激活GLP-1受体和Amylin受体双功能作用的融合蛋白制备及其用途

摘要

本发明公开了激活GLP-1受体和Amylin受体双功能作用的融合蛋白制备方法及其应用。本发明所述的双功能融合蛋白结构表示为：融合蛋白1：X-连接肽-X-连接肽-IgG？Fc片段-连接肽-Y-连接肽-Y；融合蛋白2：Y-连接肽-Y-连接肽-IgG？Fc片段-连接肽-X-连接肽-X；融合蛋白3：X-连接肽-Y-连接肽-IgG？Fc片段-连接肽-X-连接肽-Y；融合蛋白4：Y-连接肽-X-连接肽-IgG？Fc片段-连接肽-Y-连接肽-X；融合蛋白5：X-连接肽-IgG？Fc片段-连接肽-Y；融合蛋白6：Y-连接肽-IgG？Fc片段-连接肽-X；融合蛋白7：X-连接肽-Y-连接肽-IgG？Fc片段；X为GLP-1类似物；连接肽为(GGGGS)n；Y为Amylin类似物。本发明公开了双功能融合蛋白片段及其编码基因、包含载体的宿主细胞及其制备方法。本发明所提供的融合蛋白具有两种蛋白生理活性，在治疗糖尿病、肥胖症、代谢综合症以及心血管疾病等方面具有明显的优势和良好的前景。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及新型双功能融合蛋白的制备及其用途。

背景技术

血糖的稳态受胰岛素和体内多种激素严密调节，对维持机体的正常功能具有重要作用。然而，由于胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍将导致以高血糖为特征的代谢性疾病。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身组织器官，特别是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍和衰竭。其中体内天然存在的调节胰岛素和血糖水平的激素有胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)和胰淀粉样多肽(Amylin)。

GLP-1主要通过刺激胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌发挥调节血糖的作用，同时，GLP-1也能抑制胰岛β细胞凋亡，促其再生；GLP-1也能减慢胃排空速度，并通过作用下丘脑，抑制食欲。Amylin是一种由37个氨基酸残基构成的多肽激素，与胰岛素共分泌自胰腺β细胞，主要生理功能为减缓胃排空和延迟葡萄糖吸收，还通过抑制胰高血糖素减少肝糖的产生，减少食欲，辅助胰岛素调节血糖水平。Amylin类似物“普兰林肽”辅助胰岛素治疗糖尿病的疗效已得到证实；近年来，Amylin类似物的疗效尤其对肥胖型糖尿病的疗效备受关注。GLP-1和Amylin在体内均能调节血糖水平，但二者在功能上有所不同，作用可以互补。JamesL.Trevaskis(PLOSONE；October2013,Volume8,Issue10)等人以化学合成的方式将二者融合，拟行使两种激素的生理作用。动物实验表明，融合肽优于两种肽类激素单独作用的效果，在降低体重的效果尤为显著。由于该融合肽分子仍然偏小，易于被体内蛋白酶降解或肾小球滤过，导致体内半衰期短，因而限制了其临床应用的价值。中国专利“GLP-1类似物和amylin类似物的融合蛋白制备及其用途”(申请号：201410357012.X)公开了一种以基因工程技术将人IgGFc片段与GLP-1类似物和amylin类似物融合成一种长效蛋白分子，然而，该融合蛋白所采用的GLP-1类似物的生物活性低于现有的GLP-1类似物Dulaglutide(LY2189265)，后者为目前公认临床治疗糖尿病疗效最好的长效制剂。

发明内容

基于中国专利“GLP-1类似物和amylin类似物的融合蛋白制备及其用途”(申请号：201410357012.X)中描述的融合蛋白GIA，本发明的目的是提供一系列效果更好的激活GLP-1受体和Amylin受体双功能作用的融合蛋白，该融合蛋白具有GLP-1和Amylin的双重生物活性，且具有长效功能，可实现协同降糖同时伴随体重下降的作用。

