预测锂盐在双极性情感疾病的预防疗效的生物标记

摘要

本发明提供一种检测锂盐对双极性情感疾病(Biopolar？disorder)患者的疗效的方法，该方法包含从双极性情感疾病患者取得一样本，且分析该样本存在或不存在一个或多个谷氨酸脱羧酶样1(glutamate？decarboxylase-like？1，GADL1)基因变异，其中该基因变异是选自于︰SNP？rs17026688对偶基因型为T、SNP？rs17026651对偶基因型为G、GADL1？IVS8+48delG以及GADL1基因上的所有变异。一个或多个的GADL1基因变异存在表示该患者对锂盐治疗具有疗效。

说明书

技术领域

本发明是关于一种利用单核苷酸多型性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)的个人化药物治疗。

背景技术

双极性情感疾病(Biopolardisorder)的特征是患者反复出现激躁与抑郁两种极端的异常情绪状态，参阅如︰Müller-Oerlinghausenetal.,Lancet2002；359:241-7；andFryeMA.,NEnglJMed2011；364:51-9。近期，锂盐(lithium)是长期治疗双极性情感疾病的第一线用药，可以有效降低患者复发和自杀的风险，参阅如︰Fountoulakisetal.,EurArchPsychiatryClinNeurosci2012；262Suppl1:1-48。然而，有很多患者对锂盐治疗是没有疗效的。

发明内容

本发明提供一种检测锂盐(lithium)对双极性情感疾病(Biopolardisorder)患者的疗效的方法，该方法包含︰从双极性情感疾病患者取得一样本，分析该样本存在或不存在一个或多个谷氨酸脱羧酶样1(glutamatedecarboxylase-like1，GADL1)基因变异(variants)，其中该基因变异是选自于︰(i)SNPrs17026688一个对偶基因型为T；(ii)SNPrs17026651一个对偶基因型为G；(iii)GADL1IVS8+48delG；(iv)与SNPrs17026688、SNPrs17026651、或GADL1IVS8+48delG或其组合具有相关性或处于连锁不平衡(linkagedisequilibrium)的基因变异；(v)包含有或处于连锁不平衡的SNPrs17026688、SNPrs17026651、或GADL1IVS8+48delG或其组合的基因座单倍型遗传多态性(haplotype)；以及(vi)包含GADL1基因上的所有变异所组成的群组，且该一个或多个的GADL1基因变异存在表示该患者对锂盐治疗具有疗效。

本发明所述的样本是是来自患者的组织或体液中(例如︰血液或唾液)取得的基因组(genomic)DNA样本、RNA样本、cDNA样本或蛋白质样本。本发明的分析步骤可采用例如是︰DNA定序、限制酶切割、聚合酶链锁反应

(polymerasechainreaction，PCR)、杂交(hybridization)、实时(Real-time)PCR、反转录(reversetranscriptase)PCR或连接酶链锁反应(ligasechainreaction)，以及免疫分析(immunoassay)。在本发明的一实施例中，该患者是中国汉族人种(HanChinesedescent)的双极性情感疾病第一型。

本发明是一种治疗双极性情感疾病的方法，该方法包含检测一患者是否带有一个或多个上述的GADL1基因变异，若该患者带有一个或多个该基因变异，则可给予该患者锂盐治疗。

再者，本发明提供一种检测一个体是否带有一个或多个GADL1基因变异的套组，该套组包含一个或多个用于检测GADL1变异的探针。

前述或其他的实施例将可由以下对较佳实施例的描述及图式更为清楚，然而其改变或修饰并未脱离本发明揭露内容的精神、范围及概念。

具体实施方式

谷氨酸脱羧酶样1(glutamatedecarboxylase-like1，GADL1)的基因变异(variants)与双极性情感疾病(Biopolardisorder)患者的锂盐疗效的间具有相关性的发现是无法预期的。带有GADL1基因的一个或多个变异的患者更可能对锂盐治疗具有疗效。

GADL1属于脱羧酶(decarboxylase)家族第二群，如习知技艺人士已知该基因组的位置(第3号染色体)、基因组DNA序列(参阅如NC_000003.11ReferenceGRCh37.p13PrimaryAssembly,chr3:30767692-30936153)、cDNA序列(参阅AccessionNo.NM_207359.2)以及人类GADL1蛋白质序列(参阅如AccessionNo.NP_997242.2)。

例示性的GADL1多胜肽的胺基酸序列及编码多胜肽的cDNA序列如下所示。

人类GADL1胺基酸序列(SEQIDNO:1)：

MSSDSDRQCPVDGDIDQQEMIPSKKNAVLVDGVVLNGPTTDAKAGEKFVEEACRLIMEEVVLKATDVNEKVCEWRPPEQLKQLLDLEMRDSGEPPHKLLELCRDVIHYSVKTNHPRFFNQLYAGLDYYSLVARFMTEALNPSVYTYEVSPVFLLVEEAVLKKMIEFIGWKEGDGIFNPGGSVSNMYAMNLARYKYCPDIKEKGLSGSPRLILFTSAECHYSMKKAASFLGIGTENVCFVETDGRGKMIPEELEKQVWQARKEGAAPFLVCATSGTTVLGAFDPLDEIADICERHSLWLHVDASWGGSALMSRKHRKLLHGIHRADSVAWNPHKMLMAGIQCCALLVKDKSDLLKKCYSAKASYLFQQDKFYDVSYDTGDKSIQCSRRPDAFKFWMTWKALGTLGLEERVNRALALSRYLVDEIKKREGFKLLMEPEYANICFWYIPPSLREMEEGPEFWAKLNLVAPAIKERMMKKGSLMLGYQPHRGKVNFFRQVVISPQVSREDMDFLLDEIDLLGKDM

人类GADL1cDNA序列(SEQIDNO:2)：

下底线－编码区域(SEQIDNO:3)

