公开/公告号CN105367693A
专利类型发明专利
公开/公告日2016-03-02
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申请/专利权人 公安部第一研究所;北京中盾安民分析技术有限公司;
申请/专利号CN201510481811.2
申请日2015-08-03
分类号C08F120/56;C08F2/38;C08F4/30;C12N15/10;C12Q1/68;
代理机构北京中海智圣知识产权代理有限公司;
代理人徐金伟
地址 100048 北京市海淀区首体南路1号
入库时间 2023-12-18 14:35:31
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-03-16
著录事项变更 IPC(主分类):C08F120/56 变更前: 变更后: 申请日:20150803
著录事项变更
2018-02-02
授权
授权
2016-03-30
实质审查的生效 IPC(主分类):C08F120/56 申请日:20150803
实质审查的生效
2016-03-02
公开
公开
技术领域
本发明涉及毛细管电泳的筛分介质技术领域,具体涉及一种用于毛细管电泳的无胶筛 分介质及其制备方法。
背景技术
现有技术中,毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)又叫高效毛细管电泳 (HPCE),是近年来发展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在 75μm内径的毛细管柱内加高电压进行分离,创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等 建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten建立了毛细管等电聚焦,Cohen和 Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988~1989年出现了第一批商品化的毛细管电泳仪。短 短几年内,由于毛细管电泳(CE)符合以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋 白质(包括酶、抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求,从而得到了迅 速的发展。
毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,以样品在 电场下移动速率不同而达到分离目的的液相微分离分析技术,具有分离效率高、分析时间 短、样品消耗少等优点。毛细管电泳通常使用石英毛细管,内径范围在50μm至100μm, 长度从25cm到75cm。在DNA分离过程中,分离介质起着非常重要的作用,它决定了DNA 的迁移特性、分离度、读出长度、重现性、注入时间、注入压力以及毛细管寿命等,因此 分离介质的研究是DNA分离与测序工作中最重要的组成部分之一。分离介质可分为凝胶筛 分介质和无胶筛分介质(非交联的高分子溶液)两种。1989年首次报道了以水溶性高分子 溶液为介质的毛细管电泳成功地分离了dsDNA,自此高分子溶液取代凝胶而作为DNA分离 介质得到广泛研究。
理想的DNA分离介质应具备:良好的筛分性能;自涂覆能力,以抑制电渗流以及消除 DNA与毛细管管壁之间的吸附作用;良好的溶解能力和高亲水性;高分子量、低粘度,以 便于注入和更换介质,利于DNA分析和分离的自动化;在碱性条件下具有良好的化学稳定 性。现已形成以聚丙烯酰胺(LPA)和聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)为主,其他多种高分子 聚合物为辅的无胶筛分体系。
STR分型及ssDNA测序分析使用的溶液通常以一定浓度的线性均聚物作为溶质。亲水 性聚合物以非共价方式吸附到毛细管内壁,抑制电渗流并能避免DNA与内壁的相互作用。 LPA具有高亲水性和优良的DNA分离能力。但是它还有高粘度、在高PH值条件下易于水解 等缺点。我们在聚合丙烯酰胺时严格控制聚合反应温度、时间等影响因素,通过控制分子 量从而提高LPA的缠结热稳定性,发挥其高亲水性及良好的筛分能力。
中国专利CN102220599B公开了一种聚合物链的准互穿聚合物网络,所述聚合物链包 括:
(a)长链线性聚(N,N一二甲基丙烯酰胺)链,其粘均分子量在800kDa~1200kDa的范 围;(b)短链线性聚(N,N一二甲基丙烯酰胺)链,其粘均分子量在20kDa~60kDa的范 围;和(c)丙烯酰胺和N,N-二甲基丙烯酰胺的无规共聚物链,所述无规共聚物在所述长链 线性聚(N,N一二甲基丙烯酰胺)链(a)和所述短链线性聚(N,N一二甲基丙烯酰胺)链(b) 的存在下通过将丙烯酰胺单体和N,N二甲基丙烯酰胺单体进行氧化还原自由基聚合制备, 所述无规共聚物的分子量大小在1MDa~10MDa的范围,其中在所述丙烯酰胺和N,N-二甲 基丙烯酰胺的无视共聚物链中,所述单体丙烯酰胺和所述单体N,N一二甲基丙烯酰胺的重 量比为90:10~99.9:O.1;其中,所述长链、短链线性聚(N,N一二甲基丙烯酰胺)和所 述丙烯酰胺和N,N一二甲基丙烯酰胺的无视共聚物链彼此缠结、互穿,形成聚合物链的准 互穿聚合物网络,并且其中,所述聚合物链的准互穿聚合物网络无化学交联,和其中所述 无视共聚(丙烯酰胺-N,N-二甲基丙烯酰胺)与所述长链聚(N,N二甲基丙烯酰胺)和所 述短链聚(N,N一二甲基丙烯酰胺)两者之和的重量比是50:50~99:10。但是,该专利 还存在分辨率低、稳定性差的问题。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷,本发明提供制备的筛分介质可用于STR分型、ssDNA测 序的毛细管电泳分离,本发明提供一种制备具有高分辨率、高稳定性、低粘度的毛细管电 泳无胶筛分介质及其制备方法。
