改进的全生育期人工病圃棉花品种黄萎病抗性鉴定方法

摘要

发明涉及棉花黄萎病鉴定领域，具体涉及改进的全生育期人工病圃棉花品种黄萎病抗性鉴定方法。包括以下步骤：(1)培养鉴定用病原菌，采用玉米沙粒培养基，将沙子和玉米粉按质量比1：1混匀；(2)建立病圃及接种，病原菌接种方法为种沟接种法；(3)调查棉花黄萎病病情；(4)评价棉花品种抗黄萎病性。根据本发明的方法，病圃发病均匀一直，有益于抗病鉴定结果的准确，病情调查分级标准科学、易掌握，充分反应棉花全生育期的抗病性，结果准确，并且，经济、环保。

说明书

技术领域

本发明涉及棉花黄萎病鉴定领域，具体涉及改进的全生育期人工病圃棉花品种 黄萎病抗性鉴定方法。

背景技术

黄萎病(VerticilliumdahliaeKleb.)是棉花生产中的主要病害。20世纪60年 代以后，随着棉花面积的扩大，引种和调种频繁，棉花黄萎病开始扩展蔓延，而且 日益严重。有效控制黄萎病危害是棉花高产、稳产的关键，种植抗病品种是控制其 危害的最经济有效措施，而选育抗病品种的核心是准确评价品种的抗病性。

棉花品种抗黄萎病性鉴定方法分为苗期鉴定方法和成株期鉴定方法。苗期鉴定 方法虽然快捷，但鉴定过程中进行了人为的伤根，其鉴定结果仅能体现品种的苗期 抗性，与品种的真实抗性存在差异。由于棉花黄萎病是一种成株期病害，发生危害 期为棉花的现蕾初期到收获期，且不同品种对黄萎病的抗性与生育期相关，采用成 株期鉴定能更真实反应棉花品种的抗黄萎病性。目前，成株期鉴定一般采用重病田 或人工病圃，重病田鉴定由于不能控制病原菌的数量、发病不均匀等问题，只能用 于育种材料的初筛，人工病圃成株期鉴定方法是对品种进行把关鉴定最可靠方法， 并于2009年发布实施了国家标准GB/T22101.5-2009。然而，人工病圃成株期鉴定 方法的准确性和稳定性仍亟待提高。

发明内容

本发明的发明人为解决上述技术问题，从接菌量和接种方法、病害分级方法和 结果评价方面改进现有的棉花品种鉴定方法，提出并完成本发明。

在抗病鉴定的过程中，人工病圃成株期鉴定方法存在一些较突出的问题：①建 立人工病圃必要的接种技术不成熟，主要是接菌量不精确(每公顷450kg-750kg)、 接菌方法不科学，大面积撒施菌种，然后翻耕，容易出现菌种分布不均匀的现象， 最终导致发病不均匀；②病害调查的分级标准不科学，病害严重度与产量损失之间 关系不密切，不能反应品种对病害的耐受性和抗病性；③抗病性评价方法不科学， 依据发病高峰期一个点的病情指数评价品种的抗病性，不能体现棉花品种整个生育 期的抗病性。

根据本发明的改进的全生育期人工病圃棉花品种黄萎病抗性鉴定方法，包括以 下步骤：

(1)培养鉴定用病原菌

在超净台上，将分离纯化的棉花黄萎病菌，从马铃薯琼脂培养基(PDA)平板 上的菌落边缘挑取2mm2的新鲜菌块，接种到查比克液体培养基(NaNO₃，2.00g； K₂HPO₄，1.00g；KCI，0.50g；MgSO₄·7H₂O，0.50g；FeSO₄，0.01g；蔗糖30.00g； 用水定容至1000ml)中，置于25℃下，150r/min，黑暗培养6d备用。制作玉米沙 粒培养基，具体为将沙子和玉米粉按质量比1：1混匀，加入质量比12％的水，取300g 装入1000ml的克氏瓶，0.1MPa，高压湿热灭菌30min，冷却到室温备用；吸取上 述液体培养的棉花黄萎病菌菌液15ml转接至装有玉米沙粒培养基的克氏瓶中，随后 放入到25℃培养箱中静置培养7d，待黄萎病菌的菌丝布满后，将培养物掏出，自然 条件下风干备用。