本发明提供的双融合蛋白由GLP-1类似物(G)、Amylin类似物(A)与人免疫球蛋白Fc片段通过DNA重组技术或基因工程手段实现，并由以下通式表示：

双功能融合蛋白GA1：X-连接肽-X-连接肽-IgGFc片段-连接肽-Y-连接肽-Y；

双功能融合蛋白GA2：Y-连接肽-Y-连接肽-IgGFc片段-连接肽-X-连接肽-X；

双功能融合蛋白GA3：X-连接肽-Y-连接肽-IgGFc片段-连接肽-X-连接肽-Y；

双功能融合蛋白GA4：Y-连接肽-X-连接肽-IgGFc片段-连接肽-Y-连接肽-X；

双功能融合蛋白GA5：X-连接肽-IgGFc片段-连接肽-Y；

双功能融合蛋白GA6：Y-连接肽-IgGFc片段-连接肽-X；

双功能融合蛋白GA7：X-连接肽-Y-连接肽-IgGFc片段；

其中，X为GLP-1类似物；连接肽为(GGGGS)n；Y为Amylin类似物。

本发明提供的双功能融合蛋白，由GLP-1类似物(G)、Amylin类似物(A)与人免疫球蛋白Fc片段连接形成融合蛋白，其具体序列如下：

GLP-1类似物的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：1所述；

Amylin类似物的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：3所述；

IgG1Fc的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：5所述；

IgG2Fc的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：7所述；

IgG3Fc的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：9所述；

IgG4Fc的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：11所述。

IgG2/4Fc的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：13所述。

双功能融合蛋白GA1的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：15所述

双功能融合蛋白GA2的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：17所述

双功能融合蛋白GA3的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：19所述

双功能融合蛋白GA4的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：21所述

双功能融合蛋白GA5的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：23所述

双功能融合蛋白GA6的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：25所述

双功能融合蛋白GA7的氨基酸如序列表中的SEQIDNO：27所述

编码所述上述融合蛋白核苷酸序列如下：

GLP-1类似物的核苷酸如序列表中的SEQIDNO：2所述；

Amylin类似物的核苷酸如序列表中的SEQIDNO：4所述；

IgG1Fc的核苷酸如序列表中的SEQIDNO：6所述；

IgG2Fc的核苷酸如序列表中的SEQIDNO：8所述；

IgG3Fc的核苷酸如序列表中的SEQIDNO：10所述；

IgG4Fc的核苷酸如序列表中的SEQIDNO：12所述；

IgG2/4Fc的核苷酸如序列表中的SEQIDNO：14所述；

双功能融合蛋白GA1核苷酸如序列表中的SEQIDNO：16所述。

双功能融合蛋白GA2核苷酸如序列表中的SEQIDNO：18所述。

双功能融合蛋白GA3核苷酸如序列表中的SEQIDNO：20所述。

双功能融合蛋白GA4核苷酸如序列表中的SEQIDNO：22所述。

双功能融合蛋白GA5核苷酸如序列表中的SEQIDNO：24所述。

双功能融合蛋白GA6核苷酸如序列表中的SEQIDNO：26所述。

双功能融合蛋白GA7核苷酸如序列表中的SEQIDNO：28所述。

本发明同时提供了上述核酸序列的表达载体，其能在转化的宿主细胞中复制表达。

本发明还提供了一种制备双功能融合蛋白的方法，将上述表达载体引入合适的表达系统，从而进行融合蛋白的表达。

本发明双功能融合蛋白的表达载体，可以是重组真核表达载体，优选哺乳动物细胞表达载体；也可以是重组病毒表达载体，优选腺相关病毒或腺病毒载体。

含有表达上述双功能融合蛋白的宿主细胞，可以为CHO细胞及其亚系或293细胞及其亚系，或经过基因工程改造的CHO细胞及其亚系或293细胞及其亚系。

附图说明

图1GA融合蛋白对U₂O_S/GLP-1R细胞cAMP生成的影响

图2GA融合蛋白对损伤的RIN-5F细胞修复的影响

图3GA融合蛋白对HepG2细胞cAMP生成的影响

具体实施方式

提供以下实施例对本发明作进一步阐释。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。

实施例1融合蛋白的制备

1、质粒构建

1.1基因和引物合成

表达序列通过下述合成的基因重组至表达载体。基因和引物由金唯智公司合成，合成基因序列重组至质粒载体pUC19中，获得包含目的基因的质粒分别为pUC-GA1、pUC-GA2、pUC-GA3、pUC-GA4、pUC-GA5、pUC-GA6和pUC-GA7；以下为合成基因片段序列。

合成基因片段GA1:

GCAGATCTCCTAGGGCCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCCTCGGACTCCTTGCTTATGGATCAGGAGTCGACTCTCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGCTGAGTCCAAGTATGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATTTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCTGAAGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATTTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATTGCCGTCGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCCGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTTTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTCGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATTGATTAATTAAGTATACGC

合成基因片段GA2:

GCAGATCTCCTAGGGCCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCCTCGGACTCCTTGCTTATGGATCAGGAGTCGACTCTAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGCTGAGTCCAAGTATGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATTTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCTGAAGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATTTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATTGCCGTCGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCCGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTTTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTCGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCTGATTAATTAAGTATACGC

