一种定点突变改造的人二肽基肽酶III

摘要

本发明涉及一种定点突变改造的人二肽基肽酶III。本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQ？ID？NO.1的人二肽基肽酶III中制造多个氨基酸取代而产生的突变体，所述的氨基酸取代包括第560、562、564位的取代，以致所述定点突变改造的人二肽基肽酶III为对6-甲氧基双呋喃香豆素具有氧化分解作用的酶。本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III可应用于制备饲料及其添加剂或食品及其添加剂中消除6-甲氧基双呋喃香豆素的产品，还可应用于制备预防由6-甲氧基双呋喃香豆素诱发的疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种二肽基肽酶III，特别涉及一种定点突变改造的人来源的二 肽基肽酶III。

背景技术

二肽酶III(DPP_SIII，EC3.4.14.4)，如来自酵母的二肽酶III、来自人类的 二肽酶III、来自人的二肽酶III、来自兔的二肽酶III等，是一组分子内含有特殊 的HEXXGH锌指结构的金属蛋白酶，具有水解多肽链的氨基末端切掉二肽的肽 酶。DPPIII在生理功能上与脑啡肽和血管紧张素II、血管紧张素III、促黑色素 等重要的生理活性肽的新陈代谢有关。DPP_S存在于各种哺乳动物的组织中，根 据亚细胞的定位、特异性地无核抑制剂的敏感性，二肽基肽酶分成不同的类型 DPPI～DPPIV。DPPIII可以选择性地从多肽链或蛋白质的N-末端水解掉二肽残 基，如：Arg-Arg-，Ala-Arg-，或者Tyr-Gry。人DPPIII由737个氨基酸组成， 锌离子是其催化金属离子。其氨基酸序列与黄曲霉毒素单加氧酶(Aflatoxin monooxygenas，AFMO)有54.95％的同源性，但不具有对6-甲氧基双呋喃香豆 素氧化分解的功能。

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的剧毒性次生代谢产物， 已经确定的黄曲霉毒素分子的结构主要有八种，其中毒性最强的黄曲霉毒素B1 (也称6-甲氧基双呋喃香豆素)被认为是潜在的对人类危害极为突出的一类强致 癌诱变剂，一次大量摄入会引起人及动物的急性中毒、甚至死亡；小剂量长期摄 入会致畸、致突变和致癌，即使几十ppb的含量仍有极大的毒性；I族黄曲霉毒 素含有呋喃双键结构。目前，已经发现的对6-甲氧基双呋喃香豆素具有分解作用 的生物酶极少。黄曲霉毒素单加氧酶(AFMO)是一个对6-甲氧基双呋喃香豆素 有氧化分解作用的酶。经研究发现黄曲霉毒素单加氧酶氧化分解6-甲氧基双呋喃 香豆素的过程为：从底物分子中获得电子传递给氧，使水还原成过氧化氢，将底 物氧化并进一步使分子中的呋喃双键开环。在这个过程中，由分子内的变价离子 的价态变化来实现电子的传递，首先，结合在AFMO上的二价金属离子夺得底 物的一个电子，自身变成一价离子，然后不稳定的一价离子将夺得的这个电子传 递给氧，自身又转变成稳定的二价离子，氧气分子获得一个电子在水分子的参与 下生成过氧化氢，同时底物转变为它的环氧化物。然后，该环氧化物伴随着过氧 化氢的作用发生氧化水解反应，最终使底物分子中的呋喃双键断开。黄曲霉毒素 单加氧酶是目前已报道的用于黄曲霉毒素解毒的生物酶。因此，发现和制造新的 对6-甲氧基双呋喃香豆素具有氧化分解作用的酶，对发展黄曲霉毒素消减技术具 有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种定点突变的人二肽基肽酶III，该人二肽基肽 酶III突变体对6-甲氧基双呋喃香豆素具有氧化分解功能。

本发明所述的一种定点突变改造的人二肽基肽酶III是由氨基酸序列为SEQ IDNO.1的人二肽基肽酶III(NCBI数据库登录号为AJ271216.1)中制造多个氨 基酸取代而产生的、对6-甲氧基双呋喃香豆素有氧化分解作用的人二肽基肽酶 III突变体，所述的氨基酸取代包括第560、562和564位的取代。

根据本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III的进一步特征，所述第 560位的氨基酸取代是用丙氨酸(Alanine,Ala,A)取代谷氨酸(Glutamicacid,Glu, E)；第562位的氨基酸取代是用赖氨酸(Lysine，Lys,K)取代苯丙氨酸 (Phenylalanine,Phe,F)；第564位的氨基酸取代是用组氨酸(Histidine,His,H) 取代色氨酸(Tryptophan,Trp,W)；所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III突变 体的氨基酸序列为SEQIDNO.2。

