用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）的诊断和预后的方法

摘要

本申请提供了一种帮助对患有COPD的受试者进行分类或确定其预后，或帮助选择针对患有COPD的受试者的治疗策略，或帮助监控COPD的疾病进展或帮助评价针对COPD的治疗方案的有效性的方法，该方法包括评价从受试者获得的样品中对羰基化波形蛋白的抗体反应的步骤。该方法还可包括利用样品中对羰基化波形蛋白的抗体反应的信息来选择治疗方案的步骤。评价对羰基化波形蛋白的抗体反应的步骤可包括确定对羰基化波形蛋白的抗体反应中IgG与IgM的比值的步骤。

说明书

本发明涉及慢性阻塞性肺疾病(COPD)的评价和治疗。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以慢性气道炎症和肺气肿为特征的肺病， 其引起不能完全可逆的气道受限。炎性反应随着疾病的严重度而增加，但是 对治疗响应差，并且尽管已经证实糖皮质激素类固醇是用于治疗哮喘的非常 有效的抗炎药，但由于患者对它们的敏感性降低，它们在COPD中的治疗价 值有限。

虽然，历史观点认为COPD的发病机制是由于异常的先天反应，然而， 越来越多的证据表明有适应性免疫系统的参与。在患有疾病的受试者的小气 道和肺组织中检测到CD8和CD4T细胞以及B细胞的数量增加，并且还已 经注意到淋巴小结。(Saetta,DiStefanoetal.1998；Hogg,Chuetal.2004； Sullivan,Simonianetal.2005；vanderStrate,Postmaetal.2006；Brusselle, Demooretal.2009)。

然而，驱动这一具体免疫反应的一种或多种抗原的性质仍不清楚。与其 他的慢性炎性疾病一样，COPD具有自身免疫功能障碍的标志；并且以天然 构象或以某种方式在化学上改变或酶促学上改变的自身抗原(如高丰度结构 蛋白)是潜在的来源。已经报道了针对肺上皮细胞(Kuo,Changetal.2010)、 内皮细胞(Feghali-Bostwick,Gadgiletal.2008；Kirkham,Caramorietal.2011) 和细胞外基质蛋白如弹性蛋白(Lee,Goswamietal.2007)和胶原蛋白(Rinaldi, Lehoucketal.2012)的抗体。

暴露于来自烟草烟雾、工业空气污染产物或有机燃烧产物(如室内烹饪 烟火)的活性氧簇(ROS)被视为是发展成世界范围内影响数百万人的COPD 的最大风险因素。然而，并不是所有暴露于这些风险因素的个体均将会呈现 出症状。有趣的是，肺部炎症甚至在戒烟后仍然持续存在，这提示炎症是由 直接暴露于烟雾之外的一些因素驱动。已经显示有机燃烧产物(如烟草烟雾) 中的组分或组织氧化损伤(如脂质过氧化作用)的产物容易直接修饰蛋白质 (如存在的反应性羰基产物能够在体外和体内不可逆地修饰蛋白质(Cerami, Foundsetal.1997；NichollandBucala1998；Nicholl,Stittetal.1998； Negre-Salvayreetal.2008；Burchametal.2010))或促进酶的释放，其可以(如 瓜氨酸化(Makrygiannakis,Hermanssonetal.2008)，蛋白质中的精氨酸残基 酶促转化为瓜氨酸)。这一性质的修饰可导致足够的构象改变，以赋予蛋白质 潜在的免疫原性，即产生“新抗原”，造成之前惰性的“自体”蛋白质成为有 效的自身抗原，由此有助于驱动自身免疫病变，其可能部分地导致COPD中 观察到的随后发生的肺损伤。

1秒钟用力呼气量(FEV1)是目前COPD疾病严重度和进展的最常用的 测量，但是它与症状和其他疾病标志没有很好关联。COPD严重度将根据 GOLD程度分类为GOLD1(轻度)、GOLD2(中度)或GOLD3(严重)或 GOLD4(非常严重)。参见例如GlobalStrategyfortheDiagnosis,Management andPreventionofCOPD,GlobalInitiativeforChronicObstructiveLungDisease (GOLD)2013.http://goldcopd.org/。

我们已经吃惊地发现，在具有不同COPD状态的患者中对羰基化波形蛋 白(而不是所调查的其他丰富结构蛋白/修饰)的抗体反应(特别是抗体反应 的类型)的显著差异。我们认为抗体反应(特别是抗体反应的类型)以及重 要地是这些抗体类型之间对羰基化波形蛋白的反应比值代表了COPD的预后 和预测因子，以及COPD的治疗目标。

在本说明书中对表面上是之前出版的文件的列举或讨论并不必然被认为 是承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。

本文引用的任何文件的整体通过引用并入本文。

本发明的第一方面提供了帮助分类或确定患有COPD的受试者的预后， 或帮助选择针对患有COPD的受试者的治疗策略，或帮助监控COPD的疾病 进展或评价针对COPD的治疗方案的有效性的方法，所述方法包括评价从所 述受试者获得的样品中对羰基化波形蛋白的抗体反应的步骤。该方法还可包 括利用样品中对羰基化波形蛋白的抗体反应的信息来选择治疗方案的步骤。

通常，评价对羰基化波形蛋白的抗体反应的步骤包括确定对羰基化波形 蛋白的抗体反应中IgG与IgM的比值的步骤。可选的或额外的，可以确定对 羰基化波形蛋白的抗体反应中IgG与IgM的比值。确定对羰基化波形蛋白的 抗体反应中IgG或IgG1与IgM的比值的步骤通常可包括确定针对羰基化波 形蛋白的IgM抗体和IgG或IgG1抗体的水平。

IgG或IgG1与IgM的比值当然可以被可选的确定或表示为IgM与IgG 或IgG1的比值，因为两者反应相同的潜在关系。如果不表示为IgG或IgG1 与IgM的比值，而是表达为IgM与IgG或IgG1的比值，当然要将数值和它 们变化的方向反转。

应了解，评价对羰基化波形蛋白的抗体反应，任选地(如)确定对羰基 化波形蛋白的抗体反应中IgG与IgM的比值，任选地确定对羰基化波形蛋白 的抗体反应中IgG1与IgM的比值，本身可允许分类或确定患有COPD的受 试者的预后，或选择针对患有COPD的受试者的治疗策略；或更通常，其可 以被临床医师用作帮助分类或确定预后或治疗策略的选择。

例如，如果临床医师实施如由GOLD指南规定的肺功能评价和/或如通 过CT扫描的肺损伤程度的评价，这是有用的。参见例如用于示例典型患者 评价参数的实施例1和3。应了解，在分类或确定预后或治疗策略的选择之 前，临床医师将愿意考虑这些或其他因素，并考虑对羰基化波形蛋白的抗体 反应，如对羰基化波形蛋白的抗体反应中IgG与IgM的比值。

GOLD评价系统对本领域技术人员而言是熟知的。参见以上提到的 GOLD指南。还参见图7的概要。

确定样品中对羰基化波形蛋白的抗体反应，如对羰基化波形蛋白的抗体 反应中IgG(或IgG1)与IgM的比值对于临床医师确定如何控制受试者的 COPD将是有用的。例如，由于高的IgG(或IgG1)与IgM的比值(如IgG:IgM 比值高于4或4.5，如5或更高或6或更高的比值)被认为与更晚期的疾病 (GOLD2或GOLD3)相关，临床医师可利用有关对羰基化波形蛋白的抗体 反应的信息，如对羰基化波形蛋白的抗体反应中IgG(或IgG1)与IgM的比 值，便于做出关于受试者的治疗的决定。因此例如，如果IgG(或IgG1)与 IgM的比值低(如IgG:IgM比值为4或更低，如3.5或更低)，并且因此指示 存在更晚期的COPD(GOLD2或GOLD3)的可能性较低，可以避免不必要 的治疗和/或监控。相似地，如果(例如)IgG(或IgG1)与IgM的比值高， 并且因此指示存在更晚期的COPD(GOLD2或GOLD3)的可能性较高，则 更大范围的治疗干预可能更加合适。即使不适合改变进行的治疗类型，确定 IgG(或IgG1)与IgM的比值是否高并且因此是否指示存在更晚期的COPD (GOLD2或GOLD3)的可能性较高可以帮助临床医师确定患者是否需要更 多定期监控(如更频繁地就诊临床医师，以评估疾病进展或治疗干预的有效 性)。