合成基因片段GA3:

GCAGATCTCCTAGGGCCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCCTCGGACTCCTTGCTTATGGATCAGGAGTCGACTCTCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGCTGAGTCCAAGTATGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATTTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCTGAAGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATTTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATTGCCGTCGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCCGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTTTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTCGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATTGATTAATTAAGTATACGC

合成基因片段GA4:

GCAGATCTCCTAGGGCCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCCTCGGACTCCTTGCTTATGGATCAGGAGTCGACTCTAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGCTGAGTCCAAGTATGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATTTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCTGAAGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATTTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATTGCCGTCGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCCGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTTTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTCGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCTGATTAATTAAGTATACGC

合成基因片段GA5:

GCAGATCTCCTAGGGCCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCCTCGGACTCCTTGCTTATGGATCAGGAGTCGACTCTCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGCTGAGTCCAAGTATGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATTTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCTGAAGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATTTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATTGCCGTCGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCCGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTTTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTCGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATTGATTAATTAAGTATACGC

合成基因片段GA6:

GCAGATCTCCTAGGGCCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCCTCGGACTCCTTGCTTATGGATCAGGAGTCGACTCTAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGCTGAGTCCAAGTATGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATTTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCTGAAGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATTTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATTGCCGTCGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCCGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTTTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTCGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCTGATTAATTAAGTATACGC

合成基因片段GA7:

GCAGATCTCCTAGGGCCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCCTCGGACTCCTTGCTTATGGATCAGGAGTCGACTCTCACGGAGAGGGCACCTTCACCAGCGACGTGAGCTCCTACCTGGAGGAACAGGCCGCCAAGGAGTTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGAGGCGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCAAATGCAACACTGCCACATGTGCAACGCAGCGCCTGGCAAATTTTTTAGTTCATTCCAGCAACAACTTTGGTGCCATTCTCCCACCTACCAACGTGGGATCCAATACATATGGCGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGCTGAGTCCAAGTATGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGGCTGCTGGAGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATTTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCTGAAGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATTTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATTGCCGTCGAGTGGGAAAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCCGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTTTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTCGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCTGATTAATTAAGTATACGC

引物合成

P1：5’-GGTCTATATAAGCAGAGCTG-3’

P2：5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACT-3’