经实验验证，本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III(以下缩写为 “humDPP”)具有对于6-甲氧基双呋喃香豆素的氧化分解功能。该突变体酶在 pH6.0、反应温度25℃处理6-甲氧基双呋喃香豆素(100ppb)50分钟后，其对 6-甲氧基双呋喃香豆素的氧化分解效率达到89.6％。该突变体酶的其它酶学性质 与野生酶相似。

进一步地，本发明提供了一种DNA分子，其编码本发明所述的定点突变改 造的人二肽基肽酶III。

优选地，本发明所述的DNA分子的核苷酸序列为SEQIDNO.3。

本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。

本发明的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子， 或者含有本发明所述的载体。

上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。

本发明还提供了本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III的生产方法， 包括：在适于二肽基肽酶III表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培 养基中分离所述的人二肽基肽酶III。

当本发明所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体 或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表达系 统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统 包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有人载体的微生物，如人； 用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植 物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。

本发明优选的宿主为真核系统如毕赤人；本发明优选的蛋白质表达方法为毕 赤人甲醇诱导分泌表达。

本发明人成功地获得了一种定点突变改造的人二肽基肽酶III，通过活性鉴 定实验，证明该二肽基肽酶III突变体具有野生型二肽基肽酶III所不具备的氧化 分解6-甲氧基双呋喃香豆素的生物活性，且该生物活性达到了应用于饲料及其添 加剂加工、食品及其添加剂加工以及药物开发的程度。

本发明的另一目的是提供将所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III在制备 饲料及其添加剂或食品及其添加剂中消除6-甲氧基双呋喃香豆素的产品的应用。 结合目前的饲料和食品的加工工艺，可将本发明所述的定点突变改造的人二肽基 肽酶III作为脱毒剂添加到饲料中进行饲料脱毒，或者制成固定化酶用于如花生 油等食品的脱毒，或制成能够表达该酶的益生菌制剂或益生菌微囊等用于食品、 粮油、饲料等的脱毒。

本发明的另一目的是提供将所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III在制备 预防由6-甲氧基双呋喃香豆素诱发的疾病的药物的应用。结合目前的常规药物制 备工艺，可用本发明所述的定点突变改造的人二肽基肽酶III制得到用于预防由 6-甲氧基双呋喃香豆素诱发的疾病(例如肿瘤)的药物。

附图说明

图1为重组质粒humDPP表达质粒的鉴定图。

图2为重组humDPP和重组wthDPP的纯化结果。

具体实施方式

本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含 义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。

“wthDPP”表示野生型人二肽基肽酶III，其基因以斜体wthDPP表示。

“humDPP”表示突变体人二肽基肽酶III，其基因以斜体humDPP表示。

实施例1：wthDPP和humDPP的合成

本发明以Homosapiens的二肽基肽酶基因(NCBI数据库AJ271216.1)序 列作为参考，在5’端加入5’-GTCGAATTC-3’在3’端加入3’-CCTAGGGAC-5’， (GAATTC)为限制酶切位点EcoRI，(GGATCC)为限制酶切位点BamHI。采 用人工全合成的方法合成wthDPP基因。

本发明以Homosapiens的二肽基肽酶基因(AJ271216.1)序列作为参考，将 第560位的氨基酸用丙氨酸(Alanine，ALa,A)取代，第562位的氨基酸用赖 氨酸(Lysine，Lys,K)取代，第564位的氨基酸用组氨酸(Histidine,His,H) 取代，在5’端加入5’-GTCGAATTC-3’在3’端加入3’-CCTAGGGAC-5’，(GAATTC) 为限制酶切位点EcoRI，(GGATCC)为限制酶切位点BamHI。采用人工全合成 的方法合成humDPP目的基因。

在定点突变改造后，第560位的丙氨酸(Alanine，ALa,A)、第562位的赖 氨酸(Lysine，Lys,K)、第564位的组氨酸(Histidine,His,H)与第566位的谷 氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)、第568位的组氨酸(Histidine,His,H)、第569位 的甲硫氨酸(Methionine,Met,M)、第570位的谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)、 第571位的丙氨酸(Alanine，ALa,A)以及第572位的精氨酸(Arginine，Arg,R) 形成一个AXKXHXQXHMQAR(A为丙氨酸，K为赖氨酸，H为组氨酸，X为 任意氨基酸)序列。

基因合成由商业性公司(例如上海捷瑞生物有限公司)完成。

实施例2：重组质粒wthDPP和humDPP表达质粒的构建

基因克隆按常规方法(Sambrook,etal.2001,MolecularCloningALaboratory Manual.ColdSpringHarborLabroratoryPress.USA)进行，将实施例1所得的 wthDPP和humDPP分别克隆到pHIL-S1构建成表达质粒pHIL-S1-wthDPP和表 达质粒pHIL-S1-humDPP，克隆后的目的基因经酶切、测序鉴定。

