一种注射用特利加压素的有关物质分析方法

摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种注射用特利加压素的有关物质分析方法。本发明所述的注射用特利加压素的含量检测方法，包括以下步骤：步骤1，供试品溶液的制备：取注射用特利加压素配制成供试品溶液；步骤2，自身对照品溶液制备：将供试品溶液稀释，配制成自身对照品溶液；步骤3，有关物质的含量计算：分别将对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，计算得到供试品溶液中有关物质含量。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种注射用特利加压素的有关物质分 析方法。

背景技术

注射用特利加压素的主要活性成分为特利加压素(三甘氨酸-8-赖氨酸-加压 素)，为化学合成多肽类化合物。特利加压素的药理作用为：降低门静脉高压， 同时减少门静脉区的血流，收缩食管平滑肌，持续压迫食管静脉曲张。注射用特 利加压素的主要用于治疗食管静脉曲张出血。

多肽类化合物，是一类重要的生物活性分子。多肽等生物技术药物的研究技 术，如多肽固相合成技术及高效液相色谱纯化、分析技术等的发展，使得合成多 肽药物的开发也成为药物研究中的一个活跃领域。

合成多肽药物是指采用化学合成方法制备的多肽类药物。采用化学合成方法 制备多肽，可以对天然多肽的结构进行修饰，从而增加多肽与受体的亲和力、选 择性，增强对酶降解的抵抗力或改善药代动力学特性，甚至由受体的激动剂变为 拮抗剂。

多肽主要由氨基酸(包括天然氨基酸和非天然氨基酸)构成，这使得多肽类 药物在质量研究方面不同于一般药物。由于合成工艺、结构等方面的独特性，合 成多肽原料药中工艺杂质的来源和一般化学药物有所不同，其可能产生的工艺杂 质有：缺失肽、断裂肽、去酰胺多肽、氨基酸侧链的不完全脱保护所形成的副产 物、氧化肽、二硫键交换的产物、非对映异构的多肽等。同时，由于多肽的结构 特点，这类药物的稳定性相对较差，引起多肽药物不稳定的原因主要有水解、氧 化、外消旋化、二硫键的断裂及重排、β消除等。因此，在合成多肽药物的有关 物质检查方法的研究中需要充分考虑对工艺杂质与降解杂质的检出效能。

多肽类成分的各组成氨基酸均含有末端紫外吸收结构，因此可以使用紫外检 测器进行检测。同时，由于不同结构多肽类成分疏水、亲水性质的差异，反相高 效液相色谱结合梯度洗脱是多肽类成分常用的分离方法。因此，高效液相色谱- 紫外检测器联用是多肽类成分杂质分析的最常用分析技术。

目前，已公开的注射用特利加压素有关物质分析方法有：德国辉凌公司德国 辉凌公司注射用特利加压素质量标准(标准号：YBH02332010)和德国辉凌翰 宇药业注射用特利加压素质量标准(标准号：YBH07302009)。但上述已公开分 析方法对注射用特利加压素有关物质的检测效能未经过对比研究。本发明对注射 用特利加压素有关物质分析方法进行了充分的研究，并通过对不同条件下强制降 解样品的检测，与已公开方法进行充分对比。研究结果表明，本发明建立的有关 物质分析方法对特利加压素工艺及降解杂质的检出效能更高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种注射用特利加压素的含量检测方法。

特利加压素为多肽类药物，易发生降解、断裂，使产品不稳定，因此需要在 生产过程中对产品的含量与有关物质进行及时、有效、准确的分析与测定。与现 有已公开的注射用特利加压素有关物质分析方法相比较，本发明所建立的分析方 法，简单易行，灵敏、准确、精密度高，对特利加压素工艺及降解杂质具有更高 的检出效能，能够在大生产中应用，更为有效的控制产品质量。

本发明所述的注射用特利加压素的含量检测方法，包括以下步骤：

步骤1，供试品溶液的制备：取注射用特利加压素配制成供试品溶液；

步骤2，自身对照品溶液制备：将供试品溶液稀释，配制成自身对照品溶液；；

步骤3，有关物质的含量计算：分别将对照品溶液和供试品溶液注入高效液 相色谱仪，得到色谱图，计算得到供试品溶液中有关物质含量。

其中，所述分析方法的液相色谱条件如下：

色谱柱：AgilentPoroshell120EC-C18，规格4.6×100mm，2.7μm；

流动相A：0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH值3.5)-乙腈，体积比：92:8；

流动相B：0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH值3.5)-乙腈，体积比：80:20；

检测波长：210nm；

流速：1.2ml/min

柱温：40℃

梯度洗脱程序如下表所示：

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 100 0 4 100 0 18 65 35 42 0 100

42.1 100 0 50 100 0

其中，步骤1，供试品溶液制备：方法如下：取注射用特利加压素5支，加 水溶解并稀释至25ml，作为供试品溶液。

其中，步骤2，自身对照品溶液的制备：方法如下：精密量取供试品溶液1ml， 置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为自身对照溶液。

其中，步骤3，有关物质的含量计算：方法如下：取对照溶液20μl注入液相 色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高约为满量程的10％-20％，精密量取供 试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

各杂质相对保留时间和相对响应因子(f)如下所示。以各杂质与自身对照 溶液主峰的峰面积，按百分之一自身对照法计算，[D-Phe6]特利加压素不得过 0.3％；des-Gly¹,Gly²,Gly³特利加压素不得过0.1％；des-Gly¹,Gly²特利加压素 +[β-Asp8]特利加压素不得过0.3％；des-Gly¹特利加压素不得过0.3％；δAva10特 利加压素不得过0.3％；[Des-Gly12]特利加压素不得过0.3％；[Gly12-OH]特利加压素 不得过0.3％；[Glu⁷]特利加压素不得过0.3％；[Asp⁸，Gly¹²-OH]特利加压素峰不 得过0.3％；[Glu⁷，Gly¹²-OH]特利加压素不得过0.3％；[AC-Gly¹]特利加压素不 得过0.3％；其它任一未知杂质不得超过0.3％；总有关物质不得过3.0％。