临床医师可以使用关于对羰基化波形蛋白的抗体反应的信息，如对羰基 化波形蛋白的抗体反应中IgG(或IgG1)与IgM的比值，以有助于做出关于 治疗受试者的恶化的决定。高IgG/IgM比值被认为是指示与肺损伤相关的机 制的发作。因此，在高IgG:IgM受试者中，可能需要/选择治疗恶化需要的抗 生素之外的额外治疗，或甚至是替代治疗，从而防止恶化以及改变的自身免 疫状态。这些额外治疗或替代治疗可以是免疫调节的/免疫抑制的以及是补体 级联抑制剂，以抑制破坏性自身免疫反应的先天和获得性免疫臂(immunity arm)。这样的治疗的实例将是本领域技术人员熟知的，并且如下文所示。在 低IgG:IgM受试者中，可不需要/选择这样的额外治疗或替代治疗。

如下文还将进一步讨论的，可用的进一步的治疗可包括：抗氧化剂治疗 (如n-乙酰半胱氨酸BiswasS,HwangJ,KirkhamPA和RahmanI(2012) TherapeuticinterventionforOxidativeandCarbonylstressinRespiratorydisease. CurrMedChem–EPubaheadofprint)；或抗羰基化剂(anticarbonyls)(如 二甲双胍；AGE化合物；还参见Negre-Salvayre,A.,C.Coatrieux,etal.(2008). "Advancedlipidperoxidationendproductsinoxidativedamnagetoproteins. Potentialroleindiseasesandtherapeuticprospectsforinhibitors."BritishJournal ofPharmacology153(1):6-20中提到的化合物类型和特定的化合物；并且还参 见Aldinietal(2007)InterventionStrategiestoInhibitProteinCarbonylationby Lipoxidation-DerivedReactiveCarbonylsMedicinalResearchReviews27(6), 817-868中的化合物类型和特定的化合物)。还参见以下实施例5中讨论的化 合物和治疗，其于2013年7月出版在杂志Chest中，作者Kirkham和Barnes。

在样品中确定对羰基化波形蛋白的抗体反应，如对羰基化波形蛋白的抗 体反应中IgG(或IgG1)与IgM的比值，被认为在监控疾病进展或评价治疗 方案的有效性方面是有用的。因此，(例如)COPDGOLD1受试者的(抗羰 基化波形蛋白)IgG:IgM比值从“低”比值至“高”比值的变化(如上所示) 可提供疾病进展的早期指示(可能连同其他评价，如FEV1和CT扫描)(其 可能指示治疗方案应该停止或改变，或(例如在临床试验方面)不被选择用 于进一步的研究)。(例如)COPDGOLD2或GOLD3受试者的(抗羰基化波 形蛋白)IgG:IgM比值从“高”比值至“低”比值的变化(如上所示)(可能 连同其他评价，如FEV1和CT扫描)可提供疾病改善的指示(其可指示治 疗方案应该继续，或(例如在临床试验方面)应被选择用于进一步的研究)。 因此，评价IgG:IgM比值可用于监控该受试者的疾病进展和/或针对该受试者 的治疗方案的有效性。这还可以用在临床试验方面，其中出于监管目的(如 与治疗剂或治疗方案的市场审批相关，或与成本效益/补偿评价 (reimbursementassessment)相关)，评价治疗方案的有效性。因此，(抗羰 基化波形蛋白)IgG:IgM比值(例如)可在与COPD相关的临床试验中用作 生物标记或替代终点(surrogateendpoint)。

从受试者获得的样品可以是其中能够确定抗体反应的任何样品类型。如 本领域技术人员所熟知的，样品通常可以是血液或血清样品，但可以是例如 另一种体液或组织，如唾液或尿液或痰或组织活检(如肺)。

当受试者首次显示出可能的COPD(例如，或在试验中首次登记)时； 之后以定期间隔(如每六个月或每年)或当受试者的疾病似乎出现变化时， 可从一个或多个受试者获得样品(如在特定治疗性方案或治疗方案的临床试 验期间)。例如，可以在患有COPD的受试者经历恶化时或在其之后立即从 受试者获得样品。

与不具有临床确认的COPD的已知对应受试者(如健康的不吸烟者)相 比，指示存在更加晚期的COPD(GOLD2或GOLD3或GOLD4)的高可能 性的(对羰基化波形蛋白的抗体反应中)IgG(或IgG1)与IgM的比值可以 定义为在患有临床确认的COPDGOLD2、GOLD3或GOLD4的已知受试者 的至少一个子组中存在的增加(高)的比值。在患有COPDGOLD2、GOLD3 或GOLD4的受试者中，羰基化波形蛋白的抗体反应中IgG与IgM的比值可 以是例如至少4或4.5，如至少5或6。在不具有COPD或不具有GOLD2、 GOLD3或GOLD4COPD的受试者中，如在患有GOLD1(但不具有GOLD2 或GOLD3或GOLD4)的不吸烟者中、吸烟者或受试者中，对羰基化波形蛋 白的抗体反应中IgG与IgM的比值可以是例如降低(低)的比值，并且可以 是小于4或3.5，如小于3。

可以以任何合适的方式确定样品中的对羰基化波形蛋白的抗体反应，任 选地对羰基化波形蛋白的抗体反应中IgG(或IgG1)与IgM的比值。如本领 域技术人员所熟知的，可以使用定量分析，该定量分析通过酶联免疫吸附测 定(ELISA)测量或替代的基于免疫学的测定形式。例如，免疫印迹法、免 疫组织化学法、放射性免疫测定、ELISPOT为可使用的技术的实例。还可以 使用利用抗体或其亚组成片段的免疫学性质的任何其他方法，以有助于评价 对羰基化波形蛋白的抗体滴度或免疫反应性，从而允许测定IgG/IgM或其相 反的比值。可以使用如酶联-、荧光染料联-或放射性同位素联-二级检测试剂 定量抗羰基Ab或其片段。

例如，可以使用ELISA测定，使用羰基化波形蛋白多肽作为靶蛋白并且 (例如)使用对IgG(或IgG1)和IgM具有特异性从而测定IgG或(IgG1) 和IgM组分的第二抗体，来评价对羰基化波形蛋白的抗体反应。实施例1提 供了合适的试剂和分析的实例。可以通过用丙二醛(MDA)或任何其他反应 性羰基或其组合，如4-羟基壬烯酸、丙烯醛或甲基乙二醛处理，使波形蛋白 羰基化。例如，实施例1描述了羰基化波形蛋白多肽的制备。合适的试剂来 源(如SigmaAldrichInc)也描述在如Kirkhametal(2011)AmJRespirCrit CareMed184,796-802中。

还可以使用其他测定形式，如放射性免疫测定(RIA)、免疫放射分析 (IRMA)和免疫酶测定(IEMA)，包括使用单克隆抗体和/或多克隆抗体的 夹心法。

可能有用的是，测定是以能够在护理环境(caresetting)中快速且可靠 地使用的形式，如在手术环境或出诊时或在紧急评估或治疗中心由全科医生 或护士(如COPD专科护士)使用。测定可以是受试者本人能够使用的形式， 如在受试者家中，例如是受试者本人主动购买的，或作为医护人员(health professionals)同意的护理方案的一部分。或者，可能有用的是，测定是适合 于高通量的形式，如基于微芯片的测定。当该评价作为评价治疗方案的一部 分时，如作为临床试验的一部分时，这样的形式可能是特别有用的。

仅能够结合羰基化波形蛋白的抗体与能够结合羰基化波形蛋白和非羰基 化波形蛋白两者的抗体的区分，被认为没有必要。因此，评价结合到羰基化 波形蛋白的抗体，被认为足以。如本领域技术人员所熟知的，通常，羰基化 波形蛋白是天然羰基化波形蛋白，即不是例如通过暴露于过量的热或极端的 pH或盐浓度而已经故意变性的波形蛋白。实施例1的评价中用作靶蛋白的羰 基化波形蛋白被认为是适合于实施本发明的天然波形蛋白的实例。

使用二硝基苯肼测定检验实施例1中使用的波形蛋白，该二硝基苯肼测 定检测所述蛋白质的羰基修饰(参见Kirkhametal2011)，但是并不认为对天 然结构的任何其他检验或另外的检验是相关的。

应了解，对结合羰基化波形蛋白的抗体的评价可使用波形蛋白的羰基化 片段来评价。可以通过本领域技术人员熟知的技术容易地确定所述合适的片 段。例如，赖氨酸上的ε氨基是羰基化的合适位点，只要该位点可用于体内 修饰。类似地，如果赖氨酸或任何其他氨基酸或肽上的α氨基可用于体内修 饰，其也可以被羰基化。表位作图研究可用于鉴别特别合适的片段。