1.2基因片段的获得

对表达载体BP0001质粒以及包含目的基因的质粒pUC-GA1、pUC-GA2、pUC-GA3、pUC-GA4、pUC-GA5、pUC-GA6和pUC-GA7分别进行双酶切处理，酶切体系的建立：在1.5mlEP管中加入如下成分：酶切体系1的建立：在8个不同的1.5mlEP管中加入如下成分：BP0001质粒或pUC-GA1、pUC-GA2、pUC-GA3、pUC-GA4、pUC-GA5、pUC-GA6和pUC-GA7质粒分别40μl(加入8个不同EP管中)，CutSmartBuffer10μl，AvrⅡ和PacI各5μl，灭菌水45μl，混匀后在37℃下反应5h，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，切胶回收目的基因片段，QIAGEN胶回收纯化试剂盒进行胶体回收处理，获得线性化处理的载体片段BP0001(A/P)以及含粘性末端的基因片段分别为命名为GA1(A/P)、GA2(A/P)、GA3(A/P)、GA4(A/P)、GA5(A/P)、GA6(A/P)、GA7(A/P)。

1.3重组质粒的连接转化

在T4连接酶的作用下，将已用相同酶切后回收获得的载体片段BP0001(A/P)分别与7种不同的基因片段GA1(A/P)、GA2(A/P)、GA3(A/P)、GA4(A/P)、GA5(A/P)、GA6(A/P)、GA7(A/P)进行连接反应。连接反应体系如下：在7个不同的1.5mlEP管中加入如下成分BP0001(A/P)2μl，基因片段GA1(A/P)、GA2(A/P)、GA3(A/P)、GA4(A/P)、GA5(A/P)、GA6(A/P)、GA7(A/P)各6μl(加入7个不同EP管中)，10×T4Buffer1μl，T4DNAligase1μl，混匀后在室温(20℃左右)下反应4h以上，连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞中，涂布于2YT(KANA)平板培养基上37℃静止过夜，平板编号pGA1、pGA2、pGA3、pGA4、pGA5、pGA6和pGA7。

1.5重组质粒的菌落PCR筛选

从pGA1、pGA2、pGA3、pGA4、pGA5、pGA6和pGA7平板中各挑取数个重组单菌落经过培养后做为PCR模板，分别进行PCR筛选鉴定。菌液PCR扩增反应体系(总体积20μL):2×TaqHS10μL、菌液模板2μL、上下游引物(P1和P2)各1μL(终浓度0.3μmol/L)，最后用双蒸水补至20μL；反应条件：95℃2min，一个循环；94℃60s、53℃60s、72℃120s，30个循环；最后72℃5min。琼脂糖凝胶电泳分析结果，筛选获得阳性克隆。

1.6重组质粒的酶切鉴定

通过菌落PCR鉴定正确的菌落接种后提取再进行酶切鉴定。首先进行重组菌的质粒提取，然后进行酶切分析，酶切体系：在1.5mlEP管中加入如下成分：质粒2μl，CutSmartBuffer1μl，AvrⅡ和PacI各1μl，补灭菌水至10μl，混匀后在37℃下反应4h。琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定获得阳性克隆。

1.7重组质粒的测序鉴定

将通过菌落PCR和酶切鉴定正确的菌落随机接种数个菌落再进行测序鉴定。提供菌液样品重组质粒送至公司进行测序鉴定。测序鉴定正确的表达质粒进行质粒大量提取，分别命名为pGA1、pGA2、pGA3、pGA4、pGA5、pGA6和pGA7，保存备用。

2、质粒转染及细胞筛选

采用宿主细胞CHO-S或DG44或经过基因工程改造的CHO细胞系，按照电转染试剂盒说明书分别进行质粒转染。转入质粒的细胞分别置于摇瓶培养(37℃、8％CO₂、110rpm/min)至48h，细胞计数仪检测细胞活率和细胞数。

转染48h后进行加压筛选：即MTX浓度从100nM起逐渐加至200nM、500nM、700nM、和1000nM，并获得初筛细胞，再经有限稀释法进行单克隆细胞筛选，获得单克隆细胞系获得初筛细胞。通过检测蛋白表达量以及纯度从中优选克隆逐级扩大培养。

