具有主动-被动双重靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物及其制备和应用

摘要

本发明提供了一种具有主动-被动双重靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物，是将功能化的二硫单体、修饰的叶酸通过RAFT聚合方式连接到N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺上形成的一种生物相容良好的高分子嵌段共聚物——甲基丙烯酰-SS-三甲氧基苯甲酸-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-叶酸共聚物。本发明的嵌段共聚物可在水中自组装形成核壳结构的胶束载体，并在癌细胞内高还原的环境下二硫键发生断裂，使得胶束结构被破坏，从而释放出阿霉素（DOX），进一步地杀死癌细胞；高分子载体PHPMA使共聚物体现出良好的生物相溶性，进一步降低了抗癌药物的毒性，减少对正常组织的伤害，因此在制备抗肿瘤药物中具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有主动-被动双重靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物及其制备方法；本发明同时还涉及该两亲性嵌段共聚物的制备和作为药物载体在制备抗肿瘤药中的应用，属于高分子化学领域和生物医药应用技术领域。

背景技术

癌症已经成为人类健康的主要威胁之一，且呈明显上升趋势。现今治疗癌症的主要方法包括放疗、化疗、手术疗法和基因疗法。其中放疗和化疗是极其重要的非手术疗法，但是放疗和化疗在杀死肿瘤细胞的同时也对机体正常细胞产生严重损伤。

N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）是一种是具有良好的生物相容性的药物载体，不仅能够降低药物的毒副作用，减少抗药性，提高药物在体内的稳定性，同时增加药物在肿瘤部位的富集，使药效得到更好的发挥等特点，被作为肿瘤靶向药物载体已应用于临床。HPMA的其结构式如下：

。

叶酸（FA）是一种天然物质，叶酸是一种很重要的能靶向到特定的细胞膜并通过该细胞膜表面的叶酸受体使得胶束纳米微粒内吞进入细胞溶酶体。叶酸修饰的纳米载药系统主要是将药物输送到肿瘤细胞，如宫颈癌、子宫内膜、直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾细胞癌、脑转移上皮癌和神经内分泌癌。此外，叶酸价格低、容易与载体偶联、容易生产和储存。因此，叶酸是应用较为广泛的靶向分子在抗肿瘤方面，其结构是如下：

。

二硫单体——双（2-羟基乙基）二硫醚是一种重要的医药中间体，具有优异释放性并且使药物能够长期有效滞留在体内的物质。当该释放物质全身或局部给药时，该物质长期滞留在机体中的靶部位，由此通过1次给药使药物效力长时间持续成为可能。

因此，将水溶性好的聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺与功能化的双（2-羟基乙基）二硫醚和功能化叶酸通过一定的方式形成共聚物，使其抗肿瘤活性进行叠加，以促进聚合物对肿瘤的抑制作用，同时体现出良好的生物相溶性，以减少对正常组织的伤害，有望为抗癌领域提供了更多的选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有主动-被动双重靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物。

本发明的另一目的是提供一种制备上述具有主动-被动双重靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的方法；

本发明还有一个更重要的目的，就是提供上述具有主动-被动双重靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物作为抗肿瘤药物载体的应用。

一、具有主动-被动靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的结构

本发明具有主动-被动双重靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物，是将功能化的二硫单体、修饰的叶酸通过RAFT聚合方式连接到N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）上形成的一种生物相容良好的高分子嵌段共聚物——甲基丙烯酰-SS-三甲氧基苯甲酸-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-叶酸共聚物，其结构如下：

式中，m=52~54mol%，n=13~15mol%，o=6~8mol%；数均分子量Mn=1.5×10⁴~1.6×10⁴，Mw/Mn=1.14~1.16。

由于上述嵌段共聚物中存在二硫键，使得其负载药物到达肿瘤靶向部位之后释放出小分子抗肿瘤药物，不仅降低了药物毒性，还能在肿瘤细胞内智能释放抗癌药物；共聚物中的经修饰的靶向分子叶酸，使得药物能够更好地识别肿瘤细胞；高分子载体HPMA的存在，使共聚物体现出良好的生物相溶性，从而减少了对正常组织的伤害，所以在制备抗肿瘤药物方面具有很好的应用前景。