AGACTGCGGGAGCCGCGCCCGGGGCAGCCTGGAGTGGGGGAGCGGAGATGAGCAGCGACTCGGACCGCCAGTGTCCTGTGGACGGAGATATTGATCAACAAGAGATGATTCCAAGTAAGAAGAATGCTGTTCTTGTGGATGGGGTTGTGCTGAATGGTCCTACAACAGATGCAAAAGCTGGAGAAAAATTTGTTGAAGAGGCCTGTAGGCTAATAATGGAAGAGGTGGTTTTGAAAGCTACAGATGTCAATGAGAAGGTGTGTGAATGGAGGCCTCCTGAACAACTGAAACAGCTTCTTGATTTGGAGATGAGAGACTCAGGCGAGCCACCCCATAAACTATTGGAACTCTGTCGGGATGTCATACACTACAGTGTCAAAACTAACCACCCAAGATTTTTCAACCAATTGTATGCTGGACTTGATTATTACTCCTTGGTGGCCCGATTTATGACCGAAGCATTGAATCCAAGTGTTTATACGTATGAGGTGTCCCCAGTGTTTCTGTTAGTGGAAGAAGCGGTTCTGAAGAAAATGATTGAATTTATTGGCTGGAAAGAAGGGGATGGAATATTTAACCCAGGTGGCTCAGTGTCCAATATGTATGCAATGAATTTAGCTAGATACAAATATTGTCCTGATATTAAGGAAAAGGGGCTGTCTGGTTCGCCAAGATTAATCCTTTTCACATCTGCAGAGTGTCATTACTCTATGAAGAAGGCAGCCTCTTTTCTTGGGATTGGCACTGAGAATGTTTGCTTTGTGGAAACAGATGGAAGAGGTAAAATGATACCTGAGGAACTGGAGAAGCAAGTCTGGCAAGCCAGAAAAGAGGGGGCAGCACCGTTTCTTGTCTGTGCCACTTCTGGTACAACTGTGTTGGGAGCTTTTGACCCTCTGGATGAAATAGCAGACATCTGCGAGAGGCACAGCCTCTGGCTTCATGTAGATGCTTCTTGGGGTGGCTCAGCTTTGATGTCGAGGAAGCACCGCAAGCTTCTGCATGGCATCCACAGGGCTGACTCTGTGGCCTGGAACCCACACAAGATGC

TGATGGCTGGGATCCAGTGCTGTGCTCTCCTTGTGAAAGACAAATCTGATCTTCTTAAAAAATGCTACTCTGCCAAGGCATCTTACCTCTTCCAGCAGGATAAATTCTATGATGTGAGCTATGACACAGGAGACAAGTCTATCCAGTGTAGCAGAAGACCAGATGCATTCAAGTTCTGGATGACCTGGAAGGCCCTGGGTACATTAGGCCTTGAAGAAAGAGTTAATCGTGCTCTTGCTTTATCTAGGTACCTAGTAGATGAAATCAAGAAAAGAGAAGGATTCAAGTTACTGATGGAACCTGAATATGCCAATATTTGCTTTTGGTACATTCCACCGAGCCTCAGAGAGATGGAAGAAGGACCCGAGTTCTGGGCAAAACTTAATTTGGTGGCCCCAGCCATTAAGGAGAGGATGATGAAGAAGGGAAGCTTGATGCTGGGCTACCAGCCGCACCGGGGAAAGGTCAACTTCTTCCGCCAGGTGGTGATCAGCCCTCAAGTGAGCCGGGAGGACATGGACTTCCTCCTGGATGAGATAGACTTACTGGGTAAAGACATGTAGCTGTGGCTTTGGTCCCCCAGAGGCATAGATCCTATCCTGGGAGAGTTTAGATCCAGAACATCTTGGAGATACACAGTAGATTGCAGCCCTTCTGATGAGAAATAGGGAATACTCCCAGTCCAGGCCCAGCAAAACCAAAATGCTAAGCAATGAATATTAAGGACTCTCTAGCTGCCTGGGCATTACTGTTGCTAAAAGAAGAAAGTTTAAAAAAAAAAATGATTTTCTCAAGGAATGCCCCTGGAACACAGCTCTGAAGAGAGTTTAGTAAGTACCATGTAGGTTCTGGATTCTAAGCTTACATTGCTCTTTAAAGAACTTATAAACTAACGGTTTAAAGCAGTGGTTCTCAAAGTGTGGTCCCTGGACTATCAGCATCAAAGCATCACCTGGGAACTTGCTAAAAATGCAGATTCTCAGGCTTTCTCTAGACCAACTGGATCAGAAGCTCTGGGGGTGAGGCCCAGTATTCTGTGTTTTAACAAGC

