同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用

摘要

本发明属于禽类病毒检测技术领域，本发明公开了一种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP引物组、试剂盒及其应用。发明人基于GeXP系统研究设计了5对特异性引物和1对通用引物，据此建立了同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP快速检测试剂盒。应用本发明可同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒，灵敏度为102拷贝/μL。本发明具有高通量、特异性强、灵敏度高且快速等优点，对H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的流行病学调查及其鉴别诊断具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时鉴别H5N1和 H9N2亚型禽流感病毒的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)亚型众多，变异频繁，现已发 现16种不同的血凝素亚型(HA)和9种不同的神经氨酸酶亚型(NA)。根 据致病力不同，禽流感可分为高致病性和低致病性，能引起高致病性禽流感 发生的主要是H5、H7亚型AIV。1996年，中国广东的一家鹅场首次爆发 H5N1HPAI疫情，此后该病毒在东南亚地区家禽中呈地方流行性，目前H5N1 AIV已蔓延到全世界范围内的60多个国家，每一次爆发都可导致大规模的家 禽死亡或淘汰，给养禽业带来毁灭性的打击。H9N2亚型LPAI一般引起温 和的临床症状，以咳嗽、喷嚏、啰音和喘鸣等呼吸道症状最为常见。目前， 大规模的集约化养禽场中H9N2亚型AIV引起的经济损失十分为严重。研究 表明目前家禽体内以H5N1、H9N2为主要流行亚型。虽然政府已经实施了通 过疫苗强制性免疫来控制H5N1和H9N2禽流感病毒，但是由于家禽数量庞大， 不可能对每一只家禽都能够进行很好的免疫接种，加之禽流感病毒本身抗原 变异快，所以H5N1和H9N2禽流感病毒仍然能够在各种禽类中流行并发生抗 原漂移。多位学者的研究证实H5N1和H9N2禽流感病毒目前在鸡群中广为流 行，严重制约了家禽业的健康发展。此外，自从1997年香港发生高致病性 H5N1流感病毒感染人以来，H5N1病毒己多次造成感染人的病例。H9N2亚 型禽流感病毒也是感染禽和人最多的禽流感病毒亚型之一。因此，H5N1和 H9N2禽流感病毒还严重威胁人类生命的健康。H5和H9亚型禽流感病毒可以 感染不同日龄的鸡群，具有较高的发病率和死亡率，其感染后鸡群发病的临 床症状十分相似且部分毒株还能够感染人类。此外，鉴于禽流感病毒可以通 过空气飞沫等方式传播，具有发病急和传播速度快等特点，因此建立能迅速、 有效的鉴别鸡场主要流行的H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的检测方法不仅对 禽流感防制具有重要意义，同时对H5N1和H9N2亚型AIV的监测及保障人 类生命健康具有十分重要的意义。

目前，禽流感病毒实验室检测技术主要包括病毒的分离及培养、血清学 试验、分子生物学实验和免疫荧光等方法，且病毒的分离与培养是诊断禽流 感病毒感染的“金标准”。由于禽流感亚型众多且新的变异株不断出现，使 用上述检测方法对其进行分型和诊断不仅存在着操作方法复杂，而且检测周 期长及容易受抗体等因素影响使得检测结果不能准确和及时。虽然多重PCR 有着能同时扩增出多个目的因片段进而实现多种病原体的快速诊断并降低检 验成本的优点，但是普通多重PCR在扩增的过程中容易受到目的基因模板的 特性、引物浓度和比例及PCR所用的试剂之间的相互作用等的影响，进而导 致样品扩增效率不一致使得检测结果的准确性大大降低。GeXP多基因遗传表 达分析系统的多重逆转录聚合酶链反应(Multiplexreverse transcription-polymerasechainreaction,mRT-PCR)是由通用引物(上游加荧光 标记)和特异性嵌合引物(基因特异性引物5'末端连接通用引物序列)相结 合建立多重逆转录聚合酶链反应体系，采用通用引物引发的策略，可以克服 普通多重PCR存在的扩增效率不一的问题。此外，该方法利用毛细管电泳进 行产物的分离，大大提高了检测结果的灵敏度和可靠性。