具体做法：

含humDPP的重组质粒pHIL-S1的构建过程为：EcoRI+BamHI双酶切质粒 pHIL-S1和目的片断humDPP，酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收。 利用T4DNA连接酶进行质粒pHIL-S1和humDPP的连接。CaCl₂法制备E.coliDH5 α感受态细胞，转化DH5α感受态细胞，筛选转化子，碱提质粒。用EcoRI+BamHI、 HindⅢ、SacI酶切鉴定重组质粒pHIL-S1-humDPP。挑取重组质粒PEG纯化法 (Sambrook,etal.2001,MolecularCloningALaboratoryManual.ColdSpring HarborLabroratoryPress.USA)提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用 DNA自动序列仪，正反向进行测定。酶切结果如图1示，重组载体pHIL-S1-humDPP 的酶切鉴定，BamHI、EcoRI双酶切(样品1)切下一条带位于2100bp左右， HindIII单酶切(样品2)，SacI单酶切(样品3)。

含wthDPP的重组质粒pHIL-S1的构建过程为：将含humDPP的重组质粒 pHIL-S1的构建过程中的目的片断humDPP替换为wthDPP，其他操作过程与含 humDPP的重组质粒pHIL-S1的构建过程相同。

实施例3：重组humDPP和重组wthDPP的表达

重组humDPP的表达：用SacI酶切重组质粒pHIL-S1-humDPP和质粒pHIL-S1， 酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切后的线性重组质粒 pHIL-S1-humDPP和质粒pHIL-S1。按PichiaExpressionKit(InvitrogenInc.，美国) 手册中的原生质法转化毕赤人菌GS115，筛选Mut⁺转化子。利用甲醇作为唯一 碳源对重组菌进行诱导表达(按PichiaExpressionKit手册操作)中，培养液经 SDS-PAGE电泳分析表明，转化子经诱导表达后，培养液上清出现明显的目的蛋 白带，而转化不含目的基因的空质粒的对照菌在相同的条件下诱导96小时，在 上清中未检测到目的蛋白条带。结果如图2所示(样品1为humDPP，样品2为 wthDPP)，转化子经甲醇诱导表达后，培养液上清出现明显的目的蛋白带；而转 化不含目的基因的空质粒的阴性对照菌，在相同的条件下诱导在上清中无目的蛋 白出现。

具体做法如下：

一、重组子与毕赤人的同源重组

(一)线性化质粒

SacI酶切重组质粒pHIL-S1-humDPP和质粒pHIL-S1，同时线性化质粒 pHIL-S1是作为下面实验的对照。

酶切pHIL-S1-humDPP(120总体系)：12μlBufferL+8μlSacI+100μl pHIL-S1-humDPP

酶切pHIL-S1(120总体系)：12μlBufferL+8μlSacI+100μlpHIL-S1

0.8％琼脂糖凝胶电泳酶切样品，切胶回收酶切后的线性重组质粒 pHIL-S1-humDPP和质粒pHIL-S1。

(二)培养用于原生质化的毕赤人菌GS115

1.从平板上挑取一个GS115单克隆接种于10mlYPD中，在150ml锥形瓶 中，30℃，250-300rpm振荡培养过夜；

2.从昨日培养的的10mlYPD菌液中分别取5，10，20μl接种于200mlYPD 中，在500ml的锥形瓶中，250-300rpm振荡培养过夜；

3.检测3个瓶中菌液的OD₆₀₀值，取OD₆₀₀＝0.2-0.3的菌液转入离心管中， 室温1500×g离心5min，弃上清，收集的细胞用于原生质化。

(三)毕赤人菌GS115的原生质化

1.培养收集的细胞重悬于200ml的无菌水中，转移至两个无菌的10ml离 心管中；

2.室温下，1500×g离心5min，弃上清；

3.用10ml新鲜配制的SED洗沉淀，室温下，1500×g离心5min，弃上清；

4.用10ml1M山梨醇洗沉淀，室温下，1500×g离心5min，弃上清；

5.用10mlSCE重悬沉淀；

6.取一管Zymolyase冻融后轻弹管壁，使溶液混匀；

7.取7.5μlZymolyase加入管中，30℃温育30min；

8.室温下750×g离心10min，收集菌体，弃上清；

9.用10ml1M山梨醇洗原生质体，轻轻敲打管壁分散沉淀，室温下750×g 离心10min，收集菌体，弃上清；

10.用10mlCaS洗菌体，室温下750×g离心10min，收集菌体，弃上清；

11.将沉淀重悬于0.6mlCaS中，此原生质体在30min内必须使用。

(四)原生质法转化毕赤人菌GS115

1、分别取100μl毕赤人原生质体加入A、B、C3个无菌15ml离心管中；

2、A管中不加DNA作为阴性对照，B管中加入30μl线性化的原质粒 pHIL-S1，C管中加入30μl线性化的重组质粒pHIL-S1-humDPP，室温下温育10min, 期间准备一支3ml新鲜配制的PEG/CaT；