(2)建立病圃及接种

在一定规格的水泥池(水泥池高出地面20cm，内深60cm，无底)内装入多年 (10年以上)未种植棉花的沙土壤；病原菌接种方法为种沟接种法，播种前将病原 菌按每米行长5g接种物的接种量(分生孢子含量为1×10⁸个/g干菌种)均匀地撒 入播种沟内，使病原菌与土壤混合均匀。当年种植感病对照品种，以检测病圃发病 均匀性及发病程度，如果发病不均匀或发病程度不够，应进行混匀措施或补接菌种， 再种植一年感病对照品种，直至感病对照品种发病均匀及发病程度符合要求后方可 用于棉花品种黄萎病抗性鉴定试验。

(3)调查棉花黄萎病病情

棉花黄萎病分级标准为：0级，棉株健康，无病叶，生长正常；1级，棉株三分 之一以下叶片表现病状；2级，棉株三分之一以上，三分之二以下叶片表现病状；3 级，棉株三分之二以上叶片表现病状，未枯死；4级，棉株枯死。

(4)评价棉花品种抗黄萎病性

将整个生育期的不同时期多次黄萎病病情指数进行求病程曲线下面积，然后校 正得到相对病情指数，依据国家棉花品种黄萎病抗性级别划分标准进行棉花品种抗 黄萎病性的评价。

根据本发明的鉴定棉花黄萎病抗性的人工病圃法，在以下四个方面产生有益效 果：

1、接种方法科学，发病均匀一致。现有建立人工病圃接种病原菌一般采用棉籽 培养基或麦粒砂培养基，病原菌培养布满后易结成快，风干后不易粉碎，且棉籽有 短绒存在，风干粉碎后，容易结团，田间接种时不容易撒匀；本发明采用玉米沙粒 培养基，病原菌培养布满后，掏出风干即可，不需要粉碎，易于田间接种。现有建 立人工病圃一般采用撒施翻耕接种方法，即将培养好的菌种按面积撒施，然后翻耕， 但在翻地和耙地过程中，混在表层土壤中的病原菌容易被推移堆积而不均匀；本发 明采用的接种方法为种沟接种法，将病原菌按每米行长5g直接撒施在播种沟内， 与土壤搅拌均匀后即可播种，病原菌在土壤中经过一年的繁殖，随着当年的中耕、 浇水、第二年的翻耕等农事操作，病原菌容易在整个病圃中混匀，病圃发病均匀一 直，有益于抗病鉴定结果的准确。

2、病情调查分级标准科学、易掌握。病害调查分级标准是抗病鉴定的的重要环 节，以往的分级标准仅仅依据病斑面积占植株叶片面积的百分比来划分，没有体现 与植株产量之间的相关性，出现不同级别的病株之间产量差异不显著的或相同级别 病株但产量差异显著的现象，比如0级病株和1级病株之间产量差异不显著，同样 的4级病株中有绝产的死株也有产量略受影响的植株，不能反应棉株对病害的感病 性和抗病性；本发明建立的病害分级标准，是基于不同发病程度对棉株造成的产量 损失不同建立的，不同级别之间的产量差异显著，能充分体现不同发病程度病株对 病害的感病性和抗病性；由于仅将死株定位4级，实际应用中非常易于操作和掌握。

3、充分反应棉花全生育期的抗病性，结果准确。棉花黄萎病是一种成株期病害， 在大田自然发病情况下，病害从现蕾前期到吐絮期均可发病危害，发生期长达100 天，其病害发展曲线呈“驼峰型”，历经棉花的苗期(后期)、蕾期、花期、花铃期、 吐絮期(早期)，几乎覆盖了棉花的整个生育期。以往的研究表明不同棉花品种在不 同生育期对黄萎病的抗性有差异。以往的鉴定方法，一般采用发病高峰期的一次调 查来评价品种的抗病性，也就是用发病进程中的一个点的数据评价品种的抗病性， 不能充分反应棉花整合生育期的抗病性。本发明的方法将全生育期的病程曲线下面 积(AUDPC)换算成相对病情指数，然后评价棉花品种的抗病性，反应了棉花全生育 期的抗性，结果准确可靠，适用于对国家(省)棉花品种区域试验及其他试验的把 关鉴定。

4、经济、环保。本发明建立的人工病圃法，是建立一定规格的水泥池，可以防 止病原菌的传播及对环境的污染；本发明建立的种沟接种法，接种均匀一直，且当 年即可达到鉴定要求，当年可进行鉴定试验；且其接种量仅为原接种方法(撒施翻 耕法)接种量的10％，节省了人力物力。