目前，检测H5和H9亚型禽流感病毒的核酸检测方法至多是针对不同的 HA亚型，而一个反应同时扩增H5、N2、N1、H9和M五个基因来检测和鉴 别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的核酸检测技术尚未见有报道。本研究建立 的GeXP多重PCR技术能够在四个小时内通过一个PCR反应对禽流感病毒的 H5N1和H9N2亚型进行检测和分型，达到可以快速诊断和鉴别H5N1和H9N2 亚型禽流感病毒的目的，对H5N1和H9N2禽流感流行病学调查及其防控，保 障人类公共卫生的安全和健康持续发展具有重要意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理 解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术 人员所公知的现有技术。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明建立的GeXP多重PCR技术能够同时 对H5N1和H9N2亚型禽流感病毒进行检测和分型，达到可以快速诊断和鉴别 H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的目的，对H5N1和H9N2禽流感流行病学调 查及其防控，保障人类公共卫生的安全和健康持续发展具有重要意义。

本发明要解决的技术问题是提供一种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感 病毒的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP引物组，包括5 对特异性引物，分别是引物对M-1和M-2、引物对AIV-H5-1和AIV-H5-2、 引物对AIV-H9-1和AIV-H9-2、引物对AIV-N1-1和AIV-N1-2、引物对AIV-N2-1 和AIV-N2-2，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.10所示的序列。

作为优选，所述的同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP引物 组还包括1对通用引物，上游通用引物为Cy5-Tag-F，下游通用引物为Tag-R， 分别具有如SEQIDNo.11至SEQIDNo.12所示的序列。

一种同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP试剂盒，包括反转 录RT反应液、PCR反应液、DEPC水和超纯水；所述的反转录RT反应液含 有5×ReverseTranscriptaseBuffer、50pmolRandomPrimer(12mer)、10mMdNTP Mixture、40URibonucleaseInhibitor和5U/μLAMVReverseTranscriptase；所 述的PCR反应液含有10×PCRbuffer、25mMMgCl₂、10mMdNTPMixture，5 对特异性引物混合物，10μM/L上、下游通用引物混合物，JumpStartTaqDNA Polymerase；所述的5对特异性引物分别是引物对M-1和M-2、引物对 AIV-H5-1和AIV-H5-2、引物对AIV-H9-1和AIV-H9-2、引物对AIV-N1-1和 AIV-N1-2、引物对AIV-N2-1和AIV-N2-2；1对通用引物分别为Cy5-Tag-F和 Tag-R，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.12所示的序列。

作为优选，所述的5对特异性引物中引物对M-1和M-2、引物对AIV-H5-1 和AIV-H5-2、引物对AIV-H9-1和AIV-H9-2、引物对AIV-N1-1和AIV-N1-2、 引物对AIV-N2-1和AIV-N2-2在PCR反应体系中对应的的摩尔浓度分别为 100nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、50nmol/L、100nmol/L；所述的1对通 用引物Cy5-Tag-F和Tag-R在PCR反应体系中的摩尔浓度为500nmol/L。

作为优选，所述的反转录RT反应液每管9μL，含有5×ReverseTranscriptase Buffer5μL、50pmolRandomPrimer(12mer)1μL、10mMdNTPMixture2μL、 40URibonucleaseInhibitor0.5μL和5U/μLAMVReverseTranscriptase0.5μL； 所述的PCR反应液每管9.7μL，含有10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl₂2.5μL，10mMdNTPMixture2μL，5对特异性引物混合物1.25μL，10μM/L上、 下游通用引物混合物1.25μL，JumpStartTaqDNAPolymerase1.2μL；所述的 DEPC水和超纯水各1mL。

本发明还提供了所述的同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP 引物组或所述的同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP试剂盒在鉴 别H5N1、H9N2亚型禽流感病毒中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明利用GenomeLab(tm)GeXP遗传分析系统建立了一种能同时 检测H5、N2、N1、H9和M5个基因的禽流感病毒多重逆转录－聚合酶链反 应(mRT-PCR)方法。首先对反应条件和多重反应体系进行优化，然后分别 用已验证的阳性模板对多重PCR体系进行特异性验证。多重检测体系可以同 时检测出H5N1和H9N2亚型禽流感病毒，灵敏度为10²拷贝/μL。该方法具 有高通量、特异性强、灵敏度高且快速等优点，对H5N1和H9N2亚型禽流感 病毒的流行病学调查及其鉴别诊断具有重要意义。

2.本发明建立的GeXP多重PCR技术能够同时对H5N1和H9N2亚型禽 流感病毒的进行检测和分型，达到快速鉴别目前对养禽业危害最大的H5N1 和H9N2禽流感病毒的目的，对H5N1和H9N2亚型禽流感的流行病学调查及 其防控，保障养禽业的健康持续发展具有重要意义。