波形蛋白序列是熟知的，并且可参见例如

IDOMIM:193060MGI:98932

HomoloGene:2538

http://en.wikipedia.org/wiki/GeneCards

优选地是，羰基化波形蛋白多肽是羰基化人类波形蛋白多肽。优选地是， 羰基化人类波形蛋白多肽是羰基化全长人类波形蛋白。

本发明的方法还包括评价测试样品中所述对羰基化波形蛋白的抗体反 应，任选地所述对羰基化波形蛋白的抗体反应中的IgG(或IgG1)与IgM的 比值，以及对照样品中它们的比较。

本发明的又一方面提供了用于评价COPD(如用于评价COPD的严重 度)、监控疾病进展或评价治疗方案的有效性的试剂盒(kitofparts)，其包括： (1)试剂，其能够专门用于评价样品中对羰基化波形蛋白的抗体反应，任选 地所述对羰基化波形蛋白的抗体反应中IgG(或IgG1)与IgM的比值。该试 剂盒可任选地适合作为点护理试剂盒(pointofcarekit)，如可以配置成能够 在例如在启动具体评价后(例如从受试者获取样品后)小于约6、3、2或1 小时内(如小于30分钟内)提供读出。该试剂盒可以被配置成经由可视信号 提供读出，该可视信号在没有使用仪器下就可以理解；或可以包括将读出传 递至远端的使用仪器、软件或指令。

能够特别用于评价样品中对羰基化波形蛋白的抗体反应，任选地所述对 羰基化波形蛋白的抗体反应中IgG(或IgG1)与IgM的比值的试剂可以是羰 基化波形蛋白多肽，其任选地设置在或涂布在适合于实施免疫测定(如ELISA 测定)的支持体(如微量滴定板或微芯片)上。

优选地，试剂盒还包括对照样品。对照样品可以是阴性对照(其可以含 有未患有COPD的受试者的血清，具有例如在对羰基化波形蛋白的抗体反应 中低的IgG:IgM比值的受试者的血清)，或其可以是阳性对照(含有患有 COPDGOLD2、3或4的受试者的血清，所述受试者已知在对羰基化波形蛋 白的抗体反应中具有高IgG:IgM比值)。例如，阴性对照可以是血清稀释缓 冲液。试剂盒可含有阴性对照和阳性对照。有用地是，试剂盒可含有可与羰 基化波形蛋白反应的不同量的抗体对照品，从而可制成校准曲线。

有用的是，试剂盒可含有对照品和检测材料(如对于免疫组织化学，第 二抗体标记的荧光团或酶或生物素或地高辛等)。对于免疫测定，试剂盒的额 外组分可包括例如针对一种抗体类型(如IgM或IgG)的一种或多种第二抗 体(任选地具有标记或连接到支持体)，以及稀释和反应缓冲剂。有用的是， 本发明的所有试剂盒均可以包含类似的额外组分。

本发明的又一方面提供了一种试剂，其能够专门用于评价样品中对羰基 化波形蛋白的抗体反应，任选地所述对羰基化波形蛋白的抗体反应中IgG(或 IgG1)与IgM的比值，以帮助分类或确定患有COPD的受试者的预后，或帮 助选择针对患有COPD的受试者的治疗策略，或帮助监控COPD的疾病进展 或评价针对COPD的治疗方案的有效性。

本发明的又一方面提供了一种试剂在制备用于帮助分类或确定患有 COPD的受试者的预后，或帮助选择针对患有COPD的受试者的治疗策略， 或帮助监控疾病进展或评价针对COPD的治疗方案的有效性的药物中的用 途，其中所述试剂能够专门用于评价样品中对羰基化波形蛋白的抗体反应， 任选地所述对羰基化波形蛋白的抗体反应中IgG(或IgG1)与IgM的比值。

如上文所讨论的，所述试剂可以是例如羰基化波形蛋白多肽。

如果受试者的抗羰基化波形蛋白的IgG:IgM比值高(如上所示)，则所 选的治疗方案可以并入以下一种或多种：免疫调节治疗(如antiCD20； anti-IL17；补体抑制剂，例如认为阻断抗体依赖性补体介导的组织破坏的补 体抑制剂，如艾库组单抗(Eculizumab,一种抑制补体因子C5的人源单克隆 抗体)或Schrezenmeier&(2012)TransfusApherSci.2012 Feb；46(1):87-92.Drugsthatinhibitcomplement.doi: 10.1016/j.transci.2011.11.012.Epub2011Dec13中提到的另外的实例)；抗氧 化剂治疗(如n-乙酰半胱氨酸，BiswasS,HwangJ,KirkhamPAandRahmanI (2012)TherapeuticinterventionforOxidativeandCarbonylstressinRespiratory disease.CurrMedChem–EPubaheadofprint)；或抗羰基化剂(如二甲双胍； AGE化合物；还参见Negre-Salvayre,A.,C.Coatrieux,etal.(2008)."Advanced lipidperoxidationendproductsinoxidativedamnagetoproteins.Potentialrolein diseasesandtherapeuticprospectsforinhibitors."BritishJournalof Pharmacology153(1):6-20中提到的化合物类型和具体化合物；和还参见 Aldinietal(2007)InterventionStrategiestoInhibitProteinCarbonylationby Lipoxidation-DerivedReactiveCarbonylsMedicinalResearchReviews27(6), 817-868中提到的化合物类型和具体化合物)。还参见以下实施例5中讨论的 化合物和治疗，其于2013年7月出版在杂志Chest中，作者Kirkham和 Barnes。

不期望受到理论的束缚，认为高IgG:IgM比值可以反映潜在有害的抗羰 基化波形蛋白IgG水平的升高(如IgG1水平升高，其能够导致补体活化) 和/或潜在保护性抗羰基化波形蛋白IgM水平的降低。因此，免疫调节治疗对 这样的受试者是特别有用的。抗氧化或抗羰基化治疗对这样的受试者也可以 是特别有用的，因为抗羰基化IgG:IgM的高比值可表示存在氧化应激/羰基化 状态，或易受氧化应激/羰基化状态影响。可替代地或另外地，可以认为这些 或其他治疗方案中的一种或多种是相对具有攻击性(aggressive)的治疗方案 (例如，因为可能存在略高的副作用风险)，结果是治疗可能仅仅或主要推荐 给被评价为具有较高疾病进展风险和/或治疗受益的可能性较高(其中之一或 两者可基于抗羰基化IgG:IgM的高比值)的患者。(例如)可以更加频繁地 (例如每1个月至每2个月)监控受试者的IgG:IgM比值。

选择性的/有目标的使用用于禁烟或经设计用于缓解群体风险的其他干 预的强烈支持(intensesupport)也可以表明具有高IgG:IgM比值的人群的群 组。

如果受试者的抗羰基化波形蛋白IgG:IgM比值低(如上所示)，则所选 择的治疗方案可以是不太具攻击性的治疗方案。通常，会采用根据标准化标 准的最佳护理标准管理患者(参见以上示出的GOLD网站)。实例可包括观 察等待(watchfulwaiting)。(例如)可以更低频率地(如每年)监控受试者 的IgG:IgM比值。

本发明的又一方面提供了治疗患有COPD的受试者的方法，所述方法包 括向受试者施用针对抗羰基化波形蛋白抗体的抗独特型抗体或抗体片段；或 非补体活化的抗羰基化波形蛋白抗体或抗体片段。制备抗独特型抗体或抗体 片段的方法将是本领域技术人员熟知的。同样地，非补体活化的抗体或抗体 片段以及产生能够结合羰基化波形蛋白的此类抗体的方法将是本领域技术人 员熟知的。参见如Anetal(2009Nov-Dec)MAbs.20091(6):572–579. PMCID:PMC2791314IgG2m4,anengineeredantibodyisotypewithreducedFc function。还参见Siberiletal(2007)AnalNewYorkAcadSciVol1110, p497-506。还参见Valim&LachmannClinExpImmunol.1991Apr；84(1):1-8, Theeffectofantibodyisotypeandantigenicepitopedensityonthe complement-fixingactivityofimmunecomplexes:asystematicstudyusing chimaericanti-NIPantibodieswithhumanFcregions。

不期望受到理论的束缚，认为这样的试剂可有效减少可能由抗羰基化波 形蛋白抗体(特别当存在抗羰基化波形蛋白抗体的高IgG:IgM比值时)引起 的对内皮细胞的损伤，如补体介导的损伤。