CCGTCAGGGAATTCTGATGCACAGTAAAATCCGAGAAACACTGGTTTAAGAAAAACCTTGTAATGATCGAATACCCACTCTGATGTTTTGCCAGCAAAGGGATATCTAATATTTCAGAAGCCTCTGAGCCAGTCTTTGAAAAAATACAACTATGGCATCTGCAGCACAAATATTTAAGGACATCAGAAGCATGTCAAAGCTATTTTTAAAGAGAGAAACTGTATAAGATGTTTACTTCATAGAGATTTATGTTTTATGCAGGCTGAATGTTTATCTCAAAAGTTAAAATTATCCATTCTCAAAAGTTAAAATTATATATATATATATATATACACACACACACATATATATATATATATAATTCAAAGCACAATAATTGAAAGCACAATAATTGACAGAAAAATACAGGTTCTATTAATAAATTAATAAACTGTTGGTCTTCAAAATAGAAATGCATGTAATATCCATATTAGTTTTTTCTTGGTAGACAACTGGAAGGTTTTCTTTTTTTTCGTCTATGACTAATTTTCTTTATTCAAGATACCTGAACTGGGGTGCTTTTTAAGAAAAATTTGGGAAATATATATGTTTCTGTGATATACATATATACATATATATGTATATATATACACACACATACATATGTGTGTGTATAGTATATATATATATACACACATATATGTTTCTGTGTTCCTCTTTTAGCTTGAGGGGCTTGTTTATTATCTTGCTCTGTGCCTCATAGGGAATAAACACAATGAAGTCCAGGGTTGTACAACATTCCCTTTCCTAAGCTTTGAAATGTCAGTATAGATTATTAAGTGGTTTATATTACAGAATCTGGGATTCAGCAGACTTTCAGTGTAAATGCTTCCTCCATTTCTCCTGAGAGTGGGTGATTTTAATTCTATCTCTGACCCTGGTCCTAGGTTTCTAGGAGAGTTTTGTTTAACTAAGAAATTGACAGAATTCATAGGTGTGGGTGTAGAGTTCACCAAGATAAGATTATGAATATAATTAAAGGTCTGCATTAAAAGGTGAATGATTGAAGAG

TGTTAAAGCATTAGACTTAGCACATTCAATAACCTTTTCGTACTCCATTGTTAACCAATGTCATTTAAATTTTGAGTACTATTTGCTTTTATTGCTTATTTTCATTTTAGTGTGCACAGTTTCTCGGTATCTCTATTGGTCAAAGAATATTAAATCTGTCTCTGAATTACTTCAAATTCTCAGGTGAAACCTATTGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTATTTTGCATTTCTTGTTGCCTTTTTGTTTTAATGTCTACATAAAATATTTCTAAAATTGATGTTTGTAACAATTTGGGTTTCATGAAACAAAAAGGAACATTACTATACTTAGTGTTGTTGACTTTTCTTTTCCTGTCATCTCCTCTTTACTGGATTGTACCAATACATTTTAGAAGTGAACTGGACTTGGTTGGCATTTTAGTTTAATGACTGAAAAAGTAGGTTGAAAGCTCTCTGTATTTTAGTTAACACCTTGAATAAAATGGAAAAAGCAGTTATAGC

具有外显子(exon)7及8缺失的截短的人类GADL1异构体(isoform)(SEQIDNO:4)：

MSSDSDRQCPVDGDIDQQEMIPSKKNAVLVDGVVLNGPTTDAKAGEKFVEEACRLIMEEVVLKATDVNEKVCEWRPPEQLKQLLDLEMRDSGEPPHKLLELCRDVIHYSVKTNHPRFFNQLYAGLDYYSLVARFMTEALNPSVYTYEVSPVFLLVEEAVLKKMIEFIGWKEGDGIFNPGGSVSNMYAMNLARYKYCPDIKEKGLSGSPRLILFTSAEGAAPFLVCATSGTTVLGAFDPLDEIADICERHSLWLHVDASWGGSALMSRKHRKLLHGIHRADSVAWNPHKMLMAGIQCCALLVKDKSDLLKKCYSAKASYLFQQDKFYDVSYDTGDKSIQCSRRPDAFKFWMTWKALGTLGLEERVNRALALSRYLVDEIKKREGFKLLMEPEYANICFWYIPPSLREMEEGPEFWAKLNLVAPAIKERMMKKGSLMLGYQPHRGKVNFFRQVVISPQVSREDMDFLLDEIDLLGKDM

编码SEQIDNO:4的cDNA编码序列(SEQIDNO:5)：

ATGAGCAGCGACTCGGACCGCCAGTGTCCTGTGGACGGAGATATTGATCAACAAGAGATGATTCCAAGTAAGAAGAATGCTGTTCTTGTGGATGGGGTTGTGCTGAATGGTCCTACAACAGATGCAAAAGCTGGAGAAAAATTTGTTGAAGAGGCCTGTAGGCTAATAATGGAAGAGGTGGTTTTGAAAGCTACAGATGTCAATGAGAAGGTGTGTGAATGGAGGCCTCCTGAACAACTGAAACAGCTTCTTGATTTGGAGATGAGAGACTCAGGCGAGCCACCCCATAAACTATTGGAACTCTGTCGGGATGTCATACACTACAGTGTCAAAACTAACCACCCAAGATTTTTCAACCAATTGTATGCTGGACTTGATTATTACTCCTTGGTGGCCCGATTTATGACCGAAGCATTGAATCCAAGTGTTTATACGTATGAGGTGTCCCCAGTGTTTCTGTTAGTGGAAGAAGCGGTTCTGAAGAAAATGATTGAATTTATTGGCTGGAAAGAAGGGGATGGAATATTTAACCCAGGTGGCTCAGTGTCCAATATGTATGCAATGAATTTAGCTAGATACAAATATTGTCCTGATATTAAGGAAAAGGGGCTGTCTGGTTCGCCAAGATTAATCCTTTTCACATCTGCAGAGGGGGCAGCACCGTTTCTTGTCTGTGCCACTTCTGGTACAACTGTGTTGGGAGCTTTTGACCCTCTGGATGAAATAGCAGACATCTGCGAGAGGCACAGCCTCTGGCTTCATGTAGATGCTTCTTGGGGTGGCTCAGCTTTGATGTCGAGGAAGCACCGCAAGCTTCTGCATGGCATCCACAGGGCTGACTCTGTGGCCTGGAACCCACACAAGATGCTGATGGCTGGGATCCAGTGCTGTGCTCTCCTTGTGAAAGACAAATCTGATCTTCTTAAAAAATGCTACTCTGCCAAGGCATCTTACCTCTTCCAGCAGGATAAATTCTATGATGTGAGCTATGACACAGGAGACAAGTCTATCCAGTGTAGCAGAAGACCAGATGCATTCAAGTTCTGGATGACCTGGAAGGCCCTGGGTACATTAGGCCTTGAAGAAAGAGTTAATCGTGCTCTTGCTTTATCTAGGTACCTAGTAGATGAAATCAAGAAAAGAGAAGGATTCAAGTTACTGATGGAACCTGAATATGCCAATATTTGCTTTTGGTACATTCCACCGAGCCTCAGAGAGATGGAAGAAGGACCCGAGTTCTGGGCAAAACTTAATTTGGTGGCCCCAGCCATTAAGGAGAGGATGATGAAGAAGGGAAGCTTGATGCTGGGCTACCAGCCGCACCGGGGAAAGGTCAACTTCTTCCGCCAGGTGGTGATCAGCCCTCAAGTGAGCCGGGAGGACATGGACTTCCTCCTGGATGAGATAGACTTACTGGGTAAAGACATGTAG

