一种靶向于肿瘤微环境的电荷翻转型药物载体、其制备方法及应用

摘要

本发明为一种靶向于肿瘤微环境的电荷翻转型药物载体，其为一种混合聚合物。该混合聚合物胶束由胆固醇修饰聚氧乙烯山梨醇油酸酯通过酯键，与精氨酸-甘氨酸多肽和组氨酸-谷氨酸多肽相偶联。通过修饰pH敏感的在肿瘤酸性条件下可实现电荷逆转的多肽，使得该载体表现出易于与肿瘤细胞亲和的靶向性。体外细胞学实验显示该电荷翻转型材料对肿瘤有显著靶向性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有电荷翻转型特性的聚合物混合胶束，其制备方法及应用。

背景技术

肿瘤微环境是指由肿瘤细胞、基质细胞和细胞外基质等共同构成的局部稳态环境，为肿瘤 的生长、侵袭、转移提供了重要的物质基础，肿瘤微环境有低氧、低pH值和高压等特点。近 年来，针对肿瘤微环境的以上特点，设计靶向于肿瘤微环境的给药系统成为中外学者们的研 究热点。

细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPPs)，是一类由不多于30个氨基酸残基组 成的小分子多肽，具有很强的跨膜转运能力，根据氨基酸组成的不同，可分为阳离子CPPs和 两亲性CPPs。由于细胞穿膜肽具有很强的跨膜转运能力，且无刺激性。尽管CPPs能够有效 介导外源性生物大分子的入胞作用，但由于缺乏特异性限制了CPPs的体内应用。基于阳离 子CPPs的电荷特性，近年来基于CPPs设计的电荷翻转型材料已经成为新的研究热点。

基于CPPs设计的电荷翻转型材料主要由3部分组成：(1)CPP；(2)保护基团；(iii)中和CPPs 正电荷的材料。其中CPPs部分一般选择阳离子寡聚精氨酸，保护基团为与寡聚精氨酸含有 等量电荷数的阴离子多肽，一般选择寡聚谷氨酸，将CPPs与可中和其正电荷的材料相连接， 可以中和其正电性，因此，可以使CPPs的膜穿透能力在其到达靶部位前得以暂时屏蔽。

近年来，基于CPPs设计出的电荷翻转型载体材料有很多文献报道，有研究学者设计出基于组 氨酸-谷氨酸(HE)重复序列，即在pH7.4时，载体所携带的负电荷能够抑制CPPs的活性， 而pH＜7.0时，组氨酸的存在能够干扰谷氨酸与CPPs的吸附作用，从而使CPPs恢复穿 膜特性。这种基于CPPs正电荷性质设计的电荷翻转型载体，为用于靶向具有类似微环境的肿 瘤组织的给药系统的开发提供了全新的思路和途径。

本发明的聚合物与多肽偶联混合胶束，是利用酯键将胆固醇修饰聚氧乙烯山梨醇油酸酯分 别与组氨酸-谷氨酸多肽和精氨酸-甘氨酸多肽相偶联，修饰pH敏感的在肿瘤酸性条件下可 实现电荷逆转的多肽后，使得该载体表现出易于与肿瘤细胞亲和的靶向性。本发明是一种载 疏水性药物的聚合物胶束药物递释系统，对肿瘤靶向治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种靶向于肿瘤微环境的电荷翻转型药物载体。本发明使用安 全性更高的聚氧乙烯山梨醇油酸酯材料作为主体，同时以生物相容性高的胆固醇作为配体对 其进行修饰。形成为聚氧乙烯山梨醇油酸酯分子为亲水端，以胆固醇为疏水端的两亲性载体 (CPSO)。再以pH敏感的组氨酸-谷氨酸多肽(HE)m和细胞穿膜肽精氨酸-甘氨酸多肽(RG)n对 胆固醇修饰聚氧乙烯山梨醇油酸酯载体进行修饰，使用透析法将修饰后的两亲性聚合物制备 成胶束。

本发明的目的之二在于提供一种靶向于肿瘤微环境的电荷翻转型药物载体的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种靶向于肿瘤微环境的电荷翻转型药物载体在制备抗肿瘤 药物中的用途。