因此，受试者任选地是其中已确定抗羰基化波形蛋白抗体的IgG:IgM比 值高(如上所示)的受试者。

本发明的又一方面提供了针对抗羰基化波形蛋白抗体的抗独特型抗体或 抗体片段；或者非补体活化的抗羰基化波形蛋白抗体或抗体片段，用于治疗 患有COPD的受试者的，任选地其中已确定抗羰基化波形蛋白抗体的 IgG:IgM比值高的受试者。

本发明的又一方面提供了针对抗羰基化波形蛋白抗体的抗独特型抗体或 抗体片段，或者非补体活化的抗羰基化波形蛋白抗体或抗体片段，在制备用 于治疗患有COPD的患者的，任选地其中已确定抗羰基化波形蛋白抗体的 IgG:IgM比值高的受试者的药物中的用途。

应理解，抗体样分子可用于本发明的用途、药物或方法，该抗体样分子 包括例如保留了其抗体结合位点的抗体片段或衍生物、合成的抗体样分子(如 单链Fv片段(ScFv)和结构域抗体(dAb))和具有抗体样抗原结合基序的 其他分子。

在又一个实施方案中，受试者可以施用额外的抗COPD试剂或治疗，例 如如上所示的免疫调节性的、抗氧化的或抗羰基化的试剂。可以单独地或一 起配制或施用所述试剂。

本发明的又一方面提供了鉴别可能用于治疗COPD的化合物的筛选方 法，所述方法包括确定在来自接受测试化合物的受试者的样品中测试化合物 对针对羰基化波形蛋白的抗体反应(任选地所述抗体反应中的IgG:IgM比值) 的作用；并且选择正调节所述抗体反应(任选地降低所述IgG:IgM比值，任 选地从高水平至低水平(如上所示)，或防止或降低所述IgG:IgM比值从低 水平升高至高水平)的化合物。受试者可以是人或可以是非人动物。例如， 可使用Kirkham等人(2011)描述的臭氧动物模型。合适的测定如上所述。所 述化合物可以是例如免疫调节性的、抗氧化的或抗羰基化的化合物。

现参照以下非限制性附图和实施例更加详细地描述本发明。

附图说明

图1.针对天然的和羰基修饰的弹性蛋白的自身抗体反应

通过在方法中详述的ELISA和所确定的滴度，筛查血清对天然的(a) 或羰基修饰的(b)弹性蛋白的反应性。对于每个患者组，结果表示为平均值 ±SEM。使用Kruskal-Wallis检验进行统计学分析，p>0.05。

图2.针对羰基修饰的胶原蛋白IV的自身抗体反应

通过在方法中详述的ELISA和所确定的滴度，筛查血清对羰基修饰的胶 原蛋白V的反应性。对于每个患者组，结果表示为平均值±SEM。使用 Kruskal-Wallis检验进行统计学分析，p>0.05。

图3.针对内皮细胞的自身抗体反应

通过在方法中详述的ELISA和所确定的滴度，筛查血清对全内皮细胞的 IgG(a)和IgM(b)免疫反应性。对于每个患者组，结果表示为平均值± SEM。计算IgM:IgG比值，并表示为平均值±SEM。使用Kruskal-Wallis检 验进行统计学分析，与不吸烟者相比，*p<0.05,**p<0.01。

图4.针对天然的和修饰的波形蛋白的自身抗体反应

通过在方法中详述的ELISA和所确定的IgG滴度，筛查血清对天然的、 羰基化的或瓜氨酸化的(citrullinated)波形蛋白的免疫反应性。对于每个患 者组，结果表示为平均值±SEM。使用Mann-WhitneyU检验进行统计学分 析，*:p<0.05,**:p<0.01。

图5.对羰基修饰的波形蛋白的自身抗体反应

通过在方法中详述的ELISA和所确定的滴度，筛查血清对天然的、羰基 化的波形蛋白的反应性。对于每个患者组，结果表示为平均滴度值±SEM， 或IgM.IgG的比值±SEM。使用Kruskal-Wallis检验进行统计学分析(相对 于不吸烟者(NS)*:p<0.05，**:p<0.01；相对于吸烟者#:p<0.05，###: p<0.001)。

图6.针对羰基修饰的波形蛋白的IgG/IgM自身抗体比值

通过在方法中详述的ELISA和所确定的滴度，筛查血清对天然的、羰基 化的波形蛋白的反应性。对于每个患者组，结果表示为平均滴度值±SEM， 或IgG:IgM的比值±SEM。使用Kruskal-Wallis检验进行统计学分析(相对 于吸烟者*:p<0.05，**:p<0.01；相对于不吸烟者(NS)#:p<0.05,##:p<0.01)。

图7.概述GOLD评价标准的图

图8.COPD肺&补体介导的内皮细胞死亡中激活的补体沉积

图9.氧化应激通过形成羰基应激来驱动COPD发展的机制。来自环境 和细胞来源的氧化应激通过脂质过氧化以及蛋白质和糖的氧化引起组织损 伤，导致羰基应激形成。羰基应激转而引起对蛋白质的非酶促翻译后修饰， 这能够改变蛋白质功能，并导致危险相关分子模式(DAMP)和新自身抗原 的形成。重要的是，通过羰基应激对线粒体蛋白质的损伤仅有助于驱使受损 伤的线粒体进一步产生内源性ROS。总之，这些羰基修饰的蛋白质有助于驱 动与COPD发展相关的病理生理学机制。

图10：中和COPD中的氧化应激的不同治疗方法概述。硫醇、氧化物 清除剂和过氧化物酶模拟物直接靶向并中和氧化应激。SOD模拟物和Nrf2 活化剂试图补充减少的SOD和COPD中缺少的Nrf2活性。NADPH氧化酶 (NOX)和髓过氧化物酶(MPO)抑制剂将中和并因此减少氧化应激。

实施例1：COPD中的抗体反应

尽管不是所有的吸烟者都将会显示出症状，但暴露于环境ROS/RNS(如 烟草烟雾)被认为是COPD发展的单个最大风险因素。即使在戒烟后，肺部 炎症仍然存在，这表明炎症是由直接暴露于烟雾之外的其他因素驱动。烟草 烟雾是超过5000种化合物的复杂混合物(Talhout,Schulzetal.2011)，其中 包含已知具有毒性和/或致癌性的许多化合物。此外已显示，烟草烟雾的组分 或损伤组织的氧化应激(如脂质过氧化)容易直接修饰蛋白质(如存在的反 应性羰基产物能够在体外和体内不可逆地修饰蛋白质(Cerami,Foundsetal. 1997；NichollandBucala1998；Nicholl,Stittetal.1998；Negre-Salvayreetal. 2008；Burchametal.2010)，或促进酶的释放，例如瓜氨酸化(Makrygiannakis, Hermanssonetal.2008)，即将蛋白质中的精氨酸残基酶促转化成瓜氨酸。导 致足够的构象改变的这一性质的修饰可赋予蛋白质潜在地免疫原性，即产生 “新抗原”。

我们希望确定这类修饰是否能够促进可检测的免疫反应，并且在这一实 施例中，我们报道了我们的发现，其着眼于对处于天然形式和通过羰基化的 以下修饰形式的几种丰富的结构蛋白的抗体反应，以及对内皮细胞的抗体反 应。

方法

患者和血清

在当地道德委员会(EthicsCommittee)批准下，从意大利费拉拉大学医 院的呼吸科(SectionofRespiratoryMedicineoftheUniversityHospitalof Ferrara,Italy)征募受试者。根据赫尔辛基宣言列出的准则，从每个参加者获 得书面知情同意书。如Kirkhametal2011(Kirkham,Caramorietal.2011)所 描述，收集、处理和储存静脉外周血。根据出版的指南，如Varanietal2006 (Varani,Caramorietal.2006)所描述进行肺功能测试。通过Quanjer (Waalkens,Merkusetal.1993)公开的回归方程，计算不同测量的预测值。 根据国际指南(支气管舒张剂后FEV1/FVC比值<70％)界定COPD，并且根 据当前GOLD标准(http://www.goldcopd.org/)将COPD的严重度分类。受 试者详细信息归纳在表1中。