本发明是通过如下技术方案实现的:一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质,包括聚合 物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂,所述聚合物单体为丙烯酰胺,所述溶剂为去 离子水,所述链转移剂是异丙醇,所述引发剂是过硫酸铵,所述催化剂是N,N,N,N-四甲基 二乙胺,所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的配比为 20-30g:180-270ml:5.24-7.86ml:1.0-2.0ml:1.0-2.0ml,得到无胶筛分介质。
进一步地,所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的 配比为25g:222ml:6.55ml:1.25ml:1.25ml。
进一步地,所述无胶筛分介质是聚丙烯酰胺。
本发明还提供了一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法,包括以下步骤:
步骤1):将聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂混合步骤,选取所述聚合 物单体为丙烯酰胺,所述溶剂为去离子水,所述链转移剂是异丙醇,所述引发剂是过硫酸 铵,所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺混合物;
按照所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的配比为 25g:222ml:6.55ml:1.25ml:1.25ml;在无氧环境下进行聚合反应,得到聚合物;
步骤2):对步骤1)得到的所述聚合物经透析步骤、冷冻干燥步骤之后在溶胶缓冲液 中进行溶胀步骤;
步骤3):再经抽滤步骤获得所述筛分介质,所述抽滤步骤是将溶胀后的溶液经0.2μ m的尼龙滤器过滤,所述筛分介质是聚丙烯酰胺。
进一步地,步骤1)中所述无氧环境是在反应容器中通入高纯氮气条件,反应时间为 10-60分钟,聚合反应温度为35℃。
进一步地,所述反应时间为90分钟。
进一步地,所述溶胶缓冲液为浓度配比是:0.5M:0.5M:0.02M:7M的三羟甲基氨基 甲烷、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、乙二胺四乙酸钙离络合剂和尿素溶液。
进一步地,步骤2)中所述透析步骤选用截留分子量为12-14KDa的透析袋进行透析。
进一步地,所述聚丙烯酰胺重均分子量范围为10-100KDa。
进一步地,所述聚丙烯酰胺重均分子量为20-40KDa。
与现有技术相比,优越效果在于:本发明制备的筛分介质具有良好的筛分性能,具有 良好的溶解能力和高亲水性,能够有效的减少DNA与毛细管管壁之间的吸附作用,高分子 量、低粘度,便于注入和更换介质,利于DNA分析和分离的自动化,完全满足现阶段法医 STR分析检测的目的要求。
附图说明
图1为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的1H-NMR谱图,其中溶剂为D2O;
图2为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的LIZ500电泳结果图谱;
图3为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的Ladder电泳结果图谱;
图4为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的9947A电泳结果图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
具体说明本发明提供的一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质,包括聚合物单体、溶剂、 链转移剂、引发剂和催化剂,所述聚合物单体为丙烯酰胺,所述溶剂为去离子水,所述链 转移剂是异丙醇,所述引发剂是过硫酸铵(APS),所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺 (TEMED),所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵(APS)和N,N,N,N-四甲基二乙 胺(TEMED)的配比为(20-30)g:(180-270)ml:(5.24-7.86)ml:(1.0-2.0)ml:(1.0-2.0) ml,得到无胶筛分介质,所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵(APS)和N,N,N,N- 四甲基二乙胺(TEMED)的配比为25g:222ml:6.55ml:1.25ml:1.25ml,优选。所述无 胶筛分介质是聚丙烯酰胺(LPA),结构式如下:
本发明还提供了一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法,所述方法包括以下 步骤:
步骤1):将聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂混合步骤,选取所述聚 合物单体为丙烯酰胺,所述溶剂为去离子水,所述链转移剂是异丙醇,所述引发剂是过硫 酸铵(APS),所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED);
按照所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵(APS)和N,N,N,N-四甲基二乙胺 (TEMED)的配比为(20-30)g:(180-270)ml:(5.24-7.86)ml:(1.0-2.0)ml:(1.0-2.0) ml;在无氧环境下进行聚合反应,得到聚合物;
步骤2):对步骤1)得到的所述聚合物经透析步骤、冷冻干燥步骤之后在溶胶缓冲液 中进行溶胀步骤;