附图说明

图1显示种沟接种法现场。

图2显示抗病对照和感病对照的发病情况。

图3显示国家棉花品种区试试验中参试品种的发病情况。

具体实施方式

一、前期准备工作

1、鉴定用病原菌的培养方法

在超净台上，将分离纯化的棉花黄萎病菌，从马铃薯琼脂培养基(PDA)平板上 的菌落边缘挑取2mm2的新鲜菌块，接种到查比克液体培养基(NaNO3，2.00g； K2HPO4，1.00g；KCI，0.50g；MgSO4·7H2O，0.50g；FeSO4，0.01g；蔗糖30.00 g；用水定容至1000ml)中，置于25℃下，150r/min，黑暗培养6d备用。制作玉 米沙粒培养基，具体为将沙子和玉米粉按质量比1：1混匀，加入质量比12％的水， 取300g装入1000ml的克氏瓶，0.1MPa，高压湿热灭菌30min，冷却到室温备用； 吸取上述液体培养的棉花黄萎病菌菌液15ml转接至装有玉米沙粒培养基的克氏瓶 中，随后放入到25℃培养箱中静置培养7d，待黄萎病菌的菌丝布满后，将培养物掏 出，自然条件下风干备用。

2、建立人工病圃的建立方法

建立一定规格的水泥池，水泥池高出地面20cm，内深60cm，无底。装入多年 (10年以上)未种植棉花的土壤。病原菌接种方法为种沟接种法，即按每米行长5g 接种物(分生孢子含量为1×10⁸个/g干菌种)，将培养好的棉花黄萎病玉米沙粒培养 物均匀地撒入播种沟，使病菌与土壤混合均匀。当年种植感病对照品种，以检测病 圃发病均匀性及发病程度，正常情况下，采用上述接种方法，当年感病对照即可达 到鉴定要求(病情指数50.0左右)，且发病均匀一致；如发现发病不均匀或发病程度 不够，应进行混匀措施或补接菌种，再种植一年感病对照品种，直至感病对照品种 发病均匀及发病程度符合要求后方可用于棉花品种黄萎病抗性鉴定试验。

3、病圃的维护

每年试验结束，及时将棉秆粉碎后混入土壤中，冬季禁止种植其它作物；试验 过程中如果发现感病对照的发病程度达不到要求，第二年应停止试验，接入适量的 菌种，并种植感病对照品种，直至感病对照品种发病均匀及发病程度符合要求后方 可继续进行棉花品种黄萎病抗性鉴定试验。

4、对照品种的选择

鉴定中选用一个感病对照和一个抗病对照。感病对照要求高度感病，选择标准为 正常年份病情指数能达到50.0左右，且感病性稳定；抗病对照选用已推广应用的抗 黄萎病品种，正常年份病情指数在20.0以下，且抗病性稳定。为减缓抗、感对照的 抗性变异，可将对照品种在无病地隔离繁殖，冷库保存，一次繁殖，供5年以上使 用。

二、鉴定过程

1、试验材料的处理

鉴定的棉花材料应为硫酸脱绒未包衣的种子，发芽率符合标准 (GB/T3543.4-1995)要求。

2、试验材料的种植

鉴定材料按棉花正常的播种时间播种，3次重复，每小区2行、行长不少于5m、 株数不少于50株。

3、田间管理

播种后，进行精心管理，确保一播全苗，应注意苗期病害及全生育期虫害的防治； 保持田间的适宜湿度，以利于黄萎病的发生；注意整枝时不摘除下部叶片，适量使 用缩节胺等生长调节剂；各项田间管理措施均匀一致。

4、病情的调查记载

棉花播种出苗后，实时监测感病对照的发病情况，当感病对照病情指数高于35.0 时，进行第一次全面调查，以后每10d左右调查一次，至8月下旬或末次发病高峰， 整个生育期调查次数不少于3次。感病对照病情指数低于35.0时，鉴定无效。

在病情调查记载中采用5级法表述病情：0级，棉株健康，无病叶，生长正常； 1级，棉株三分之一以下叶片表现病状；2级，棉株三分之一以上，三分之二以下叶 片表现病状；3级，棉株三分之二以上叶片表现病状，未枯死；4级，棉株枯死。

三、结果计算方法

1、病株率和病情指数

病株率和病情指数按下面的公式进行计算：病株率＝发病株数/总株数×100％； 病情指数＝∑(相应病级×相应病级病株数)/(总株数×4)×100。

2、病程曲线下面积

以每次调查的病情指数为纵坐标轴，调查时间距播种时间的天数为横坐标轴作曲 线图，求出各品种及感病对照和抗病对照的病程曲线下面积AUDPC值，AUDPC值 的求法按以下公式计算。