蛋白质的来源

从MarleneRose教授(HarefieldHospital,England)处获得了全长天然重 组波形蛋白。弹性蛋白和胶原蛋白IV从Sigma购买。

波形蛋白的瓜氨酸化

根据Bangetal2007(Bang,Egereretal.2007)的方法，使波形蛋白瓜氨 酸化。简而言之，使波形蛋白与40单位/毫克蛋白质的兔肌肉肽基精氨酸脱 亚胺酶(PAD；Sigma)在55℃下在含有50mMTrisHCl、5mMCaCl2、2mM DTT、0.5mMEDTA、5mM甲基氯化铵的缓冲液(pH7.4)中反应3小时。 加入最终浓度为50mM的EGTA(pH8.0)以终止反应。

蛋白质的丙二醛修饰

使用Haberlandetal1982(Haberland,Fogelmanetal.1982)描述的修饰 方法进行丙二醛修饰。简而言之，通过将162μl的丙二醛双(二甲基乙缩醛) (AlphaDiagnostics)与200μl的2MHCl混合来生产0.2MMDA母液。在室 温下孵育15min后，加入4.8ml磷酸缓冲液(pH6.4)，并用NaOH中和溶液。

将等体积的1mg/ml的弹性蛋白或波形蛋白与活化的MDA溶液混合，并 在37℃下孵育24h。通过针对PBS的透析，从溶液中除去未反应的MDA。 为了修饰胶原蛋白，将蛋白质结合到微量滴定板上，然后在37℃下用0.1M活 化的MDA孵育24h。抽出MDA溶液，并且板用PBS洗涤两次。

ELISA方案

通过使用0.1μg/孔靶蛋白包被的96孔NuncMaxisorb免疫板的ELISA， 筛查患者血清对天然的或修饰的蛋白的抗体。加入一系列血清稀释品，并且 使用合适的第二抗体针对IgG或IgM评价结合抗体。

抗内皮细胞ELISA

使用人脐静脉内皮细胞单层开展活细胞ELISA，以筛查患者血清对全内 皮细胞的反应性。将细胞接种在包被有明胶的微量滴定板上，过夜，洗涤并 暴露于一系列测试血清稀释品。使用合适的第二抗体评价所结合的IgG和 IgM。

统计学分析

使用GraphPadPrism进行所有的统计学分析。抗体滴度表示为平均值± SEM。使用Mann-Whitney和Kruskal-Wallis检验确定各组间的差异，并且p 值<0.05被认为是统计学显著的。

结果

对天然的和羰基修饰的弹性蛋白无自身抗体反应

由于初始报道详细描述了在吸烟诱发的肺气肿中抗弹性蛋白自身免疫性 (Lee,Goswamietal.2007)，几个小组已经注意到它，但是并不能够确认这 些结果(Cottin,Fabienetal.2009；Greene,Lowetal.2010；Brandsma,Kerstjens etal.2011；Rinaldi,Lehoucketal.2012)。我们筛查了我们群组的抗天然和羰 基化弹性蛋白的抗体(图1)。任意组之间针对未修饰或羰基修饰抗原的抗体 滴度没有统计学显著的差异。

对胶原蛋白IV的抗体反应

使用板内MDA修饰的IV型胶原蛋白包被板用于筛查患者血清对这一抗 原的抗体反应(图2)。在任意组之间检测到抗体滴度没有统计学显著的差异。

COPD中增加的抗内皮IgG自身抗体反应和降低的IgM/IgG比值

在使用人脐静脉内皮细胞的活细胞ELISA中检测患者血清对内皮细胞 的反应性(图3)。与健康不吸烟者相比，患有COPD的受试者的针对内皮细 胞的IgG自身抗体水平显著升高，并且在无症状的吸烟者中也升高(图3a)。 各组间IgM滴度也没有统计学差异(图3b)。在不吸烟者中IgM与IgG的比 值最高，在无症状吸烟者和COPD中下降，且在GOLD3组中具有最低比值 (图3c)。

针对天然的和修饰的波形蛋白的自身抗体反应

突变的瓜氨酸化波形蛋白的抗体在类风湿性关节炎中具有诊断和预后价 值，使其成为在其他慢性炎性环境中调查的受关注的抗原。检测血清样品中 针对天然波形蛋白以及瓜氨酸化和羰基化波形蛋白的抗体(图4)。针对三种 抗原，与不吸烟者相比，COPD阳性样品中的抗体滴度统计学显著增加，这 指示针对天然的和修饰的波形蛋白均具有免疫反应。

对羰基化波形蛋白的抗体反应的进一步分析(图5和6)显示了，与不 吸烟者相比，在无症状吸烟者以及患有中度和严重COPD(GOLD2和3)的 个体中IgG滴度均升高(图5a)。患有轻度COPD(GOLD1)的个体的IgG 滴度与不吸烟者没有显著差异。相反，虽然相比于不吸烟者，无症状吸烟者 的IgM滴度升高(约三倍)，在不吸烟者与患有COPD的患者之间滴度没有 统计学显著的差异(图5b)。最终，我们查看了IgM与IgG的比值(图5c) 和IgG与IgM的比值(图6)。对于IgM/IgG(图5c)或IgG/IgM(图6)这 两个比值，无症状吸烟者或GOLD1与不吸烟者之间没有统计学显著的差异； 然而，在这两种情况中，GOLD2和3的比值与不吸烟者相比具有显著的差 异(图5c和图6)。此外，在IgG与IgM的比值的情况下，不仅GOLD2和 3中该比值相对于不吸烟者存在非常显著的增加，而且这一比值相对于无症 状吸烟者也显著增加(图6)。这些结果表明，通过同时考虑IgM和IgG反 应，对羰基化波形蛋白的抗体反应能够用于鉴别更加晚期的COPD。

在图5c和图6中，IgM/IgG和IgG/IgM比值不可精确互换。这被认为是 因为分别计算每个患者的比值，然后对于每个患者疾病组，以平均比值+/- SEM绘图。因此，每个组各自的IgG/IgM和IgM/IgG比值将不必然是彼此镜 像的。如果作为替换方案，每个组作为整体用于IgG/IgM，然后互换以获得 镜像的IgM/IgG比值，则会获得镜像图像。由于每个组(参考表1)患者数 量少，那么由于变异性(variability)而引起的误差将大于患者数量多的情况。 随着患者数量增加，则变异性应该变少，个体患者比值的均值应该开始彼此 更加接近镜像。

讨论

COPD是全世界范围内致病和致死的主要原因，估计到2020年成为第三 大常见死因(MurrayandLopez1997)。1秒钟用力呼气量(FEV₁)是目前最 频繁使用的疾病严重度和进展的量度，但是与症状和其他疾病标志相关性不 太好。目前，更加关注于合适生物标志的鉴定，该生物标志准确反映疾病状 态并因此证明能用作诊断、监控进展中的替代物和用作临床试验的终点(end point)。

COPD是复杂的多因素疾病，其激活先天免疫反应和获得性免疫反应两 者，所述免疫反应的产物容易检测。该研究集中于识别针对天然构象或修饰 后的自身蛋白的血清抗体反应，所述修饰与氧化应激相关，例如羰基化和瓜 氨酸化，导致可能赋予蛋白质免疫原性的构象改变。

羰基化是反应性羰基化物(如由于脂质过氧化而形成的那些)对蛋白质 或肽(如在半胱氨酸、组氨酸和/或赖氨酸残基上)的不可逆共价修饰。所述 过氧化反应的终产物之一丙二醛(MDA)被用作氧化应激的生物标志 (Rahman2005；ChungandAdcock2008)。已显示诸如这些的这些羰基加合 物在吸烟者的血清和组织中以比不吸烟者更高的水平增加。

观察到，与来自不吸烟者的样品相比，在COPD阳性样品中存在针对天 然蛋白和修饰蛋白两者的升高的抗波形蛋白抗体滴度。当研究对羰基化波形 蛋白的抗体类型反应时，明显看出，在更加晚期的COPD样品中IgG滴度增 加而IgM反应没有升高。相反，在无症状吸烟者中，IgM和IgG均升高，而 在患有轻度COPD的受试者中滴度仍然在基线。这表明，可证明抗体类型比 值比单抗体测量更有用。

自从Leeatal(Lee,Goswamietal.2007)的最初报告报道了在烟草烟雾 诱导的肺气肿中的抗弹性蛋白自身免疫性，已经公开了几个报告(Cottin, Fabienetal.2009；Greene,Lowetal.2010；Brandsma,Kerstjensetal.2011； Rinaldi,Lehoucketal.2012)，其中作者不能够确认与抗弹性蛋白免疫反应相 关的疾病。基于此，我们筛查了我们的群组的针对天然的和羰基化的弹性蛋 白的抗体。我们发现，在任意组之间针对未修饰或羰基修饰的抗原的抗体滴 度没有统计学显著的差异。