本发明发现与锂盐疗效有关的位于GADL1基因内含子(intron)的两个单核苷酸多型性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)rs17026688及rs17026651、一个碱基缺失的变异IVS8+48delG，IVS8+48delG是GADL1基因内含子8的一个碱基G缺失以及GADL1基因上的所有变异。含有SNPrs17026688对偶基因型为T、SNPrs170266518对偶基因型为G的双极性情感疾病患者较有可能对锂盐治疗具有疗效。

本发明提供一种诊断或预测双极性情感疾病患者是否对锂盐治疗具有较好的疗效的方法。本发明所述的双极性情感疾病患者(例如：双极性情感疾病第一型的患者)可使用本发明所描述或习知的方法定义。

举例而言，在双极性情感疾病患者中带有rs17026688对偶基因型为T(例如：TT或CT基因型)表示对锂盐治疗具有较好的疗效。另一方面，在双极性情感疾病患者中带有rs17026688对偶基因型为C(例如︰CC基因型)较不可能对锂盐治疗具有好的疗效。在另一个实施例中，在双极性情感疾病患者中带有rs17026651对偶基因型为G(例如︰GG或CG基因型)可能比带有对偶基因型为C(例如︰CC基因型)患者对锂盐治疗具有较好的疗效。在另一个实施例中，在双极性情感疾病患者中带有IVS8+48delG变异表示该患者对锂盐治疗具有好的疗效。

若双极性情感疾病患者具有与锂盐治疗好的疗效相关性的一个或多个变异，则该患者可给予锂盐治疗。对于没有该变异的患者，给予替代治疗为较好，替代的锂盐治疗包含但不限于丙戊酸钠(valproate)、卡马西平(carbamazepine)、奥卡西平(oxcarbazepine)及拉莫三嗪(lamotrigine)。

其他的GADL1基因标记也可使用作为检测锂盐治疗好的疗效，例如，包含位于GADL1基因已知的SNP及如本发明所述的GADL1变异。

藉由位于GADL1基因中的变异或特定区域的直接检测，确定基因变异的存在，检测对偶基因的基因组可由本发明技术领域中已知的方法从患者制备。在有兴趣的基因标记中的区域的检测包含有检查位在该区域中的正股(sense)或反股(anti-sense)的核苷酸。本发明技术领域中已知可用以检测一个特定区域或基因变异的方法，例如︰定序、序列特异性寡核苷酸杂交(sequencespecificoligonucleotide-hybridization)、实时(Real-time)PCR、连接酶链锁反应(ligasechainreaction)或序列特异性寡核苷酸杂交加上酵素连结免疫吸附法(CSSO-ELISA)(M.Hiratsukaetal,J.ofBiochemicalandBiophysic.Methods,67:87-94,2006)。

对有兴趣的对偶基因的存在亦可藉由检测相当于该对偶基因的基因标记来确定，接近有兴趣对偶基因的基因标记易于与该对偶基因共分离(co-segregate)、或显示连锁不平衡(linkagedisequilibrium)。结果，这些标记(等同于基因标记)的存在表示为有兴趣的对偶基因存在，进而表示对锂盐有疗效。

替代及其他的方法，检测有兴趣的对偶基因的RNA、cDNA或蛋白质产物以确定该对偶基因的存在或不存在，举例而言，IVS8+48delG变异导致的GADL1缺少外显子(exon)7及8的截短的型式。使用以下方法确定一个对偶基因的蛋白质产物︰质谱仪测定法(Massspectrometryassays)，如︰基质辅助激光解析电离质谱(MatrixAssistedLaserDesorptionIonization-MassSpectrometry，MALDI-MS)、液相层析仪/质谱仪(LiquidChromatography-MassSpectrometry，LC-MS)及液相色谱法-质谱/质谱仪(LiquidChromatography-MassSpectrometry/MassSpectrometry，LC-MS/MS)，以及免疫测定法，如︰酵素连结免疫吸附法(ELISA)、西方点墨法(Westernblot)、放射性免疫测定法(radioimmunoassay，RIA)、荧光免疫测定法(fluorescentimmunoassay，FIA)以及发光免疫测定法(luminescenceimmunoassay，LIA)。反转录(reversetranscriptase)PCR可用以检测一个对偶基因的mRNA产物。

从患者的组织或体液中，例如：血液、唾液、尿液及毛发取得的基因组(genomic)DNA、cDNA、RNA或蛋白质样本。

发明还提供一种含有用于检测一个或多个基因标记，如：rs17026688,rs17026651及IVS8+48delG的探针。本发明使用“探针”的用语是指任何可用于检测另一个物质的物质。因此，探针可为在一有兴趣的对偶基因中可与一独特区域进行特异性杂交的寡核苷酸或共轭(conjugated)的寡核苷酸。该共轭的寡核苷酸是指可与发光团(chromophore)或含有配位体(ligand)(如︰抗原)的分子共价结合的寡核苷酸，其为对一受体分子有高度特异性(如︰抗体对特定的抗原)。该探针亦可为一PCR引物，其可与另一个引物共同在有兴趣的对偶基因中扩增特定的区域。再者，该探针可为辨别有兴趣对偶基因的抗体或对偶基因的蛋白质的抗体。视情况地，该套组可包含一内部控制对偶基因的探针，其可为存在于一般种族中的任何对偶基因(如︰3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Thekillercellimmunoglobulin-likereceptor，KIR)。该内部控制对偶基因的检测是设计用以确定套组的性能。该探针可固定于固体的载体(support)上，例如︰芯片(array)。