附图说明

图1为GeXP多重PCR的毛细管电泳分析图；

图2为对临床单一感染H9N2亚型禽流感病毒的检测结果；

图3为对临床单一感染H5N1亚型禽流感病毒的检测结果；

有关附图标记的说明：

横坐标-PCR扩增产物的碱基数；纵坐标-荧光信号值。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施 方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用 于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可 以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限 定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实 施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施 例中所使用的禽流感毒株及其他禽类病毒参考株均由广西壮族自治区兽医研 究所保存。

实施例1：禽流感病毒多重RT-PCR引物设计

参考相关文献从GenBank数据库中下载禽流感病毒M、H5、H9、N1和 N25个基因的序列，利用DNAStar分别对各个基因核苷酸序列进行分析和比 较，寻找出适合设计特异性引物的保守区域，利用GeXPexpressprofiler工具 设计针对禽流感病毒5个基因的特异性引物(见表1)，设计好的引物采用 PrimerPremier5.0、NCBIPrimerBlast和Oligo7.0进行分析和筛选，然后在全 部正向引物和反向引物的5'端分别加入一段非同源性独特序列作为通用引物 (Uni-Primer)，上游通用引物5'端标记荧光染料Cy5，即Cy5-Tag-F，由上海 Invitrogen公司合成，HPLC纯化。

表1引物信息

表1中，兼并碱基代码R＝A/G，D＝A/G/T,Y＝C/T，下划线表示的是上、 下游通用引物序列；荧光染料Cy5标记上游通用引物标签,下游引物不标记。 根据实际检测的病原体的毒株不同以及GeXP系统(如GenomeLabTMGeXP GeneticAnalysisSystem毛细管电泳仪)的误差，使用上述引物对A-F及GeXP 通用引物对检测获得的实际扩增产物长度可在预计扩增产物的长度基础上上 下波动3bp。

实施例2：多重PCR检测体系的建立

2.1模板及含靶基因的单克隆质粒标准品的制备

按照TaKaRa公司MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0(目录 号DV819A)说明书从提取不同亚型(H1-16和N1-9)禽流感病毒和其他禽 类病毒的核酸，获得50μL的核酸样品，分装置于-80℃保存。RT反应体系参 照TaKaRa公司逆转录酶(目录编号D2639A)说明书进行，将获得的RNA样品 分别按照如下反应体系和反应条件进行反转录，得到cDNA；以DEPC水作 为总RNA的对照。

反转录RT反应液每管9μL：含有5×ReverseTranscriptaseBuffer5μL、 50pmolRandomPrimer(12mer)1μL、10mMdNTPMixture2μL、40U RibonucleaseInhibitor0.5μL和5U/μLAMVReverseTranscriptase0.5μL。

反转录温度42℃1.5h，置于-20℃保存。用PCR分别扩增含有M、H5、 H9、N1和N25个目的基因区域的片段，扩增后得到的的PCR阳性产物克隆 到T-easy载体中构建成质粒，经测序证实这5个重组质粒为T-easy载体分别 插入了一种上述基因的重组质粒，且分别为上述5对引物对A-E的靶基因。

2.2使用单重RT-PCR法验证引物

2.2.1单重特异性引物(SP-Primer)稀释至工作浓度1μmol/L，Cy5-Tag-F 和Tag-R稀释至工作浓度10μmol/L。

PCR反应液每管9.7μL：含有10×PCRbuffer2.5μL，25mMMgCl₂2.5μL， 10mMdNTPMixture1μL，5对特异性引物混合物1.25μL，10μM/L上、下游 通用引物混合物1.25μL，JumpStartTaqDNAPolymerase1.2μL。

反应条件为：94℃5min，然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环； 94℃30s，65℃30s，10个循环；94℃30s，53℃30s，72℃30s，20个循环； 72℃延伸3min，置于4℃。

2.2.2毛细管电泳

使用GenomeLabGeXP遗传分析系统的各PCR产物同时进行毛细管电泳 检测，操作步骤如下：用甲酰胺为上样缓冲液(美国贝克曼库尔特公司,目录 编号608082)，DNAsizestandardKit-400BasePairs(美国贝克曼库尔特公司, 目录编号608098)与上样缓冲液按体积比1:(80-160)彻底混匀，在样品板 上每孔加入39μL混匀好的液体，用PCR产物进行10-100倍稀释，取稀释后 的产物1μL加至样品板，吹打混匀，最后在每孔滴入一滴石蜡油封闭，以免 甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入2/3的缓冲液，进行毛细管电 泳。毛细管电泳的条件如下：毛细管升温：温度50℃；变性：90℃,120s；注 入样品：2.0KV，30s；分离：6.0KV，35min。利用GenomeLabGeXP遗传分 析系统确定各型特异引物扩增片段的实际检测大小。