肺中高水平的胶原蛋白重塑是COPD的标志，释放可具有潜在免疫原性 或直接用作生物标志的肽片段。事实上，Leeming等人(Leeming,Sandetal. 2012)最近已经报道了，与对照受试者相比，患有轻度COPD的受试者的血 清中基质金属蛋白酶分解的胶原蛋白I、III、IV、V和VI型的水平显著升高。 IV型胶原蛋白是肺中最丰富的非纤维胶原蛋白，存在于基膜中(Konomi, Hayashietal.1984)，并且已经报道了在患有COPD的患者的肺中的表达和蛋 白质水平升高(Kranenburg,Willems-Widyastutietal.2006)。我们没有观察到 COPD受试者、不吸烟对照或无症状吸烟者之间血清抗体滴度的任何差异。 还筛查了其他胶原蛋白，其中胶原蛋白V作为数个慢性疾病(包括呼吸疾病) 的自身抗原正在引起关注，已经显示其产生T细胞免疫，而该T细胞免疫在 吸烟者中更加普遍(Rinaldi,Lehoucketal.2012)。

虽然我们主要致力于具体基质蛋白，但我们也使用了活细胞ELISA研究 了对全内皮细胞的抗体反应。与不吸烟者相比，来自COPD患者和无症状吸 烟者的血清均显示出IgG的水平升高。虽然不是统计学显著的，但GOLD3 组的IgM滴度降低，使得当查看IgM:IgG比值时，与不吸烟者相比，存在显 著降低。虽然不显著，但这是与GOLD2和无症状吸烟组中类似的趋势，表 明由吸烟或COPD疾病进程驱动的针对细胞表面内皮蛋白的IgG驱动的反 应。

作为血源性生物标志，抗体是有吸引力的且方便的候选物，因为它们能 够通过最少的侵入程序而容易获得，在延长的一段时间内在血清中仍然稳定。 然而，它们的使用存在限制。抗体不是仅可由T细胞驱动的自身免疫型反应 的先决条件，因此，尽管我们不能够检测到针对我们所筛查的一些自身抗原 的抗体滴度升高，但其不必然意味着它们在疾病发病或进程中不起作用。此 外，个体的抗体滴度可随着时间大幅变化。在没有刺激物时，滴度将降低， 而在患有COPD的受试者的恶化事件(exacerbatoryepisode)后，可预期滴 度增加。尽管我们对羰基化波形蛋白的发现提示了子类比值与疾病状态之间 的潜在联系，这一结论是从小的组群和单个时间点获得。有必要将组群扩大， 并且对在延长的一段时间内取得的一系列样品进行分析。

表1：研究受试者详细信息

数据描述为平均值+/-SD。对于患有COPD的受试者(但不是吸烟者或 不吸烟者)，FEV1/FVC比值是在支气管舒张剂后。

缩写：pred＝预测的；M＝男性；F＝女性；FEV1＝1秒钟用力呼气 量；FVC＝用力肺活量。

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实施例2：COPD肺中激活的补体沉积和补体介导的内皮细胞死亡

GOLD3COPD中自身抗体/补体触发的内皮细胞死亡：

1％明胶以25μl/孔包被4x96孔板，并且在37℃下孵育30分钟。

除去明胶，并将在具有5％FCS的Med199中的细胞以1x10⁴HUVEC/ 孔接种。在37℃孵育。

除去培养基，并替换为具有5％测试血清的50μl/孔Med199。一式三份 的测试每个样品。在37℃孵育1h。

除去培养基，并且替换为含5％正常血清或热失活的正常血清的100μl Med199。在37℃孵育1h。

通过MTS测量细胞毒性/存活率。加入20μl/孔MTS试剂，并且在37℃ 孵育2h。在490nm读板。

每孔细胞死亡量表达为相对于未处理对照细胞的百分比。然后对于每个 患者测试样品，通过用未处理的血清孵育的孔中的细胞死亡量减去热失活的 血清处理的孔中的细胞死亡量计算由Ab-介导的活化补体引起的细胞死亡的 百分数。

对于健康对照受试者，热失活的血清和未处理的血清之间的细胞死亡没 有统计学显著的差异。相反，如通过配对学生t检验所确定的，具有来自 GOLD3COPD患者的Ab的热失活的和未处理的血清之间的细胞死亡百分数 是显著的(p<0.01)。

实施例3：适合于化合物筛查的测定形式

依据本文的教导，用于评价化合物(如抗独特型抗体/抗体片段)的合适 的测定或方案将是本领域技术人员熟知的。例如，可基于补体的免疫测定形 式进行测试，由此在加入到其中固定了羰基化抗原的免疫测定板之前首先使 抗独特型或化合物与血清样品一起孵育。可替代地，在加入血清样品之前， 首先可将抗独特型或化合物加入到具有抗原的板。可使用高通量形式。

实施例4：处理方案

潜在方案如下：

在首次就诊GP/临床医师时评估IgG/IgM比值，然后此后每年评估(或 如果经受重复的恶化事件则更加频繁)，直到IgG/IgM比值开始升高。然后， 可以启动治疗方案，并且按照需要的频率(如每月)监控IgG/IgM比值。继 续监控(如每月)，直到IgG/IgM比值降低，然后逐渐降低监控频率，直到 每年一次或两次。

COPD中的氧化应激

以下综述预计于2013年7月发表在杂志Chest中(KirkhamandBarnes)， 其列出了：

摘要

氧化应激目前被认为是COPD致病机制中的主要的诱发因素 (predisposingfactor)。COPD的现有治疗对于阻止疾病进展是低效的，且作 为药物疗法支柱的支气管舒张剂是仅提供症状缓解。因此，为了开发新的且 更加有效的治疗，更好地理解氧化应激驱动这些疾病发病的潜在机制至关重 要。由于烟草烟雾和恶化，COPD中抗氧化能力明显降低，且由于来自内源 性来源的活性氧簇(ROS)持续产生，氧化应激在戒烟后或恶化停止后继续 存在较长时间。我们讨论了氧化应激如何在肺中升高，其如何被中和，何种 遗传因子可诱发COPD的发展，并且这如何影响炎症和自身免疫性以及肺气 肿和小气道疾病的发展。最后，考虑了多种策略来中和COPD中存在的增加 的氧化负担。这一综述强调了为何当前的抗氧化剂策略迄今为止还是失败的， 并且何种有前途的替代方案即将出现。此外，许多研究已经显示，没有单个 “灵丹妙药”能够防止氧化应激，相反，可证明靶向多种亚细胞区室中的氧 化应激的组合治疗在COPD中更加有效。

关键词：活性氧簇，抗氧化剂，炎症，NF-κB，Nrf2，自身抗体

缩写

FEV11秒钟用力呼气量

GSH还原型谷胱甘肽

GST谷胱甘肽–S-转移酶

H₂O₂过氧化氢

HDAC组蛋白脱乙酰酶

4HNE4-羟基-2-壬烯醛

IL白细胞介素

MDA丙二醛

NF-κB核因子-κB

NOXNADPH氧化酶

Nrf2核红细胞-2相关因子2(nuclearerythroid-2relatedfactor2)

ROS活性氧簇

SOD超氧化物歧化酶

TGF转化生长因子

介绍

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一个主要的并且渐增的全球健康问题， 到2020年，其将成为全世界范围的第三大死因。在过去45年间，其正影响 着约10％的人口，但是这在重度吸烟者中升高至50％¹。驱动这一疾病的主要 病因可能是长期暴露于烟草烟雾或生物质燃料的燃烧产物之后肺内的氧化和 羰基应激²。由于内源性抗氧化防御受到遗传性上的损伤和/或被存在的活性 氧簇(ROS)破坏，氧化应激升高。这可转而导致羰基应激，其中对周围组 织的氧化性损伤导致高度反应性有机分子的形成，该高度反应性有机分子能 够非酶促地修饰蛋白质。COPD的特征为小气道的慢性炎症和重塑以及肺实 质的破坏(肺气肿)³。COPD的显著特征是在停止暴露于烟草烟雾时，其不 能消退，⁴这暗示了其他内源性因素如自身免疫性或持续的感染也可驱动该疾 病。^1,5