该套组更包含用于从患者收集生物样本的工具及/或试剂，亦即用于从样本制备genomicDNA、cDNAs、RNA或蛋白质的工具及/或试剂。例如︰可包含用于扩增genomicDNA相关区域的PCR引物。

在一个实施例中，套组包含用于检测rs17026688对偶基因型T及rs17026651对偶基因型G或IVS8+48delG的第一探针、第二探针及第三探针，这些探针各可为PCR引物对或用于杂交于芯片中标记的寡核苷酸。视情况地，该套组可包含一个用于检测内部控制对偶基因的探针。

前述或其他的实施例将可由以下对较佳实施例的描述及图式更为清楚，然而其改变或修饰并未脱离本发明揭露内容的精神、范围及概念。

本发明选择由台湾第一型躁郁症研究联盟(TaiwanBipolarConsortium)募集1761个具有双极性情感疾病第一型(BPI)的中国汉族人种患者为本发明的参加样本。本发明以Alda量表(AldaScale)评估患者对锂盐治疗的疗效，且294个接受锂盐治疗的BPI患者进行全基因体相关性研究(genome-wideassociation，GWAS)，然后100个患者样本重复检测显示与锂盐疗效强烈有关的SNP的相关性，且24个患者更进一步进行后续研究。从GWAS样本中94个具有疗效及94个不具疗效进行含外显子、外显子-内含子边界(exon-intronboundaries)以及GADL1部分启动子的定序。

本发明发现两个SNP有高度连锁不平衡，位于谷氨酸脱羧酶样1(GADL1)的内含子rs17026688及rs17026651，在GWAS结果中显示出高度相关性(P＝5.50×10^-37及2.52×10^-37)，及重复100个患者(各SNP的P＝9.19×10^-15)，这两个SNP对预测锂盐疗效具有0.93的高敏感性(sensitivity)，在后续追踪研究(cohort)中区分具有效组及无效组，GADL1的重新定序显示出新的基因变异点，其为位在该基因内含子8的IVS8+48delG变异，与rs17026688处于完全连锁不平衡。IVS8+48delG会影响基因在转录后的剪切反应(splicing)。

本发明揭露rs17026651、GADL1IVS8+48delG及rs17026688可作为预测锂盐治疗在双极性情感疾(BPI)患者的疗效的标记，并且这些对偶基因在欧洲及非洲血统的人种中是很少见的。这些族群中GADL1的其他变异可能会影响对锂盐治疗的疗效。

实验方法

参与者

本发明的研究是在2003年由中央研究院生物医学科学研究所及25个在台湾的医院及精神病院的精神科部门所成立台湾第一型躁郁症研究联盟进行，该联盟最初设立是为了解双极性情感疾病的遗传易感性(geneticsusceptibility)，并扩大范围至情绪稳定剂的药理学研究。该研究的第一部份已如先前所描述，参见Leeetal.,MolPsychiatry2011；16:548-56。总而言之，从台湾第一型躁郁症研究联盟的精神科部门或机构募集彼此没有亲属关系且年纪为20至65岁的双极性情感疾病患者，依据精神疾病诊断及统计手册第四版(DSM-IV)诊断标准诊断该些患者为具有狂躁症伴随或没有伴随抑郁的反复发作的双极性情感疾病，本发明排除其他精神病和情感障碍。

精神科护士或精神科医生以跨文化(cross-culturally)的神经精神医学临床评估表(theSchedulesforClinicalAssessmentinNeuropsychiatry，SCAN)中文版评估本发明的参与者(参阅Chengetal.,BrJPsychiatry2001；178:567-72)，经由来自家庭成员及精神科主治医生的医疗纪录及报告作为辅助数据。本发明的参与者仅为中国汉族人种血统的患者(由本发明的研究小组经由患者的口头报告确定其血统)。本发明于2003年3月至2012年5月底之间募集1761个双极性情感疾病患者。

实验设计及监督

本发明进行全基因体相关性研究(GWAS)的发现(discovery)分析，及两个重复的测试。关于GWAS，本发明连续地从台湾第一型躁郁症研究联盟中的25个精神病院的精神科部门及机构的门诊及住院单位募集1647个双极性情感疾病患者中先确定294个患者(17.9％)。本发明藉由芯片进行1647个患者的基因型分析(详见下文)。在294个患者GWAS样本为在至少二年内接受锂盐预防性治疗中具有好的用药服从性(adherence)，其余患者在同样期间内并未如此。本发明确定与锂盐预防性治疗的疗效有相关性的基因区域，然后在100个具有双极性情感疾病患者的独立群组使用SNPs标记该些对偶基因的重复的测试，这100个患者是从114个双极性情感疾病患者中选出(1647个患者不同)，该114个双极性情感疾病患者是经由精神科医师以锂盐治疗患者超过10年且经观察用药良好。114个患者中的14个因症状不符合标准所以排除(参阅以下表现型定义及评估)。

在第二个重复测试中，将到2012年5月接受锂盐单一治疗至少两年的独立24个患者进行基因型分析。本发明在所有1647个患者样本基于24个患者包含在生病史图表(lifechart)(参阅以下表现型定义及评估)。这24个患者中皆先前以锂盐单一治疗开始但没有满意的疗效，但对非锂盐的情绪稳定剂较具有好的用药服从性(adherence)。