本发明提供如下技术方案：

(1)以聚氧乙烯山梨醇油酸酯和胆固醇甲酰氯为原料，采用酰化反应合成胆固醇修饰的聚 氧乙烯山梨醇油酸酯(CPSO)。

(2)使用探头超声-透析法将(HE)m和(RG)n修饰的胆固醇修饰聚氧乙烯山梨醇油酸酯制 备为混合胶束。

本发明采用酰化反应合成胆固醇修饰的聚氧乙烯山梨醇油酸酯，聚氧乙烯山梨醇油酸酯和 胆固醇甲酰氯的摩尔比例范围为1.1∶1-1.4∶1，优选1.25-1；采用的溶剂可以是二氯甲烷、 四氢呋喃，优选二氯甲烷；采用的催化剂为4-二甲氨基吡啶；反应温度范围为室温-40℃； 反应时间为18-48小时，优选24小时。反应结束后，使用旋转蒸发法除去有机溶剂，加入 5-40ml蒸馏水水化，优选15ml，5000-10000rpm下离心5-20min，优选8000rpm，10min。 后冷冻干燥保存。

本发明采用酯化反应将多肽的羧基与胆固醇修饰聚氧乙烯山梨醇油酸酯载体中的羟基相 偶联。采用固相合成法，以精氨酸-甘氨酸多肽(RG)n和组氨酸-谷氨酸多肽(HE)m为原料，使 用Pbf保护基保护(RG)n侧链胺基，Boc保护基保护末端胺基，使用Fmoc保护基保护(HE)m 末端胺基。(HE)m和(RG)n与胆固醇修饰聚氧乙烯山梨醇油酸酯的摩尔比例范围为 0.9∶1-1.3∶1，优选1∶1；合成反应时使用水、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或上述几种溶 剂的混合溶剂，优选水和N，N-二甲基甲酰胺50∶50混合溶剂，冰水浴下搅拌20-60分钟，优 选30分钟，加入1.3至2当量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，优选1.5当 量；0.5至1当量的4-二甲氨基吡啶，优选0.8当量；反应温度范围为室温-40℃；反应时间 为18-48小时，优选24小时。合成反应纯化，既可以采用透析袋透析纯化，也可以采用离心 浓缩管纯化，优选离心浓缩管，以节约时间，便于冷冻干燥。

本发明采用切割试剂脱Pbf和Fmoc保护基，配制哌啶∶二氯甲烷体积比在1∶9至3∶7的切 割试剂，优选2∶8，用切割试剂溶解(HE)m偶联的胆固醇修饰聚氧乙烯山梨醇油酸酯冻干粉， 冰浴下搅拌20至40分钟，优选30分钟，旋转蒸发出去二氯甲烷，透析袋透析纯化或离心浓 缩管纯化，优选离心浓缩管，纯化后冷冻干燥。配制三氟乙酸∶1，2-乙二硫醇∶苯甲硫醚∶ 水∶对甲苯酚体积比例65∶10∶5∶10∶10至93∶2∶1∶2∶2范围内的切割试剂，优选 82.5∶5∶2.5∶5∶5，用切割试剂溶解(RG)n偶联的胆固醇修饰聚氧乙烯山梨醇油酸酯冻干粉。 冰水浴下搅拌2至4小时，优选3小时，冰乙醚沉淀，5000-10000rpm下离心5-20分钟，优 选8000rpm，10分钟，透析袋透析纯化或离心浓缩管纯化，优选离心浓缩管，纯化后冷冻干 燥。

本发明采用探头超声-透析法制备载药胶束，溶剂为水，超声时间为40-70分钟，优选59 分钟；超声功率为10％-30％，优选20％；药物和聚合物的质量比范围为1∶3-1∶6，优选1∶4； 透析时间范围为8-24小时，优选12小时，透析产物在2000-5000rpm下离心10-20分钟，优 选3000rpm，15分钟。

本发明以多种疏水性小分子抗癌药物(如紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素等)其中一种为模 型，按照上述方法制备载药胶束，载药量为15％至20％，24小时至120小时可完全释放。

附图说明

图1为本发明中载紫杉醇的胆固醇修饰的聚氧乙烯山梨醇油酸酯胶束，和载紫杉醇的精氨 酸-甘氨酸多肽(RG)5和组氨酸-谷氨酸多肽(HE)5分别与胆固醇修饰的聚氧乙烯山梨醇油酸 酯相偶联形成的混合胶束的粒径分布图。