（二）具有主动-被动靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的制备

本发明具有主动被动靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的制备，由以下工艺步骤完成。

（1）中间体化合物的制备

以二氯甲烷为溶剂，三乙胺作为缚酸剂，甲基丙烯酰氯与双（2-羟基乙基）二硫醚为反应底物，于0~5℃反应20~24小时；反应结束后，用pH等于8.0的磷酸缓冲溶液洗涤反应液，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离纯化，得无色油状液体为中间体化合物，记为化合物；化合物的结构式为：

甲基丙烯酰氯与双（2-羟基乙基）二硫醚的摩尔比为1:1.9~1:2.0；三乙胺与双（2-羟基乙基）二硫醚的摩尔比为2.0:1~2.1:1。

（2）功能化的二硫单体的制备

以二氯甲烷为溶剂，4-二甲基氨基吡啶和N,N-二环己基碳二亚胺为催化剂，使化合物与3,4,5-三甲氧基苯甲酸于0~5℃反应20~24小时；过滤除去固体产物后，滤液用乙酸乙酯与石油醚的混合溶剂进行柱色谱分离，得到白色固体，即为功能化二硫单体，记为化合物；化合物的结构式为：

化合物与3,4,5-三甲氧基苯甲酸的摩尔比为1:1.5~1:2.0；催化剂N,N-二环己基碳二亚胺与化合物的摩尔比为2.2:1~2.5:1；催化剂4-二甲基氨基吡啶与化合物的摩尔比为1:0.9~1:1.1；混合溶剂中，乙酸乙酯与石油醚的体积比为1:6~1:8。

（3）功能化叶酸的制备：将叶酸充分溶于二甲基亚砜中，加入活化剂二环己基碳二亚胺，于50℃~60℃活化5~6h；冷却至室温，加入催化剂4-二甲氨基吡啶及底物烯丙基胺，在室温反应20~24小时，过滤，滤液用乙酸乙酯沉淀，干燥得黄色固体即得功能化叶酸，记为化合物；化合物的结构式为：

叶酸与烯丙基胺的摩尔比为1:2~1:2.5；叶酸与活化剂二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.0~1:1.5；催化剂4-二甲氨基吡啶与叶酸的摩尔比为2:1~2.5:1。

（4）功能化的二硫单体的接枝聚合：以二甲基亚砜为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，在RAFT试剂作用，55~65℃下，化合物自身聚合20~24小时；加入N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）的DMSO溶液，继续反应20~24小时，用乙酸乙酯沉淀，干燥，得白色功能化的二硫单体的接枝聚合物，记为化合物；化合物的结构式为：

所述RAFT试剂为2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸，其结构式为：

RAFT试剂与化合物的摩尔比为1:15~1:20；引发剂偶氮二异丁腈的用量为反应物质量总和的5%~20%；N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）与化合物的摩尔比为3:1~5:1。

（5）目标化合物的制备：以二甲基亚砜为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，化合物与化合物在55~65℃下聚合反应20~24小时，反应液用乙酸乙酯沉淀，干燥，得黄色聚合物即为目标化合物，记为化合物；化合物与化合物的摩尔比为10:1~20:1；引发剂偶氮二异丁腈的用量为反应物质量总和的5%~20%。化合物的结构式为：

式中：m=52~54mol%，n=13~15mol%，o=6~8mol%；数均分子量Mn=1.5×10⁴~1.6×10⁴，Mw/Mn=1.14~1.16。

图1为上述方法制备的具有主动-被动双重靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的核磁共振氢谱。通过核磁共振氢谱分析可以得出，化学位移在7.18ppm为三甲氧基苯甲酸苯环上的H，化学位移在3.70ppm和2.94ppm左右会出现HPMA上的特征峰-CH-（和-OH相连）和-CH₂（和-NH-相连)，化学位移在6.62ppm、7.64ppm和8.64ppm为叶酸上的苯环上的两个H和杂环上的一个H。核磁共振氢谱说明用上述方法制备的共聚产物与设计的共聚物结构一致，表明成功合成了该共聚物。

二、抗肿瘤活性实验

1、胶束的制备以及表征

（1）制备共聚物胶束

将本发明制备的两亲性聚合物（化合物）充分溶于N,N′-二甲基甲酰胺中，缓慢滴加去离子水，溶液出现蓝色乳光形成胶束溶液；然后将胶束溶液装入透析袋（MWCO=3000）置于去离子水中透析45~50h，取出胶束溶液，用去离子水调节胶束溶液的浓度至0.8~1.2mg/mL，即得共聚物胶束。