本发明的研究经过参与医院及台湾中央研究院的机构审查委员会同意，且本发明所有参与者皆有签署书面同意书。

表现型定义及评估

为评估双极性情感疾病患者对长期锂盐预防性治疗的疗效，本发明提供在2012年6月之前每一位募集的双极性情感疾病患者的生病史图表含多年临床病程和药物治疗史(N＝1761)，该生病史图表包括狂躁症、轻狂躁症及抑郁发作的开始日期(年及月)、持续时间及严重度(包含功能障碍的严重程度、住院及精神病特征的出现)，且所有患者已开立给予已知的精神药物及情绪稳定剂治疗的剂量和持续的时间的药方，所有门诊会在病历纪录用药服从性，并纪录所有情绪稳定剂的血液浓度以及任何药物不良反应。本发明依据直接咨询病人及其家族成员、咨询多年主治病人的精神科主治医师以及彻底审查病历(medicalchart)以描绘出这些信息图形。基于该生病史图表，本发明确定是否每个患者具有好的用药服从性。

依据生病史图表评估锂盐疗效的表现型，使用MartinAlda及其团队所开发的双极性情感疾病研究锂盐长期治疗疗效的回顾性标准(Alda量表)。该量表有两个标准，标准A量测疾病活动的临床改善程度，并考虑到在给予锂盐治疗的期间及适当剂量时的频率、持续时间及发作的严重程度，与未给予锂盐治疗时的频率、持续时间及发作的严重程度相比较，等级从0(没有改变、或疾病的严重程度加重)至10(完全减缓)。标准B(B1-B5，各评估为0、1或2点)用以确认是否有临床改善与治疗之间的因果关系，B1及B2表示不给予锂盐治疗的复发风险[发作次数(B1)及频率(B2)]，B3为锂盐治疗的长度的量测度，B4表示锂盐的效果，B5为在稳定的这段期间内需要精神药物伴随的量测值。藉由从A级分减去B级分的总和得到总级分。

调查锂盐预防性治疗与临床改善之间的因果关系，更重要的是确保(i)在给予锂盐治疗时期及未给予锂盐治疗时期之间临床病程的相似性(发作的次数、频率及严重度)；(ii)满意的用药服从性(drugcompliance)；(iii)从其他药物(安眠药、抗抑郁药、抗精神病药及其他情绪稳定剂)影响的最小化。为有效降低具疗效及不具疗效的错误分类，本发明因此纳入这些因素为至会影响的标准中。例如，本发明纳入锂盐治疗无效合并抗精神病药物延长使用或使用其他情绪稳定剂的患者，并排除在整个病程中锂盐治疗有效合并使用其他的情绪稳定剂或高剂量抗精神病药物延长使用的患者(B5＝2)。如表1所示，几乎所有的研究患者(95.0％)具有B5的2级分为较差疗效的最佳截断点(cutoff)为5/6。

关于第二次重复测试的患者，本发明进行后续评估(通常为每个月及至少每三个月一次)，对于至少两年的门诊患者，进行含有评估锂盐用药服从性的分析及以SCAN咨询评估临床症状。

从GWAS群组中随机选出18个双极性情感疾病(BPI)患者进行Alda量表的评分者信度(Inter-raterreliability)，三位较资深的精神科医师进行生病史图表的评分。本发明的研究发现在总级分(0-10)3个级分组内相关(intraclasscorrelation)为0.904(参阅表2)。

表1394位双极性情感疾病第一型的患者在锂盐预防性治疗下其他药物的分布

藉由Alda量表测量级分，A-B代表所观察到临床改变认为是由于锂盐的影响程度的因素进行加权总分。在本发明的研究中，A-B最佳的截断点为5/6。

*皆伴随抗抑郁药物的长期使用。

表2在3个级分中Alda量表总分的评分者信度(Inter-raterreliability)

**在3个级分中的组内相关(Intraclasscorrelation)估计为0.904。

本发明的研究成果

先前研究使用Alda量表在锂盐预防性治疗中无效(0-6)及有效(7-10)之间已采用所有级分的6/7作为最佳截断点，参阅如Grofetal.,JClinPsychiatry2002；63:942-7；及Squassinaetal,Pharmacogenomics2011；12:1559-69。关于GWAS，本发明选择4个可能的截断点4/5、5/6、6/7及7/8以区分具有高于50％、65％、80％及90％的减少疾病活性患者分类为对锂盐预防性治疗具有疗效。

基因型鉴定、填补(impuatation)及定序

本发明使用IlluminaHumanHap550-DuoBeadChip及HumanOmni1-QuadBeadChip两种芯片进行1647位参与者基因型鉴定的数据经由HapMapPhase2数据整合，使用质量控制程序于基因型数据及填补数据。本发明使用SEQUENOMMassARRAY在两个重复的结果中最相关的(top)SNPs进行基因型鉴定，然后从GWAS群组随机选择94个具有疗效及94不具疗效的患者以AppliedBiosystems3730DNA定序仪进行GADL1的定序。

统计分析

本发明的研究经由GWAS以Cochran-Armitage趋势测试比较不具疗效及具有疗效对偶基因的发生率，经邦弗朗尼校正(BonferroniCorrection)后对SNPs的数目(1,814,186)及4个不同切点的阀值(threshold)P-值设定在6.9×10^-9，本发明使用分位-分位(quantile-quantile，Q-Q)图检测P-值设的分布，本发明依据4个截断点分析GWAS数据以分类不具疗效及具有疗效。本发明还使用PLINK软件1.07版评估最相关的几个精神病特征(妄想及幻觉)、双极性情感疾病一等亲的家族病史、快速循环发病、发病的年纪、性别及酗酒史为调整值。