3、蛋白表达和纯化

筛选高产克隆细胞从96孔板扩至24孔板生长，然后扩至6孔板生长，之后扩至50mL摇瓶生长。收集培养7天细胞培养上清液，离心除去细胞碎片，上清液以0.45μm滤膜过滤，调节pH至7.4，用HiTrapProtein-ASepharoseaffinitycolumn纯化融合蛋白，5倍柱床体积的去离子水冲洗柱子，再用5倍柱床体积的PBS缓冲液(20mM磷酸盐，pH7.4)平衡柱子，上样，收集流出液检测，用10倍体积PBS缓冲液(0.02mol/L磷酸盐，pH7.4)洗涤除去杂蛋白，然后使用0.1M甘氨酸缓冲液(pH3)将目的蛋白从柱上洗脱，以SDS-PAGE检测蛋白纯度在90％以上，获得融合蛋白GA1、GA2、GA3、GA4、GA5、GA6和GA7。

实施例2融合蛋白生物活性测定

1.GLP-1受体功能活性

将处于对数生长期的稳定转染GLP-1受体(GLP-1R)的U₂O_S细胞系(U₂Os/GLP-1R，Thermo-Fisher公司)以1.5×10⁵cells/孔密度接种于24孔板(500μl)，以完全培养基(含10％胎牛血清、500μg/mlG418的高糖DMEM)中培养16小时，换用基础培养基(含0.5％牛血清白蛋白、500μg/mlG418的高糖DMEM)继续培养细胞24小时；将稀释好的不同浓度的本发明样本500μl加入细胞培养板对应孔，置37℃，5％CO₂培养箱孵育15分钟；弃上清，预冷PBS洗涤细胞1次，用150μl细胞裂解液冻融裂解细胞，直接取100μl用于检测cAMP。检测操作步骤参照R&D公司KGE002B说明书进行。

GLP-1及其类似物均能与GLP-1受体结合，并激活G蛋白偶联的腺苷酸环化酶，进而导致细胞内cAMP浓度增加。因此，应用稳定转染GLP-1受体的模式细胞检测GLP-1类似物刺激产生的cAMP量，可直接评价其生物学活性。用本发明、融合蛋白GIA以及单独GLP-1类似物(Dulaglutide，简称“Dul”)在相同浓度处理细胞15分钟，结果显示，融合蛋白GA1～7所刺激产生的cAMP量与单独的GLP-1类似物(Dulaglutide)基本相当，且呈现明显的浓度依赖关系；并且GA1～7刺激cAMP增加的作用均明显高于融合蛋白GIA(见图1)。表明GLP-1类似物融合Amylin类似物不影响其生物活性，与单独的GLP-1类似物(Dulaglutide)相似；但与GIA相比，其生物活性明显增强，提示本发明具有优于融合蛋白GIA的功能活性。

2.修复损伤的胰岛细胞活性

胰岛RIN-5F细胞用完成培养基(含10％胎牛血清的RPMI1640)培养至对数生长期，胰酶消化制成细胞悬液并调整细胞密度为1×10⁵cells/ml，接种细胞于96孔培养板(100μl/孔)，边缘孔加入200μl培养基，37℃、5％CO₂培养24小时。去除细胞培养上清，用基础培养基(含2％胎牛血清的RPMI1640)配制4mM的链脲佐菌素(STZ)，每孔加入100μl继续培养16小时；弃上清，将稀释好的不同浓度的本发明样本100μl加入细胞培养板对应孔，置37℃，5％CO₂培养箱继续孵育24小时；直接用化学发光法检测细胞毒性。检测操作步骤参照Promega公司G9290说明书进行。