COPD中持续的肺和全身性氧化应激

存在COPD中氧化应激和羰基应激的证据，特别是在急性恶化期间。来 自COPD患者的肺泡巨噬细胞更加活跃，并且释放了增加量的过氧化物自由 基和过氧化氢(H₂O₂)形式的活性氧簇(ROS)⁶。类似的，来自COPD患 者的活化外周血中性粒细胞释放了增加量的ROS，特别在恶化期间。COPD 中氧化应激和羰基应激的标志包括硝基-酪氨酸⁷和脂质过氧化产物(如8-异 前列烷(8-isoprostane)、4-羟基-2-壬烯醛(4HNE)和丙二醛(MDA))的浓 度升高^8；9。相反，与患有稳定COPD的患者相比，内源性抗氧化剂谷胱甘肽 的浓度在来自频繁恶化的COPD患者的BAL液中更低¹⁰。尽管已经开发了 评估氧化应激的进一步改善的非侵入方法，但它们由于缺乏标准而受到限制 ¹¹。

尽管如此，在来自COPD患者的呼出气或呼出气冷凝物中，始终显示出 氧化应激的几种标志(如H₂O₂、一氧化碳、髓过氧物酶(MPO)^12,11)、氧化 性组织损伤的标志(如8-异前列烷¹³)和MDA形式的羰基应激¹⁴升高。此 外，COPD中全身性暴露于氧化应激也表示出呼吸道⁸和骨骼肌¹⁵中增加的 羰基加合物(如4-羟基壬烯酸)。

肺内ROS来源

肺特别易受到来自环境氧化应激的损伤，这部分是由于其解剖学结构。 肺始终暴露于由线粒体呼吸和对肺内的细菌和病毒感染的炎性反应产生的内 源性氧化应激源。空气传播的氧化应激的环境来源包括来自工业污染物和汽 车尾气的氧化气体和超微颗粒物和纳米颗粒。然而，在西方世界中引起COPD 的一个最重要的病因是吸烟，且在发展中国家，吸入来自封闭的烹饪用火的 燃烧产物是重要的额外病因¹⁶。

暴露于烟草烟雾能够驱动COPD的发作，一旦疾病已经产生，戒烟将不 会阻止氧化应激的继续存在和疾病的进展¹⁷。氧化应激的继续存在最可能是 由内源性来源(如线粒体呼吸)产生的。事实上，气道上皮细胞在暴露于羰 基应激时，引起了线粒体源的ROS的产生¹⁸，并且当经受来自IL-1、TNF□ 和IFN□的炎性应激时，COPD患者的气道平滑肌细胞产生了更大量的线粒体 源ROS。途径分析已经识别出围绕复合体I和III的线粒体功能障碍与COPD 紧密相关¹⁹。此外，细胞内ROS的其他来源包括细胞质ROS产生酶(如 NADPH氧化酶，NOX)和黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统以及血红素过氧化物酶， 它们的水平在COPD患者气道的支气管灌洗液和炎性细胞中升高^20；21。

大量产生的超氧化物自由基是相对弱的氧化剂，但其为其他破坏性更强 的ROS物质的前体(图1)，所述其他破坏性更强的ROS物质如在COPD中 升高的羟基自由基²²，或由超氧化物与氮氧化物快速反应形成的非常强力的 破坏性过氧化亚硝酸根自由基²³。类似地，在COPD患者的肺中累积的活化 中性粒细胞释放的MPO产生非常有破坏性的次氯酸。然而，在健康细胞中， 细胞内抗氧化防御能够有效除去这些ROS物质，因此限制了其影响。

COPD中的羰基应激

ROS产生与蛋白质、脂质、糖和DNA的氧化直接相关。最主要的结果 是反应性羰基化物的形成以及它们与蛋白质的反应，另外称为蛋白质羰基化。 反应性羰基化物的这种累积及随后的蛋白质羰基化通常被称为“羰基应激”。 其主要与慢性疾病²⁴和老龄化相关。不同于其他翻译后修饰，蛋白质羰基化 是非酶促的，并且靶向特异性肽残基，如赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸和组氨 酸。

逐渐认识到，蛋白质羰基化是与许多慢性疾病相关的潜在病变的主要驱 动因素²⁵，其存在于吸烟者和COPD患者²⁶。在COPD患者的肺中也检测到 游离羰基化物(如脂质过氧化的主要产物MDA)的水平增加⁹。如1秒钟用 力呼气量(FEV₁)的降低所测量的，羰基应激的水平与疾病严重度相关⁸。 类似于许多翻译后蛋白质修饰，蛋白质羰基化能够修饰蛋白质功能，破坏正 常细胞功能和生理学机制²⁷。

肺内的抗氧化剂防御

由于肺始终暴露于氧化应激的外部来源和内源性来源，已经开发出许多 有效的抗氧化防御策略，其中谷胱甘肽(GSH)起到重要作用。此外，产生 的所有谷胱甘肽的达20％发现于线粒体内，目的是为了中和作为代谢副产物 的内源性ROS的产生²⁸。保护肺的暴露表面免受环境影响的是上皮细胞衬液， 其含有几种抗氧化剂，包括抗坏血酸(维生素C)，α-生育酚(维生素E)和 尿酸。较大分子(如白蛋白和黏液素)由于存在暴露的巯基，也可作为牺牲 性抗氧化剂(sacrificialanti-oxidant)。若干研究已经显示，在COPD中，肺 内的抗氧化剂(如α-生育酚和抗坏血酸)的水平降低与肺功能恶化明显相关。 然而，这可以简单地反映了由于重复的恶化而导致的氧化性负担增加。目前， 没有研究显示膳食补充抗氧化剂导致临床改善²⁹。然而，一个10年追踪研究 的确发现，抗氧化剂补充将发展成慢性肺病的风险降低了10％³⁰，并且降低 了肺内的羰基应激水平³¹。

将来自健康受试者的气道上皮细胞暴露于急性氧化应激，通过上调GSH 合成中的关键酶谷氨酰半胱氨酸连接酶的表达和活性，触发了GSH合成的增 加³²。然而，在吸烟者和COPD患者的中央支气管上皮周围以及在肺泡巨噬 细胞内，这种酶的量降低³³，这表明是一种缺陷性调节机制。对于其他GSH 依赖性抗氧化剂酶谷胱甘肽-S-转移酶pi同工酶、谷胱甘肽-S-转移酶M1 (GSTM1)和谷胱甘肽过氧化物酶，明显看到COPD和对照受试者之间类似 的有差异的反应³⁴。GSTM1中的基因删除突变与吸烟者的肺气肿发展以及发 展COPD的易感性增加有关³⁵。类似地，GSTpi的遗传多态性与COPD相关 ³⁶。

在COPD中，转化生长因子(TGF)-β表达增加，并且抑制了气道平滑 肌细胞中的抗氧化酶过氧化氢酶和超氧化物歧化酶(SOD)2(也称为 Mn-SOD)的表达³⁷。这些酶均为中和线粒体来源的ROS的关键，其在转录 因子FOXO3的控制下。此外，FOXO3活性的缺乏之前已经与COPD相关³⁸。 已显示SOD2的基因多态性与COPD高度相关³⁹，尽管几乎没有数据可用于 显示这些多态性如何对应于功能活性的变化。类似地，SOD3(细胞外SOD) 的多态性还与COPD中的肺功能降低⁴⁰和当SOD3活性增强时保护吸烟者免 于发展成COPD⁴¹有关联。超过200种细胞抗氧化和解毒酶在转录因子核红 细胞-2相关因子2(Nrf2)的控制下，其通过结合到许多抗氧化和细胞保护 基因的启动子中的抗氧化反应元件(ARE)来调节基因表达⁴²。COPD患者 由于Nrf2活性降低，因而Nrf2应答基因的表达降低⁴³。因此，Nrf2活性的 上调或恢复可证明在COPD中具有疗效⁴⁴。

气道内的氧化应激和炎症

已发现，至少50种不同的细胞因子和趋化因子与COPD相关。在引入 了氧化还原敏感性分子靶时，如转录因子核因子-κB(NF-κB)和信号传导 分子，如Ras/Rac、Jun-N-末端激酶(JNK)、p38促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)和蛋白质酪氨酸磷酸酶，所触发的和/或驱动这些炎症介质的释放 的许多细胞内信号传导途径对氧化应激是敏感的。氧化应激能够在许多水平 活化NF-κB途径，并且NF-κB表达和活化在COPD中增加，并与气流限制 相关联⁴⁵。此外，当炎性刺激诱发对细胞活化至关重要的微氧化爆发 (micro-oxidativeburst)时，ROS还用作细胞内第二信使⁴⁶。亲电羰基化物 形式的羰基应激也能够影响许多不同的信号传导途径⁴⁷。如同氧化应激，这 是通过靶向易感信号传导分子(susceptiblesignalingmolecule)中的关键半胱 氨酸残基传播的⁴⁷。