（2）载药聚合物胶束制备

将本发明制备的两亲性聚合物和阿霉素解于DMF中，搅拌2~5小时，然后在室温滴加去离子水，继续搅拌10~12h，然后在去离子水中透析20~24小时，得到载药胶束溶液。两亲性聚合物和阿霉素质量比为2.5:1~3.0:1；两亲性聚合物与去离子的质量体积比为0.8~1.2mg/mL。

（3）胶束的表征

首先，用荧光探针技术测定临界胶束浓度CMC，当胶束浓度高于CMC时，溶液中开始形成胶束，疏水性芘荧光探针就会进入胶束疏水内核而且分散于其中，此时荧光光谱就会发生突变，通过这个突变点就可以确定CMC值为0.52mg/L（聚合物）、0.64mg/L（聚合物），符合变化范围。此外，用纳米粒径仪对上述制备的聚合物载药胶束的粒径及粒径分布进行检测，粒径大约127nm左右（见图2）；采用透射电镜TEM（见图3）观察了胶束的形貌为纳米级的小球。

2、体外抑制肿瘤细胞生长实验

阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效。本实验选用了宫颈癌细胞进行了实验。

采用四氮唑盐还原法（MTT）对Hela细胞株进行试验：取处于生长对数期的宫颈癌Hela细胞，将细胞浓度调为2×10⁴个／ml，在96孔培养板中加入90μl/孔，边缘孔用无菌PBS填充。在5%CO₂，37℃孵育，培养箱中放置待贴壁后再加药。对于本发明高分子聚合物载阿霉素无叶酸胶束、载阿霉素有叶酸胶束和游离阿霉素，均分别设定浓度为0.01、0.1、0.5、1、10、20μg/mL6个梯度。实验组与对照组均设4个复孔，加药后细胞在温度37℃二氧化碳培养箱内继续分别培养24h后，取出先离心，后弃去96孔板内的上清培养液，小心用PBS冲洗2~3遍后，每孔加人20μLMTT（四氮唑，5mg/mL，即0.5%MTT）溶液，置于37℃二氧化碳培养箱内继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL的DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm测定各孔的吸光OD值。细胞生长抑制率按以下公式计算：

抑制率=[(1－实验组平均OD值)/对照组平均OD值]×100％

测试结果见表1：

3、体外模拟的水解、释放实验

（1）通过紫外分光光度计测定了3,4,5-三甲氧基苯甲酸282nm处的吸光度计算其降解率。取两份5mL聚合物胶束，分别置于250mL的pH7.4（100mM）与含有10mmolDTT的pH7.4（100mM）的缓冲溶液中，透析24小时，按照一定的时间间隔取样，测紫外吸收，并与最终滴加了30mmolDTT时的吸光度进行比较，所得三甲氧基苯甲酸的降解率分别为12%和90.4%（见图4），说明了在10mmolDTT的还原环境下，降解的效果更好。

（2）通过紫外分光光度计测定阿霉素在480nm处的吸光强度计算载药胶束的药物释放率。取两份3mL载药聚合物胶束，分别置于100mL的pH7.4（100mM）与含有10mmolDTT的pH7.4（100mM）的缓冲溶液中，透析24小时，按照一定的时间间隔取样，测紫外吸收，并与聚合物中包载的阿霉素进行比较，最终释放率分别为15.6%和88.1%（见图5），说明了在10mmolDTT的还原环境下会更好的释放出阿霉素。

综上所述，本发明的嵌段共聚物可在水中自组装形成核壳结构的胶束载体，并在癌细胞内高还原的环境下二硫键发生断裂，使得胶束结构被破坏，从而释放出阿霉素（DOX），进一步地杀死癌细胞；高分子载体PHPMA使共聚物体现出良好的生物相溶性，进一步降低了抗癌药物的毒性，减少对正常组织的伤害，因此，该共聚物胶束作为药物载体具有很好的释放效果，体现出了良好的生物水溶性，毒性低，对正常组织的伤害少，是一种具有应用前景的抗肿瘤活性物质。