步骤3):经抽滤后获得所述筛分介质,所述抽滤是将溶胀后的溶液经0.2μm的尼龙 滤器过滤,所述筛分介质是聚丙烯酰胺(LPA)。步骤1)中所述无氧环境是在反应容器中 通入高纯氮气条件,反应时间为10-60分钟,聚合反应温度为35℃,本实施例的所述反 应时间为90分钟。所述溶胶缓冲液为浓度配比是:0.5M:0.5M:0.02M:7M的三羟甲基 氨基甲烷(Tris)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、乙二胺四乙酸钙离络合 剂(EDTA)和尿素溶液,其中步骤2)中所述透析步骤选用截留分子量为12-14KDa的透 析袋进行透析。本发明中,所述聚丙烯酰胺重均分子量(Mw)范围为10-100KDa,优选所 述聚丙烯酰胺重均分子量(Mw)为20-40KDa。
实施例2
本实施例中,所用试剂主要来自Sigma-Aldrich公司(USA)。具体操作是按照在如下 步骤制备:在圆底烧瓶中加入222ml去离子水与6.55ml异丙醇(分析纯)在35℃下通入 高纯氮气(99.99%)对溶液除氧10分钟。然后依次加入25g丙烯酰胺(AM)、1.25ml10% (v/v)的N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)和1.25ml10%(w/v)的过硫酸铵(APS),500rpm 下进行磁力搅拌,反应90min后,溶液呈蜂蜜粘稠状。选用截留分子量为12-14KDa的透 析袋(Spectra/por#2,Spectrum公司,USA)透析三天。透析后聚合物溶液经-60℃冷 冻干燥72小时,得到白色固体即为筛分介质,反应得率约为80%。
实施例3筛分介质的表征
11H-NMR光谱仪:用D2O作溶剂,对聚合物(白色固体)进行表征,如图1所示。从 图1中可以看出聚合物(聚丙烯酰胺)的结构正确,并且纯度高,不含有单体和溶剂等杂 质。
2凝胶渗透色谱仪(GPC):聚合物经WatersBreezeTM2HPLC系统测试分析,柱子是 WatersUltrahydrogelLinearColumn,泵是Waters1515,PDA检测器,流动相是水, 测试结果见表1。
表1凝胶渗透色谱仪(GPC)测试结果
实施例4凝胶的配制
1溶胶缓冲液的配制:
1)10X电泳缓冲液称取6.05g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、12.16gN-三(羟甲基) 甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、0.74gEDTA加入到含80ml去离子水的100ml容量瓶中混 匀,加入去离子水定容至100ml;
2)1X电泳缓冲液称量19g尿素(分析纯)。加入到一个干净的100ml容量瓶中,加 入25ml去离子水,手动温和摇匀直到所有尿素溶解。加入5ml10X电泳缓冲液,温和振 荡,加入去离子水定容至50ml。
2凝胶的配制:
称取白色固体状的聚丙烯酰胺2g,加入50ml1X电泳缓冲液,过夜进行溶胀。使用 0.2μm的滤器过滤,收集过滤物放入一个干净的容量瓶中,摄氏温度4℃保存,防止尿素 降解。
实施例5电泳检测
LIZ500分子量内标的检测:
1、采用配制的凝胶;
2、在GA118-16A型遗传分析仪上进行电泳检测;
电泳条件:毛细管长度是16X36cm,电泳电压是15KV,电泳温度是60℃;
3、换新配置的1XRunningBuffer(310and31xxRunningBuffer,Applied Biosystems,USA);
4、启动自动换胶系统;
5、按照操作说明进行了毛细管电泳检测。
如图2所示,电泳结果经GeneMapperID-X(AppliedBiosystems,USA)分析,可 见LIZ500内标峰型尖锐,分离度好,无杂峰、非特异性峰且无拖尾现象。
等位基因Ladder的检测:
1、采用配制的凝胶;
2、在GA118-16A型遗传分析仪上进行电泳检测;
电泳条件:毛细管长度是16X36cm,电泳电压是15KV,电泳温度是60℃;
3、换新配置的1XRunningBuffer(310and31xxRunningBuffer,Applied Biosystems,USA);
4、启动自动换胶系统;
5、按照操作说明进行了毛细管电泳检测。
如图3所示,电泳结果经GeneMapperID-X(AppliedBiosystems,USA)分析,可 见等位基因Ladder峰型尖锐,分离度好,能够分离长度相差1bp的DNA片段,无杂峰、 无拖尾现象,无丢峰现象。
进行9947A的检测:
1、采用配制的凝胶;
2、在GA118-16A型遗传分析仪上进行电泳检测;
电泳条件:毛细管长度是16X36cm,电泳电压是15KV,电泳温度是60℃;
3、换新配置的1XRunningBuffer(310and31xxRunningBuffer,Applied Biosystems,USA);
4、启动自动换胶系统;
5、按照操作说明进行了毛细管电泳检测。
如图4所示,电泳结果经(GeneMapperID-X(AppliedBiosystems,USA)分析,可 见9947A分型正确,峰型尖锐,分离度好,无杂峰、非特异性峰且无拖尾现象,无丢峰 现象。
本发明并不限于上述实施方式,在不背离本发明的实质内容的情况下,本领域技术人 员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的保护范围。
机译: 一种用于无溢液回注的方法和系统,用于无溢液回注的枪,与水箱的连接,用于无溢液回注系统的控制和通信的方法和系统,用于介质的方法和系统无溢料回填系统,无溢料和液密回填的提供
机译: 一种用于无溢液回注的方法和系统,用于无溢液回注的枪,与水箱的连接,用于无溢液回注系统的控制和通信的方法和系统,用于介质的方法和系统无溢料回填系统,无溢料和液密回填的提供
机译: 一种用于无溢液回注的方法和系统,用于无溢液回注的枪,与水箱的连接,用于无溢液回注系统的控制和通信的方法和系统,用于介质的方法和系统无溢料回填系统,无溢料和液密回填的提供