图2为本发明中含有不同比例的混合胶束在不同pH的PBS缓冲液里的Zeta电荷

图3为本发明中的混合胶束在不同pH的PBS缓冲液里及市售在pH7.4中的体外释 放曲线。

图4为不同浓度的、载紫杉醇的CPSO胶束和载紫杉醇的MCPSO胶束在U87细胞中 的抑制率

图5为不同浓度的空白载体CremophorEL∶乙醇＝1∶1(v/v)溶媒、空白Tween80、空白 CPSO胶束和空白MCPSO胶束在U87细胞中的抑制率。

图6为载香豆素的Tween80、CPSO、MCPSO在pH6.0和pH7.4时30分钟，120分钟和 240分钟的平均荧光强度。

具体实施方式

下面为本专利的实施例，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。

实施例1：

合成条件

(1)胆固醇修饰的聚氧乙烯山梨醇油酸酯(CPSO)的合成

以聚氧乙烯山梨醇油酸酯(PSO)和胆固醇甲酰氯为原料，合成胆固醇修饰的聚氧乙烯山 梨醇油酸酯(CPSO)。聚氧乙烯山梨醇油酸酯(PSO)和胆固醇甲酰氯摩尔例为1.25∶1。取PSO 1g和胆固醇甲酰氯0.125g，及催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.016g，置于25ml圆底烧瓶 中，加入溶剂10ml二氯甲烷后，室温下磁力搅拌24h。反应结束后，在50℃下真空旋转蒸发 除去二氯甲烷，再加入10ml蒸馏水水进行水化，待圆底烧瓶壁上固体溶解后，常温下，10000 转离心10min，取上清液冻干，待用。

(2)(HE)5-Fmoc及(RG)5-Pbf的合成

采用固相合成法，以精氨酸-甘氨酸多肽(RG)5和组氨酸-谷氨酸多肽(HE)5为原料，使用 Pbf保护基保护(RG)5侧链胺基，Boc保护基保护末端胺基，使用Fmoc保护基保护(HE)5末端 胺基。

(3)(HE)5-Fmoc及(RG)5-Pbf羧基的活化，并与载体CPSO相偶联

CPSO-(HE)5-Fmoc：称取(HE)5-Fmoc100mg，用2mL蒸馏水溶解，搅拌10-20分钟后，将 装有此溶液的圆底烧瓶浸渍于冰水浴中5-10分钟，在冰水浴条件下分别加入EDC 21.4mg(1.5eq)及DMAP7.2mg0.8eq)，将CPSO179mg(1eq)用蒸馏水(2ml)溶解待HE)5-Fmoc 溶液搅拌1小时后，加入CPSO。搅拌均匀后用封口膜将塞子密封好，然后将烧瓶在室温下中 反应24小时，冻干后待用。

CPSO-(RG)5-Pbf：称取(RG)5-Pbf100mg，用5mLDMF溶解，搅拌10-20分钟后，将装有 此溶液的圆底烧瓶浸渍于冰水浴中5-10分钟，在冰水浴条件下分别加入EDC26.6mg(1.5eq) 及DMAP9mg(0.8eq)，将CPSO223mg(1eq)用蒸馏水(5ml)溶解，待(RG)5-Pbf溶液搅拌 1小时后，加入CPSO。搅拌均匀后用封口膜将塞子密封好，然后将烧瓶在室温下反应24小时， 双蒸水中透析8h后(换水2-3次)，冻干后待用。

(4)脱去CPSO-(HE)5-Fmoc、CPSO-(RG)5-Pbf的Fmoc及Pbf保护基

脱CPSO-(HE)5-Fmoc的Fmoc保护基：配制哌啶∶二氯甲烷(2∶8)的切割试剂溶解冻干后的 CPSO-(HE)5-Fmoc样品，冰浴下搅拌20-25分钟后，旋转蒸发除去二氯甲烷，透析24小时后， 冻干后得到(HE)5-CPSO固体。

脱CPSO-(RG)5-Pbf的Pbf保护基：配制切割试剂，三氟乙酸∶1，2-乙二硫醇∶苯甲硫醚∶ 水∶对甲苯酚比例82.5∶5∶2.5∶5∶5。冰浴下搅拌2.5小时，冰乙醚沉淀后，6000转离心，得 到(RG)5-CPSO白色固体。