附图说明

图1为本发明制备的具有主动被动靶向抗肿瘤活性的两亲性嵌段共聚物的核磁共振氢谱。

图2为本发明胶束载体的粒径分布图。

图3为本发明胶束载体的的透射电镜图。

图4为本发明载药胶束在pH=7.4和pH=7.4，10mmolDTT时降解曲线。

图5为本发明载药胶束在pH=7.4和pH=7.4，10mmolDTT时阿霉素释放的体外模拟曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明高分子共聚物的合成及结构表征作进一步的说明。

实施例1

（1）中间体化合物（化合物）的制备：称取3.08g双（2-羟基乙基）二硫醚溶于30mL二氯甲烷中，加入4g三乙胺作为缚酸剂，在冰浴下用恒压漏斗缓慢的滴入1.08g甲基丙烯酰氯，反应24小时，反应液用pH等于8.0的磷酸缓冲溶液洗涤三次，用无水硫酸钠干燥，再用硅胶柱层析分离技术纯化，得到1.7g的无色油状液体为化合物，产率为74%。

¹HNMR(400MHz,CDCl₃,δ,ppm):6.13(s,1H,CHH=C(CH₃)CO-),5.59(s,1H,CHH=C(CH₃)CO-),2.96(t,J=6.7Hz,2H,-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂OH),2.87(t,J=5.8Hz,2H,-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂OH),1.93(s,3H,-CH₃).¹³CNMR(100MHZ,CDCl₃,ppm):δ167.63,136.38,126.48,63.03,60.65,42.05,37.46,18.62。

（2）功能化的二硫单体（化合物）的制备：0.5g化合物，0.95g3,4,5-三甲氧基苯甲酸和0.273g4-二甲基氨基吡啶溶解在30mL二氯甲烷后置于冰浴中，后加入0.924gN,N-二环己基碳二亚胺，反应24小时，过滤除去固体产物后，粗产物用混合溶剂进行柱色谱分离，得到0.88g纯净的白色固体，即为化合物，产率为93.6%。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,δ,ppm):3.13(t,J=6.3Hz,2H,-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂COOC₆H₂(OCH₃)₃),3.04(t,J=6.4Hz,2H,-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂COOC₆H₂(OCH₃)₃),1.86(s,3H,-CH₃),3.73-3.82(s,9H,Ar-OCH₃),7.25(s,2H,Ar-CH).¹³CNMR(100MHZ,DMSO-d6,ppm):δ166.27,152.71,141.92,135.59,124.48,105.59,62.12,60.11,36.47,17.83。

（3）功能化叶酸（化合物）的制备：将0.5g叶酸溶于15mL的二甲基亚砜中，加入0.233g二环己基碳二亚胺活化叶酸24小时，再加入0.276g催化剂4-二甲氨基吡啶和0.129g烯丙基胺，室温反应24小时，反应液过滤，滤液用乙酸乙酯沉淀三次，干燥得0.38g黄色固体，产率为70%。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.61(s,1H,叶酸–CH–),7.61(d,J=8.6Hz,2H,–CH₂NHC₆H₂H₂CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO–),6.63(d,J=8.6Hz,2H,–CH₂NHC₆H₂H₂CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO–),5.87(m,1H,–NHCH₂CH=CH₂),5.28(dd,J=27.0,14.0Hz,2H,–NHCH₂CH=CH₂),4.46(s,2H,–CH₂NHC₆H₄CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO–),4.19(t,J=7.3Hz,1H,–CH₂NHC₆H₄CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO–),3.41(d,J=7.0Hz,2H,–NHCH₂CH=CH₂),2.23(t,J=7.4Hz,2H,–CH₂NHC₆H₄CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO–),1.92(m,2H,–CH₂NHC₆H₄CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO–)。

（4）功能化的二硫单体的接枝聚合（化合物的制备）：取0.1g化合物溶于1mL的二甲基亚砜中，加入21mg引发剂AIBN（偶氮二异丁腈）和5mgRAFT试剂，在55℃下化合物自身聚和24小时，用针管加入0.15gN-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）的DMSO溶液并补加10mgAIBN，继续在同一温度下反应24小时，用乙酸乙酯沉淀三次，干燥得白色共聚物；产率73%。