2.2.3引物对1-5的单重特异性检测

用引物对1-5分别扩增实施例1中获得的cDNA样品：用引物对1扩增 H5N1，引物对2扩增H5N1，引物对3扩增H5N1，引物对4扩增H9N2，引 物对5扩增H9N2。PCR扩增和毛细管电泳的结果显示单重特异性引物只对靶 基因有良好扩增且未见有杂峰。

不同靶基因片段扩增后的大小范围为：AIVM，210-213bp；AIV-H5， 222-224bp；AIV-H9，117-119p；AIV-N1，160-163bp；AIV-N2，188-191bp。

2.3GeXP多重PCR体系的建立

将引物对1、2、3、4、和5混合成多重混合引物(Mix-Primer)工作液， 通过对引物浓度的优化，使靶基因M、H5、H9、N1和N2的引物在PCR反 应体系中对应的的摩尔浓度分别为100nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，50 nmol/L，100nmol/L；通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R在PCR反应体系中的摩 尔浓度为500nmol/L。其余成分与引物验证的相同。以多株已知病毒核酸的 单一阳性标本作为模板或多种病原的混合cDNA样品作为模板，进行多引物 PCR反应，反应程序及电泳与引物验证的相同。

2.4结果

5对引物对1-5混合后分别对单一cDNA或混合cDNA进行检测。

结果表明多引物单模版分别检出了118bp、162bp、188bp、210bp、224bp 的扩增产物，阴性对照无任何扩增产物；如图1所示，多引物多模板结果表 明5个靶基因可被同时检出，经GeXPsystem多重检测体系分析，可检出与 实际相符的5个目的峰且无其他杂峰，同时可通过产物片段大小来区分所检 测的H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。结果也验证了多重检测检测体系中的引 物特异性。

实施例3：GeXPsystem多重检测体系特异性检测

按照MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0说明书从尿囊液中 分别提取HA(1-16)和NA(1-9)亚型禽流感病毒核酸，同时提取IBV、NDV 和ILTV等禽类常见病毒的核酸分别加入到实施例2建立的GeXP多重检测体 系中，检测该方法的特异性。多重PCR完成后，PCR产物上机进行GeXP毛 细管电泳分析，结果显示每个反应只出现特异信号，无交叉反应。HA基因除 H5亚型，H9亚型，NA基因除N1和N2亚型外的其他NA亚型，以及NDV、 IBV、ILTV和空白对照均无反应信号，提示所建立的方法特异性强，与其他 检测对象无交叉反应。

实施例4：GeXPsystem多重检测体系的灵敏度试验和检测临床样本能力 的分析

4.1GeXPsystem多重检测体系的灵敏度试验

用Promega公司RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystem-T7试剂 盒(目录号P1300)按其说明书分别使用SpeI和PvuII对实时例2中构建的含 有M、H5、H9、N1和N2基因的质粒进行酶切，将上述5个含有不同目的基 因线性化质粒进行体外转录合成RNA。利用DU800UV/Vis分光光度计对体 外转录RNA浓度进行测定和定量。根据核酸浓度和分子量计算RNA的拷贝 数。将M、H5、H9、N1和N2基因的体外转录RNA等比例混合后进行10 倍连续稀释至10⁶-10拷贝/μL。以稀释产物为待检测样品，以实施例2建立的 方法进行GeXP多重检测体系灵敏度的检测与分析。试验在不同日重复3次。

非同日的3次重复试验表明，该方法对于M、H5、H9、N1和N2基因最 低可以检测至100拷贝/μL的核酸样本。

4.2GeXPsystem多重检测体系检测临床样本的能力

从实施例1随机选择H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的cDNA，经实施例 2中步骤二的方法进行检测。

H9N2亚型禽流感病毒的检测结果如图2,可以同时检测出118.1、188.58 和211.3三个目的峰且无其他杂峰，表明样品中只含有H9N2亚型禽流感病 毒的模板，与实际相符。

H5N1亚型禽流感病毒的检测结果如图3,可以同时检测出162.46、210.60 和224.86三个目的峰且无其他杂峰，表明样品中只含有H5N1亚型禽流感病 毒的模板，与实际相符。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述 教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在 于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实 现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。