炎性反应的消退与其诱发同等重要，并且通过吞噬作用清除凋亡细胞在 这一过程中起主要作用。吞噬作用在COPD中受损⁴⁸，并且在COPD中，不 能除去凋亡细胞则可导致继发性坏死和持续的炎症⁴⁹。氧化/羰基应激对吞噬 作用的影响显示为多因素的，且影响是细胞内和细胞外两方面。细胞内，氧 化应激活化RHoA，通过细胞骨架重塑的改变破坏吞噬作用⁵⁰。细胞外，氧 化/羰基应激导致组织蛋白的羰基化，产生对肺泡巨噬细胞上表达的识别并清 除羰基修饰蛋白和凋亡细胞的相同模式识别受体(PRR)的竞争⁵¹。最近， 已显示出这些吞噬作用所需的PRR自身被羰基修饰，并且由此被损伤⁵²。在 COPD中，由于氧化应激的影响，皮质类固醇(corticosteroids)抑制促炎性 基因表达的能力也被损伤⁵³。羰基化和硝化降低重要转录共抑制子 (co-repressor)组蛋白脱乙酰酶(HDAC)2的活性和表达，蛋白脱乙酰酶 (HDAC)2是激活炎性基因的抑制以及皮质类固醇的抗炎作用的关键⁵⁴_,⁵⁵。 如在COPD中所观察到⁵⁶，已经证实HDAC2的活性损失通过增加的Nrf-2 乙酰化而导致Nrf-2活性的损失，由此降低Nrf-2稳定性和表达⁴³。这产生了 一个令人感兴趣的悖论，其中氧化/羰基应激将活化Nrf-2，诱导保护性抗氧 化剂防御的表达，但是长期暴露于氧化/羰基应激可通过降低HDAC2活性抑 制/降低Nrf-2活化的有效性。事实上，氧化应激活化磷酸肌醇-3-激酶-δ，其 也负责降低HDAC2活性和表达⁵⁷。氧化应激类似地影响另一种转录共抑制 子sirtuin-1，降低其表达和活性，导致老化过程加速⁵⁸以及随着肺更快速地 老化而发展成肺气肿的可能性增加⁵⁹。因此在具有增加的发展成肺气肿风险 的COPD中，氧化应激可导致炎性基因表达增强，炎性反应消退失败、皮质 类固醇不敏感、诱发内源性抗氧化剂防御的能力降低以及肺加快老化。

COPD中的氧化应激和自体免疫性

越来越多的证据显示，COPD中存在自身免疫组分⁶⁰。直到最近，仍然 没有建立COPD中暴露于氧化应激与发展自体免疫性之间的机理方面的联 系。然而，由氧化应激引起的针对羰基修饰的自蛋白(selfprotein)的自身 抗体在COPD血清中升高，并且随着疾病严重而增加。因为这些自身抗体是 补体结合性的(complementfixing)，因此它们能够导致肺实质受损²⁶。羰基 修饰蛋白是高度免疫原性的，并且能够产生自身免疫性⁶¹。羰基修饰蛋白由 天然免疫系统通过在抗原呈递细胞(如巨噬细胞和树突细胞)上表达的模式 识别受体识别^62,63，于是这些强力的免疫原与MHCII一起加工并再表达，藉 此有助于获得性免疫反应的活化。事实上，COPD患者在下气道呈现出强烈 的1型免疫反应，Th1细胞¹和树突细胞在COPD患者的小气道中具有肺累 积⁶⁴，表达增加量的MHCII。然而，并不清楚COPD中针对氧化性修饰蛋白 表位的这一自身抗体反应是破坏性的、保护性的或仅仅是旁观者效应 (bystandereffect)。然而，针对羰基修饰蛋白的自身抗体具有潜在破坏性的 IgG1同种型²⁶，并且在COPD中还观察到对应的免疫球蛋白(IgG)和补体 (C3)沉积的证据^26,65。

氧化应激除了产生所需的新抗原之外，其还帮助驱动识别和加工这些新 抗原所必须的免疫细胞流入。在肺中增加的氧化应激引起CCL20和CCL2 释放，其转而触发树突细胞、单核细胞和淋巴细胞的募集。在COPD中帮助 安排(orchestrate)这一免疫反应的是水平升高的白细胞介素(IL)-17和 IL-18^66,67，其对于B细胞的活化和成熟以及促进自身免疫反应是重要的。IL-18 促进IL-17表达，并且已经证明氧化应激活化IL-18信号传导途径，且IL-18 的减少防止进一步的肺损伤⁶⁸。

治疗暗示

目前还没有逆转或甚至延缓COPD进展的治疗。吸入皮质类固醇在减少 哮喘中的炎性组分方面是高度有效的，但是在COPD中提供非常少的治疗益 处。虽然它们可能在减少恶化频率方面具有较小的作用，但它们不能减少炎 性组分和阻止肺功能的不可阻挡的降低。这一阻碍可归因于烟草烟雾或氧化 应激⁶⁹。因此可证实，用药理学抗氧化剂靶向氧化/羰基应激或提高抗氧化剂 的内源性水平在COPD的治疗和管理中是有益的。然而，目前还没有临床研 究显示单独的抗氧化剂治疗有益于或能够导致皮质类固醇功能(corticosteroid function)的恢复。然而，化合物如茶碱已显示出在增强COPD患者的皮质类 固醇效力方面的临床上显著的作用⁷⁰。令人感兴趣地是，茶碱的靶结合谱图 是氧化还原敏感的，并且在氧化应激的条件下更大，其可导致其在COPD中 增加类固醇效力方面的效力⁷¹。

COPD中抗氧化剂的最大试验是BRONCUS研究，其没有证明口服N- 乙酰半胱氨酸在延缓疾病进展或恶化频率上的任何整体作用，虽然在没有用 吸入皮质类固醇治疗的患者中存在明显的益处⁷²。使用不同抗氧化剂(厄多 司坦)的更早期的临床研究(Equalife)显示出类似的发现⁷³。这些临床研究 的失败可归因于几个原因：抗氧化剂没有靶向到最需要抗氧化剂的正确细胞 亚区室，临床试验中使用的抗氧化剂的效力、剂量和频率可能不足够高。结 果是，需要开发具有良好的生物利用度和效力的新颖的广谱小分子抗氧化剂， 用于COPD中的临床使用。还已经提出了许多可替代的抗氧化策略(在别处 评述)，其中一些已显示具有前景⁷⁴。也许对于抗氧化剂治疗，最鼓舞人的方 法在于新Nrf-2活化剂的使用，其比萝卜硫素(sulforophane)明显更强效⁷⁵， 并且还可以防止氧化应激诱发的自体免疫性⁷⁶。Nrf-2活化剂BG-12最近成 功地完成了用于多发性硬化的III期试验，并且目前正等待审批。然而，另一 Nrf-2活化剂甲基巴多索隆(bardoxolonemethyl(CDDO))由于大量严重的 不利事件没能完成III期。虽然两种药物都是Nrf-2的共价活化剂，它们的不 同之处在于Nrf-2可诱导基因的谱图是不同的，所述Nrf-2可诱导基因被活化、 在结构上不同并且结果可能具有不同的脱靶结合谱图，从而导致不同的临床 结果。其他有前途的方法包括SOD模拟物(如AEOL10113)、NOX抑制剂 (如雷公藤红素(celestrol))⁷⁷和髓过氧物酶抑制剂(如2-硫代黄嘌呤和 ADZ5904)⁷⁸。

结论

在COPD中发现了ROS和羰基化物的水平升高，并且这些可与炎症增 加、气道重塑、自身免疫性和皮质类固醇抗性相关。此外，全身性氧化应激 也可能在许多COPD共病(如心血管疾病和代谢综合征)中是一个因果联系。 局部氧化应激还可促进肺癌的发展。在初始暴露于ROS环境后，氧化应激的 随后的细胞内来源和长期性对于理解这一疾病的病理生理学是重要的。存在 的抗氧化剂在COPD研究中的失败表明需要开发靶向正确的细胞内区室的新 的更强力的抗氧化剂。靶向不同细胞区室的抗氧化剂的组合可证实比单一治 疗更有效。以类似的方式，组合抗氧化剂与抗炎药、支气管舒张剂、抗生素 和他汀类可以补充或在皮质类固醇的情况下提高/恢复它们的效力。

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