实施例2

载紫杉醇(HE)5偶联CPSO与(RG)5偶联CPSO混合胶束(MCPSO)的制备及粒径测定。

称取CPSO载体20mg，加入3ml蒸馏水，搅拌1h使其溶解，缓慢滴加含4mg紫杉醇的200ul 甲醇溶液。分别22％功率，探头超声59min，超5秒停3秒，超声结束后将溶液加入透析袋中， 以水为介质透析过夜，透析产物在3000rpm下离心15min，上清液用0.45um微孔滤膜过滤后， 得到具有浅蓝色乳光的聚合物胶束溶液。用玛尔文粒径测定仪，采用动态光散射法技术，使 用ZetaSize3000HS软件对结果进行处理，分别测得PTX-CPSO胶束PTX-MCPSO胶束粒径分别 为103.9、123.9nm，结果见图1。

实施例3

载紫杉醇(HE)5偶联CPSO与(RG)5偶联CPSO混合胶束(MCPSO)电荷翻转的性质。

分别制备(HE)5偶联胆固醇修饰聚氧乙烯山梨醇油酸酯胶束、(RG)5偶联胆固醇修饰聚氧 乙烯山梨醇油酸酯胶束，以及两者的混合胶束，比例分别为50∶50、40∶60、30∶70及20∶80。 称取2mg样品分别用PBS5.5、PBS6.0、PBS6.5、PBS7.0、PBS7.5和PBS8.0溶解，配 置为样品浓度为1mg/ml的溶液。使用Zetapotential仪测量样品电位，并绘制表格，结果 见图2。

实施例4

载紫杉醇(HE)5偶联CPSO与(RG)5偶联CPSO混合胶束(MCPSO)体外评价。

(1)体外释放

取载紫杉醇的混合胶束适量放入透析袋中，两端用棉线扎紧，分别以PBS5.0、PBS6.0、 PBS6.8、PBS7.4为释放介质(含1％Tween80)，及市售制剂使用PBS7.4为释放介 质(含1％Tween80)，置于37度恒温水浴振荡器中，转速为100r/min，分别于0.5h、1.0h、 2.0h、4.0h、6.0h、8.0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h和120h取释 放介质1.0ml于离心管中，过0.22μm水系滤膜，弃初滤液0.2ml，取续滤液于进样小瓶， 取20μL于高效液相色谱仪，计算药物释放量，为保证漏槽条件，释放介质加Tween80增溶， 分别4.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0h更换一次释放介质，结果见图3。

(2)人脑胶质瘤细胞毒性实验

将U87细胞以5000个/孔接种于96孔板中，37℃孵育24h后，吸去培养液，分别加入不 同浓度的空白载体CremophorEL∶乙醇＝1∶1(v/v)、Tween80、空白CPSO胶束和空白MCPSO 胶束，及载紫杉醇的CPSO胶束和MCPSO胶束，以为对照组。取20μL四甲基偶氮唑 蓝(MTT，5mg/mL)加入各孔内，继续孵育4h，弃去孔内液体，加入DMSO200μL，振摇， 使结晶充分溶解，在570nm波长下用酶标仪测定各样品的吸光值(ODsample)，相同方法测 定空白组OD值(ODcontrol)，并计算抑制率，结果见图4、图5。

(3)人脑胶质瘤细胞摄取实验

以荧光物质香豆素6(C6)模拟药物，分别制备CPSO胶束、MCPSO胶束和Tween80包载 香豆素6的制剂。取对数生长期的的人脑胶质瘤U87细胞，用胰蛋白酶消化3min，用含10％ 胎牛血清的DMEM培养基终止消化，按每孔5×105个细胞接种于6孔培养板中，每孔加样2mL。 培养24h，待细胞贴壁后，吸出培养基，并用PBS缓冲液冲洗三遍，分别加入含10μg/ml香 豆素6的三种制剂，置于CO2培养箱中培养4h，取出后用提前预冷(4℃)的PBS轻轻冲洗 三遍，除去吸附于细胞表面的荧光染料，每孔加入0.5ml胰蛋白酶消化贴壁细胞，放入CO2 培养箱孵育3min，置于倒置显微镜下观察，当细胞边缘清晰，收回突起变圆时，加入1.5ml 新鲜培养基终止消化，用移液器轻轻吹打各孔，使其脱离孔壁后，混合均匀转入EP管中， 1000rpm离心5min，倒掉上清液，重新加入适量提前预冷(4℃)的PBS混合均匀后，1000rpm 离心5min，倒掉上清液，重新加入1ml提前预冷(4℃)的PBS轻轻吹打，使其混合均匀后 用流式细胞仪进行测定分析(Ex＝488nm；Em＝530nm)，计算平均荧光强度，结果见图6。