序 列与PK基因的特异目标序列一致，为CGGTCGTGTCGGTGTCGGTGGCTGTGTCG GCTTCCGTTTCACCG(SEQIDNo.1)。本实施例说明本发明建立的利用焦磷酸测序 技术检测斑点叉尾鮰病毒的方法具有良好的特异性和准确性。本领域技术人员可根据 本发明提供的测序引物、目标序列构建用于检测斑点叉尾鮰病毒的试剂盒。该试剂盒 可用于对斑点叉尾鮰病毒进行快速检测，具有高通量、低成本的特点，产物可直接用 于测序，不需要进行二次处理，操作极为简便，所需样品量小，具有良好的应用前景。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上 还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是 属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围 之列。