结果

本发明研究的参与者

GWAS及重复实验的394个研究参与者的人口统计学和临床特征如表3所示，包含先前报导过与锂盐疗效有关的临床表现型。年龄的中位数为49岁且男性及女性的比例是相近的，并发现研究对象有高的比例具有精神病特征的病史(60％)。在双极性情感疾病的快速循环发病及一等亲中家族病史的百分比分别为25％及31％。本发明研究的参与者的疾病早期发作为15％及酗酒史为8％。

表3研究患者的人口统计及临床特征(N＝394)

双极性情感疾病：双极性情感疾病第一型

包含双亲、小孩及兄弟姐妹。

*包含在狂躁及抑郁发作期间情绪的不一致的妄想和幻觉。

在前12月狂躁、抑郁或轻度狂躁发作至少4次。

在Alda量表的B1-B5，依据标准所有研究的患者具有B1至B4之0级分。

他们皆具有至少4次发作的情绪分布(B1＝0)及每年发作的平均频率≥0.5(B2＝0)；具有接受锂盐治疗至少两年(B3＝0)；且在稳定的期间具有良好的用药服从性(B4＝0)。

在未给锂盐治疗期间，每年发作在4至144的范围的中位数为6及以每年发作平均中位数0.4次为1(每2.5年1次)作为最低值。在研究患者中在锂盐预防性治疗期间具有好的用药服从性的中位数为7年，最短为2年。锂盐血液浓度等于或超过0.5mM。本发明比较在未给予锂盐治疗期间的疾病活动与具有好的用药服从性期间的疾病活动，发现高比例的参与者(88％)有服用其他的药物且群组里有四分之一患者接受长时间使用除了锂盐外抗抑郁药及/或抗精神病药物和/或情绪稳定剂，参阅表4在GWAS及重复测试群组中Alda量表级分的分布。

表4在GWAS及重复测试群组中Alda量表级分的频率分布

相关性分析

本发明的研究经由GWAS分析在294个患者中并没有观察到重要的人口分层(populationstratification)及隐藏的遗传关系。染色体3p24.1的位置显示全在基因组中与锂盐疗效有显着相关(P＜6.9×10-9)；在全基因组中没有其他的染色体区域显示与锂盐疗效有显着相关性(可在国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，登录号phs000692.v1.pl.)的基因型与表现型数据库dbGaP发现来自全基因相关性研究的总统计)。特别是位在GADL1内含子的两个SNPsrs17026688及rs17026651，编码谷氨酸脱羧酶样1(glutamatedecarboxylase-like1)，约72,000个碱基，显示出强烈的相关性，并具有截断点5/6(分别为P＝5.50×10-37及P＝2.52×10-37)，在该截断点rs17026688的最高敏感性(sensitivity)为0.93及特异性(specificity)为0.85；rs17026651的最高敏感性为0.93及特异性为0.86(表5)。

表5Alda量表的总级分在不同截断点rs17026688及rs17026651的胜算比(oddratio)、敏感性(sensitivity)及特异性(specificity)

*依据294个Alda量表的总级分。

在GADL1重复测试群组中，本发明的研究进行在GWAS研究中全基因组显着相关性的rs17026688、rs17026651及同时两侧(flanking)SNPs的基因型鉴定。在重复测试群组中rs17026688及rs17026651两者显示出高度相关性(两个SNPsP＝9.19×10-15)。在GWAS及重复测试样本中对于最相关的SNPs的对偶基因发生率的分布没有显着的不同，组合GWAS及重复测试群的结果(包含394个研究参与者)rs17026688及rs17026651的P值分别为P＝1.66×10^-49及P＝7.07×10^-50(表6)。

以费雪精确性检定(Fisherexacttest)在对偶基因状态及良好疗效状态的相关性产生的P值分别为P＝6.69×10-62及P＝8.30×10-63(表7)。本发明的研究发现两个SNPs处于高度或绝对连锁不平衡(在GWAS群组中，D’＝1.0及r2＝96.6％,且重复测试群组中D’＝1.0及r2＝100％)。

表6在双极性情感疾病第一型中锂盐预防性疗效的全基因组相关性研究：29个显着SNPs*的Cochran-Armitage趋势检测

*不具有疗效：在Alda量表的总级分0-5；具有疗效：在Alda量表的总级分6-10。.

物理位置的数据源是依据NCBI人类基因组的第36次数据(NCBIbuild36.)。

rs17026651及rs17026688的结果是依据使用ABI3730定序仪重新定序的结果。

其他所有的SNPs使用的数据如以下描述：

1.基于GWAS基因型鉴定的结果，以SequenomiPLEXGold(一致性＞95％)确认。

2.基于以SequenomiPLEXGold基因鉴定的结果。

3.上述两组的数据结合的结果。

表7有效的对偶基因及具有疗效的相关性的χ²检定及费雪精确性检定(Fisherexacttest)的P值及χ²检定

*Alda量表的总级分≥6。

物理位置的数据源是依据NCBI人类基因组的第36次数据(NCBIbuild36.)。

rs17026651及rs17026688的结果是依据使用ABI3730定序仪重新定序的结果。其他所有的SNPs使用的数据是基于两组数据结合的数据：以SequenomiPLEXGold确认GWAS基因型鉴定的数据((N＝294)(一致性>95％)与以SequenomiPLEXGold进行重复测试(N＝100)基因鉴定的数据结合。

在第二重复测试中(后续研究)，24个患者中两个最相关的SNPs处于完全连锁不平衡，“具疗效”对偶基因(N＝16)的所有带因者显示出对锂盐治疗具有好的疗效(Alda的总级分范围为8至10)，以及所有非对偶基因带因者(N＝8)显示出差的疗效(Alda的总级分范围为0至3)(表8)。GWAS(N＝394)及后续研究(N＝24)分别达到0.85及0.95的接受力(acceptablepower)。