AUDPC＝(DI1+DI2)×(T2-T1)/2+(DI2+DI3)×(T3-T2)/2+(DI3+DI4)× (T4-T3)/2……

式中:

AUDPC—被鉴定品种的病程曲线下面积；

DI1—第1次调查被鉴定品种的病情指数；

DI2—第2次调查被鉴定品种的病情指数；

DI3—第3次调查被鉴定品种的病情指数；

DI4—第4次调查被鉴定品种的病情指数；

T1—第1次调查时间距播种时间的天数；

T2—第2次调查时间距播种时间的天数；

T3—第3次调查时间距播种时间的天数；

T4—第4次调查时间距播种时间的天数；

3、校正系数

为了将病程曲线下面积转换为相对病情指数，需要将病程曲线下面积进行校正。 首先将感病对照的相对病情指数界定为50.0，然后，计算校正系数K值，K值的求 法按以下公式计算：

$K=\frac{50.00}{{\mathrm{AUDPC}}_{SCK}}$

式中:

K—校正系数；

50.00—感病对照相对病情指数；

AUDPC_SCK—本次鉴定感病对照病程曲线下面积。

4、相对病情指数

用K值与鉴定中被鉴定品种的病程曲线下面积相乘，求得被鉴定品种的相对病 情指数(RDI),RDI按公式(5)计算：

RDI＝AUDPC×K

式中:

RDI—被鉴定品种相对病情指数；

AUDPC—被鉴定品种的病程曲线下面积；

K—校正系数。。

四、棉花品种黄萎病抗性评价方法

根据被鉴定品种的相对病情指数均值(RDI)的大小评定品种的抗性级别，抗性 级别的划分标准见下表。

表1.棉花品种抗性级别的划分标准

实施例1棉花黄萎病种沟接种法和面积接种法的比较试验以及接种量比较试验

(一)棉花黄萎病种沟接种法和面积接种法的比较试验

2014年，以感病品种冀棉11和抗病品种中植棉2号为供试品种，进行了棉花黄 萎病种沟接种法和面积接种法的比较试验(表2)。试验结果表明，采用种沟接种法 试验数据重复性更好，5次重复的标准差仅为1.7(冀棉11)和0.8(中植棉2号)， 而采用面积接种法的标准差为7.1(冀棉11)和4.7(中植棉2号)。

(二)接种量比较试验

2014年，以感病品种冀棉11为供试品种，进行了种沟接种法不同接菌量试验(表 3)。结果发现，接种量为5g/m时，5次调查结果中冀棉11黄萎病发生最重，并且达 到鉴定要求(感病对照病情指数达到50左右)。

表2不同接种方法黄萎病发生情况(病情指数)

注：病情指数后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著水平(LSD，P＜0.05)

表3不同接菌量黄萎病发生情况(病情指数)

注：病情指数和防治效果后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著水平(LSD，P＜0.05)

实施例2棉花黄萎病调查分级标准的依据

2014年采用本发明中的分级标准和棉花抗病虫性评价技术规范(GB/T22101.5 —2009)中采用的标准，对鲁棉研21和中棉所63进行了黄萎病不同级别单株产量 影响研究(表4)。结果发现，本发明采用的分级标准不同级别病株单株产量差异均 达到显著性差异，而采用棉花抗病虫性评价技术规范中采用的标准，不同级别病株 单株产量间未全部达到差异显著。因此，使用本发明中的分级标准能充分体现不同 级别的病株对病害的耐受性和抗病性。

表4黄萎病不同级别棉花单株籽棉产量(g)

注：标准1，本发明中的病害调查分级标准标准；标准2，棉花抗病虫性评价技术规范(GB/T 22101.5—2009)中的病害调查分级标准。产量后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著 水平(LSD，P＜0.05)。

实施例3采用本发明方法对棉花品种的鉴定结果

2014年和2015年按照本发明方法对2014年国家主推品种进行了抗黄萎病鉴定， 鉴定结果如表5。根据结果可以发现，采用本发明的方法2年结果的RDI值的相关 系数达到0.99，而采用发病高峰期的相对病指2年间的相关系数为0.91。同时，采 用本发明方法时，供试品种的抗性级别完全一致；而采用发病高峰期相对病指时，2 年结果中有8个品种的抗性级别不一样。因此，使用本发明方法进行棉花品种的抗 黄萎病鉴定，结果更稳定和准确。

表52014年和2015年国家棉花主推品种抗黄萎病性评价结果