¹HNMR(600MHz,DMSO-d6,δ,ppm):4.34(-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂COOC₆H₂(OCH₃)₃),4.14(-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂COOC₆H₂(OCH₃)₃),3.03(-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂COOC₆H₂(OCH₃)₃),2.91(CH₃CH(OH)CH₂NH-ofHPMAand-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂COOC₆H₂(OCH₃)₃),3.69-3.78(CH₃CH(OH)CH₂NH-ofHPMAandAr-OCH₃),7.18(CH₃CH(OH)CH₂NH-ofHPMAandAr-CH),1.40-2.08(-CH₂-ofpolymerbackbone),0.61–1.24(-CH₃).Mn:1.35×10⁴g/mol,m=54。

（5）目标化合物（化合物）的制备：将0.1g（0.1mmol）化合物与32mg化合物加入到Shleck瓶中，再加入1.5mL二甲基亚砜中，加入15mg（10%，wt）引发剂偶氮而异丁腈（AIBN），来回抽真空充氮气循环3~5次，用封口膜密封后保持温度大约在70℃左右RAFT聚合24小时，反应液用乙酸乙酯沉淀三次除去没反应的小分子物质，过滤干燥得0.105g黄色聚合物，产率为71.7%。

¹HNMR(600MHz,DMSO-d6,δ,ppm):8.64(-CH-ofFAheterocyclic),7.64(-CH₂NHC₆H₂H₂CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO-ofFA),7.18(CH₃CH(OH)CH₂NH-ofHPMAandAr-CH),6.62(-CH₂NHC₆H₂H₂CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO-ofFA),4.52(-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂COOC₆H₂(OCH₃)₃),4.48(-CH₂NHC₆H₄CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO-ofFA),4.32(-CH₂NHC₆H₄CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO-ofFA),4.14(-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂COOC₆H₂(OCH₃)₃),3.16(-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂COOC₆H₂(OCH₃)₃),2.94(CH₃CH(OH)CH₂NH-ofHPMAand-COOCH₂CH₂SSCH₂CH₂COOC₆H₂(OCH₃)₃),2.29(-CH₂NHC₆H₄CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO-ofFA),2.08(-CH₂NHC₆H₄CONHCH(COOH)CH₂CH₂CO-ofFA),and1.40-2.08(-CH₂-ofpolymerbackbone),0.61–1.24(-CH₃),3.69-3.78(CH₃CH(OH)CH₂NH-ofHPMAandAr-OCH₃)。

实施例2

（1）化合物、化合物、化合物的制备：同实施例1。

（2）化合物的制备：取0.1g化合物溶于1mL的二甲基亚砜中，加入21mg引发剂AIBN（偶氮二异丁腈）和5mgRAFT试剂，在55℃下化合物自身聚和24小时，用针管加入0.15gN-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）的DMSO溶液并补加10mgAIBN，继续在同一温度下反应24小时，用乙酸乙酯沉淀三次，干燥得白色固体，产率为75%。

（2）目标化合物的制备：将0.1g（0.1mmol）化合物与40mg化合物加入到Shleck瓶中，再加入1.5mL二甲基亚砜中，加入15mg（10%，wt）引发剂偶氮而异丁腈（AIBN），来回抽真空充氮气循环3~5次，用封口膜密封后保持温度大约在70℃左右RAFT聚合24小时，反应液用乙酸乙酯沉淀三次除去没反应的小分子物质，过滤干燥得0.12g黄色聚合物，产率为73.3%。

实施例3

（1）化合物、化合物、化合物的制备：同实施例1。

（2）化合物的制备：取0.1g化合物溶于1mL的二甲基亚砜中，加入21mg引发剂AIBN（偶氮二异丁腈）和5mgRAFT试剂，在55℃下化合物2自身聚和24小时，用针管加入0.13gN-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）的DMSO溶液并补加10mgAIBN，继续在同一温度下反应24小时，用乙酸乙酯沉淀三次，得白色固体，产率为73.4%。

（3）目标化合物的制备：将0.1g（0.1mmol）化合物与32mg化合物加入到Shleck瓶中，再加入1.5mL二甲基亚砜中，加入15mg（10%，wt）引发剂偶氮而异丁腈（AIBN），来回抽真空充氮气循环3~5次，用封口膜密封后保持温度大约在70℃左右进行RAFT聚合24小时，反应液用乙酸乙酯沉淀三次除去没反应的小分子物质，过滤干燥，得0.1g黄色聚合物，产率为70%。