表8后续研究24个双极性情感疾病第一型患者中对锂盐预防性治疗疗效的结果

Alda量表的总级分

在Alda量表，在锂盐治疗稳定的期间评估其他的药物；

0＝除了非经常性的睡眠药物外没有使用其他药物(每周一剂量或更少)

1＝低剂量的抗抑郁药及/或抗精神病药物和/或长时间使用睡眠药物

2＝长时间使用抗抑郁药及/或抗精神病药物和/或情绪稳定剂

本发明更进一步分析rs17026688(表9)，为评估可能会影响锂盐治疗的其他因素，本发明从所有394个参与者的数据进行逻辑回归分析(logisticregressionanalyses)(表10)。本发明结果显示在rs17026688的对偶基因T的带因者显示出比另一个对偶基因对锂盐治疗具有较好的疗效(P＝3.39×10-32，OR＝111.87，95％CI51.14-244.73，PPV＝0.83,95％CI0.76，0.88)。此外，患者快速循环发病(无关遗传状态)比那些没有该对偶基因的患者具有稍微较好的疗效(P＝8.47×10-4，OR＝3.88，95％CI1.75-8.59)。在相同的逻辑回归分析，当在rs17026688条件时，其他21个两侧SNPs显示出指定的显着性(nominalsignificance)或非指定的显着性(所有的P值>0.00185，表11)。

重新定序(RE-SEQUENCING)GADL1

因为SNPs显示出与GADL1的内含子有高度相关性，本发明接着寻找可能影响GADL1表现的局部变异(localvariant)。从GWAS群组294个患者中随机选择94个具有疗效的患者及94个不具疗效的患者进行外显子(exon)、内含子-外显子边界(exon-intronboundaries)及2-kb区域代表部分GADL1启动子的分析。本发明的研究发现32个基因多型性证实其他GADL1基因上的变异皆与双极性情感疾病患者对锂盐治疗疗效的相关性(表12)，其中的GADL1内含子8的缺失(GADL1IVS8+48delG)更具有显着的相关性。所有本发明的研究分成三群组的每一个参与者(N＝417)进行该变异的基因型鉴定，发现其与rs17026688处于连锁不平衡。

IVS8+48delG变异的影响

为检测IVS8+48delG变异对于GADL1mRNA剪切反应(splcing)的影响，本发明使用两株胶质衍生神经(glioma-derivedneural)细胞株，经由RT-PCR确认mRNA异构物(isoform)，一细胞株(GBMS1R1)带有IVS8+48delG变异，及另一个细胞株(GBM8401)带有两个非突变的等位基因。本发明研究两种GADL1mRNA异构物：GBM8401表现含有外显子5至10(略过外显子7及8)主要的mRNA异构物(499bp)，本发明的研究亦含有外显子5、6、9及10(略过外显子7及8，推测是选择性的剪切反应造成)的少数剪切变异(364bp)。相较于GBM8401细胞株，GBMS1R1细胞株(带有IVS8+48delG变异)显示出较低量的主要异构物，而选择性剪切(alternatively-spliced)造成的较小mRNA种类则为增加。

*全基因组关联研究总Alda级分＝6-10总Alda级分＝0-5

表10在双极性情感疾病第一型患者(N＝394)：对锂盐预防性治疗的遗传及临床因素逻辑回归模块(Logisticregressionmodel)*

*Logit(具有疗效)＝rs17026688+家族病史+早期发作+酗酒+精神病+快速循环发病+性别，以下变量的定义编码为1，其他为0：

在Alda量表具有疗效的总级分从6至10

Rs17026688：有效对偶基因T的带因者

家族病史：双极性情感疾病患者一等亲(双亲、小孩及兄弟姐妹)

早期发作：≤15岁

酗酒：在双极性情感疾病病程中具有酒精使用疾病的患者

精神病：在狂躁及抑郁发作期间患者有妄想和/或幻觉

快速循环发病：在前12个月狂躁、抑郁或轻度狂躁发作至少4次

性别：男性

表11在双极性情感疾病第一型患者(N＝394)在rs17026688出现时对锂盐预防性治疗的遗传因素：逻辑回归模块(Logisticregressionmodel)*

*Logit(具有疗效)＝rs17026688+家族病史+早期发作+酗酒+精神病+快速循环发病+性别，以下变量的定义编码为1，其他为0：

在Alda量表具有疗效的总级分从6至10

SNP：SNP有效对偶基因带因者

Rs17026688：有效对偶基因T的带因者

家族病史：双极性情感疾病患者一等亲(双亲、小孩及兄弟姐妹)

早期发作：≤15岁.

酗酒：在双极性情感疾病病程中具有酒精使用疾病的患者

精神病：在狂躁及抑郁发作期间患者有妄想和/或幻觉

快速循环发病：在前12个月狂躁、抑郁或轻度狂躁发作至少4次

性别：男性**多重比较(multiplecomparisons)邦弗朗尼校正(BonferroniCorrection)的后所有P值非显着(<0.00185＝0.05/26)

表12藉由重新定序鉴定在GADL1的变异

c＝cDNA序列，c.+1是ATG-翻译起始密码子，c.-1是核苷酸5’端的ATG翻译起始密码子。

其他实施例

本说明书揭露的所有特征可以任意组合方式结合。说明书中所揭露的每一特征可取代为其他具有相同、等效或相似目的特征。据此，除非有其他明确阐述，在此所揭露的各个特征仅为上位系列的等效或相似特征的实施例。

根据上述内容，该领域熟习此技艺人士可轻易地确认本发明的必要特征，且未脱离本发明保护范围及精神，可对本发明作不同变化及修饰以用于不同用途及条件。据此，其它实施例亦在本发明请求保护范围中。