链脲佐菌素可产生细胞毒性导致胰岛β细胞损伤，GLP-1及其类似物均能修复SZT致胰岛β细胞的可逆性损伤。因此，应用大鼠胰岛细胞RIN-5F检测GLP-1类似物对STZ致胰岛细胞毒性的抑制作用，可直接评价其生物学活性。用本发明、融合蛋白GIA和单独GLP-1类似物(Dulaglutide)在相同浓度处理细胞24小时，结果显示，本发明GA1～7对STZ刺激RIN-5F细胞的细胞毒性的抑制作用与单独的GLP-1类似物(Dulaglutide)相当，且呈现明显的浓度依赖关系；并且GA1～7的修复作用明显优于GIA(见图2)。表明GLP-1类似物融合Amylin类似物不影响其生物活性，与单独的GLP-1类似物(Dulaglutide)相似；但与GIA相比，其生物活性明显增强，提示本发明优于融合蛋白GIA的功能活性。

3.Amylin受体功能活性

肝癌细胞HepG2表达天然的Amylin受体，将处于对数生长期的HepG2细胞以1.5×10⁵cells/孔密度接种于24孔板(500μl)，以完全培养基(含10％胎牛血清的高糖DMEM)中培养16小时，换用基础培养基(含0.5％牛血清白蛋白的高糖DMEM)继续培养细胞24小时；将稀释好的不同浓度的本发明样本500μl加入细胞培养板对应孔，置37℃，5％CO₂培养箱孵育15分钟；弃上清，预冷PBS洗涤细胞1次，用150μl细胞裂解液冻融裂解细胞，直接取100μl用于检测cAMP。检测操作步骤参照R&D公司KGE002B说明书进行。

Amylin及其类似物均能与Amylin受体结合，并激活G蛋白偶联的腺苷酸环化酶，进而导致细胞内cAMP浓度增加。因此，应用HepG2细胞检测Amylin类似物刺激产生的cAMP量，可直接评价其生物学活性。用本发明、融合蛋白GIA和单独Amylin类似物在相同浓度处理细胞15分钟，结果显示，本发明GA1～7、GIA所刺激产生的cAMP量与单独的Amylin类似物相当，且呈现明显的浓度依赖关系(见图3)。表明Amylin类似物融合GLP-1类似物不影响其生物活性，与单独的Amylin类似物比较，其生物活性基本相似，提示本发明保留了Amylin类似物的良好功能活性。

实施例3对高脂饮食小鼠空腹血糖、甘油三酯以及体重的影响

昆明种小鼠，适应喂养1周后，分为2组:正常对照组(15只，仅喂食普通饲料)，高脂饲料组(130余只，均喂食高脂饲料：普通饲料70％+猪油8％+蛋黄粉10％+奶粉10％)。连续喂食小鼠45天后，剔除体重偏差较大的小鼠，将高脂饲料组小鼠再分为9组：模型对照(高脂饮食)、药物1(高脂+GIA高剂量)、药物2(高脂+GIA低剂量)、药物3(高脂+Dul高剂量)、药物4(高脂+Dul低剂量)、药物5(高脂+GA1高剂量)、药物6(高脂+GA1低剂量)、药物7(高脂+GA3高剂量)、药物8(高脂+GA3低剂量)；喂食普通饲料小鼠设为正常饮食对照，以上各组小鼠均为12只。将本发明样品以及对照样品GIA、Dul分别行尾静脉注射，每周2次，连续注射4周。精确称取每只小鼠体重后实施眶静脉取血，采用常规方法测定空腹小鼠血糖、血胰岛素以及甘油三脂水平。

根据表2结果显示，所测试的几种重组蛋白均能显著降低高脂饮食小鼠空腹血糖、血胰岛素以及甘油三脂，但本发明作用明显优于融合蛋白GIA，也略优于与单独的GLP-1类似物(Dulaglutide)；对高脂饮食小鼠体重影响的结果发现，本发明降低高脂饮食诱导的体重增加尤为明显。以上结果表明本发明具有明显降血糖和改善血脂的作用，同时也提示本发明的良好减肥作用。

表2本发明对高脂饮食小鼠空腹血糖、甘油三酯以及体重的影响(X±S)

“^**”表示与正常对照组比较，P<0.01；

“^△”表示与模型组比较，P<0.05；

“^△△”表示与模型组比较，P<0.01。