3、各管中加入1ml新鲜配制的PEG/CaT，轻轻混匀，室温下温育10min；

4、室温下750×g离心10分钟，弃上清，控干；

5、将沉淀重悬于150μlSOS中，室温温育20min；

6、各管加入850μl1M山梨醇，准备铺板；

7、涂布RD固体培养基，每板涂布200μl,28-30℃温育倒置培养，转化子约 在4-6天出现。

(五)筛选Mut⁺转化子

1.用无菌牙签挑取His⁺转化子，分别在MM和MD板上一一对应点菌，同 时点上GS115/His⁺Mut^sAlbumin和GS115/His⁺Mut⁺β-gal作为对照。

2.28-30℃温育倒置培养2天；

3.两天后，观察对照MM和MD板，若在两板上均生长良好为Mut⁺，若 在MD上生长良好，在MM板上生长少或不生长则为Mut^s。

(六)重组菌的诱导表达

1.挑取一个His⁺Mut⁺转化子的单克隆，接种于25mlBMG，在250ml的锥 形瓶中，28-30℃，250-300rpm振荡培养，直至OD₆₀₀＝2-6(约16-18h)；

2.1500-3000×g离心5min收集细胞，弃上清，重悬细胞于BMM中至OD₆₀₀为1.0(约需100-200mlBMM)，在1升的锥形瓶中，28-30℃，250-300rpm继 续振荡培养。

3.每24h加100％甲醇，始终浓度至0.5％，保持诱导表达；

4.诱导表达96h的时间。培养液离心2-3min，留取上清放入-80℃保存以用 于纯化表达产物。

经诱导96小时培养上清中总蛋白量达0.20mg/ml。目的蛋白的分子量与理论 值82.4kDa相符。

重组wthDPP的表达：将重组humDPP的表达过程中的重组质粒替换为 pHIL-S1-wthDPP，其他操作过程与重组humDPP的表达流程相同。

实施例4：重组humDPP和wthDPP的纯化

诱导表达的发酵液经70％饱和(NH₄)₂SO₄沉淀，收取沉淀获得粗酶样品。 粗酶样品以等体积的PBS溶解，离心后取上清上疏水色谱层析Phenylsepharose 柱，以连续梯度的洗脱缓冲液洗脱，收集目的峰。透析脱盐，PBS溶液平衡后浓 缩。具体如下：

1、硫酸氨沉淀收集粗酶

重组表达发酵液加入(NH₄)₂SO₄粉末至40％饱和度，4℃，10000g离心20 分钟，上清继续再加入(NH₄)₂SO₄粉末至70％饱和度。4℃，10000g离心20 分钟。即获得粗酶样品。

2、疏水层析：粗酶样品以等体积的0.02MPBS(pH：6.0)液溶解，4000g 4℃离心10分钟，取上清，上Phenylsepharose柱[Phenylsepharose6Fastflow(high sub)，PharmaciaBiotech，Inc]，溶液液(0.02MPBS+30％饱和硫酸铵，pH：6.0) 洗至基线，然后以连续梯度的洗脱缓冲液[A液(0.02MPBS+10％饱和硫酸铵， pH：6.0)+B液(0.02MPBS，pH：6.0)]洗脱，收集目的峰。透析脱盐，并以 F液(0.02MPBS+0.5MNaCl，pH：7.5)平衡，浓缩至蛋白浓度约为1mg/ml。 目的峰用SDS-PAGE电泳鉴定。

实施例5：humDPP及wthDPP重组蛋白的对6-甲氧基双呋喃香豆素氧化分解作 用的检测

酶活力单位的定义：25℃条件下，一分钟酶催化底物产生1μmol的H₂O₂所 需要的酶量。

酶活力测定方法：

在10ml浓度为10μg/ml的酶中加入30μl浓度为100μg/ml的底物(6-甲 氧基双呋喃香豆素)，在25℃、pH6.5条件下反应10分钟，然后在反应液中加 入200μl浓度为0.34mg/ml的辣根过氧化物酶(HRP)和200μl浓度为5mM的 3,3’-5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，显色30min，然后在紫外650nm处测量吸光值， 计算酶活力单位。

酶活测定结果显示，wthDPP蛋白对6-甲氧基双呋喃香豆素没有分解作用； humDPP蛋白对6-甲氧基双呋喃香豆素具有分解作用，相对酶活为30.60U/mg。

表1：样品处理方法