杂质名称 相对保留时间 相对响应因子 des-Gly1特利加压素 1.01 0.91 des-Gly1,Gly2特利加压素 0.96 0.95 des-Gly1,Gly2,Gly3特利加压素 0.86 1.00 [AC-Gly1]特利加压素 1.41 0.95 [D-Phe6]特利加压素 0.76 0.97 [Glu7]特利加压素 1.20 1.00 [Asp8,Gly12-OH]特利加压素 1.25 0.96 [β-Asp8]特利加压素 0.96 0.98 [Gly12-OH]特利加压素 1.13 0.91 [Glu7,Gly12-OH]特利加压素 1.27 0.92 δAva10特利加压素 1.03 1.00 [Des-Gly12]特利加压素 1.09 1.01 特利加压素 1.00 1.00

将本发明所建立的分析方法与现有已公开的德国辉凌公司注射用特利加压 素质量标准(标准号：YBH02332010)和翰宇药业注射用特利加压素质量标准 (标准号：YBH07302009)进行对比，在特利加压素有关物质控制情况方面的 差异见下表。如表所示，本发明建立的分析方法对特利加压素有关物质的控制更 为严格，表现在杂质控制数量更多，更全面。

另外，经过对比，本发明建立的液相色谱条件与德国辉凌公司注射用特利加 压素质量标准(标准号：YBH02332010)和翰宇药业注射用特利加压素质量标 准(标准号：YBH07302009)中所采用的液相色谱条件有较大差异，主要表现 在：(1)色谱柱的选择；(2)流动相体系的选择；(3)梯度洗脱程序的选择。

三种分析方法所采用的色谱条件如下：

(1)德国辉凌公司注射用特利加压素质量标准使用方法：

色谱柱：WatersSymmetryC18(5μm，150*3.0mm)

流动相A：(硫酸铵3.30g加超纯水至5000ml，加硫酸1ml混匀)-甲醇(1708g： 292g)；

流动相B：硫酸铵缓冲液-甲醇(758g：242g)；

检测波长：210nm；

流速：0.6ml/min；

柱温：30℃；

梯度洗脱程序：

时间(min) 流动相A 流动相B 0 100 0 35 100 0 55 0 100 60 0 100 61 100 0 80 100 0

(2)翰宇药业注射用特利加压素质量标准使用方法：

色谱柱：WELCHUItimateAQ-C18(4.6*250mm,5μm)；

流动相A：0.067mol/L磷酸二氢钠(用磷酸调pH3.5)；

流动相B：乙腈；

检测波长：210nm；

流速：1.0ml/min；

柱温：28℃；

梯度洗脱程序：

时间(min) 时间(min) 流动相B 0 1 8 4 92 8 18 85 15 30 80 20 30.1 92 8 40 92 8

(3)本发明使用方法：

色谱柱：AgilentPoroshell120EC-C18(4.6×100mm，2.7μm)；

流动相A：0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH值3.5)-乙腈(92:8，v/v)；

流动相B：0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH值3.5)-乙腈(80:20，v/v)；

检测波长：210nm；

流速：1.2ml/min

柱温：40℃

梯度洗脱程序如下表所示：

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 100 0 4 100 0 18 65 35 42 0 100 42.1 100 0 50 100 0

为了比较3种不同液相色谱条件对特利加压素有关物质检测效能的差异，制 备了不同条件(高温、高湿、光照)下的强制降解样品，并采用3种液相色谱条 件对上述样品进行检测，各样品的制备方法如下：

(1)高温破坏样品溶液：称取40℃条件下放置10天的样品约10mg，精密 称定，加水溶解并稀释至50ml，作为高温破坏样品溶液；

(2)光照坏样品溶液：称取60℃条件下放置10天的样品约10mg，精密称 定，加水溶解并稀释至50ml，作为高温破坏样品溶液；

(3)高湿坏样品溶液：称取RH75％条件下放置10天的样品约10mg，精密 称定，加水溶解并稀释至50ml，作为高湿破坏样品溶液。

3种液相色谱条件的检测结果如下表所示：

由3种不同样品的有关物质检出、主峰峰形、主峰柱效参数的比较结果可知，

本发明的检测方法，具有以下优点：

(1)检出杂质数量：本发明建立的分析方法检出杂质数量高于德国辉凌公 司注射用特利加压素质量标准和翰宇药业注射用特利加压素质量标准中收录的 分析方法。

(2)检出杂质含量：本发明建立的分析方法检出的杂质含量均高于德国辉 凌公司注射用特利加压素质量标准和翰宇药业注射用特利加压素质量标准中收 录的分析方法。

(3)柱效：本发明建立的分析方法主峰理论塔板数以及主峰峰宽均优于德 国辉凌公司注射用特利加压素质量标准和翰宇药业注射用特利加压素质量标准 中收录的分析方法，柱效较高。

本发明相对于现有技术，主要提高了特利加压素有关物质的控制标准和检测 方法的分析效能，体现在：

(1)对特利加压素有关物质的控制更为严格，杂质控制数量更多，更全面；

(2)分析方法检出杂质数量、含量、柱效均优于已公开分析方法，对于注 射用特利加压素所包含的各种杂质具有更高的检出效能，更加适用于注射用特利 加压素的有关物质检测。

说明书附图：

附图1：des-Gly1特利加压素定位色谱图

附图2：des-Gly1,Gly2特利加压素定位色谱图

附图3：des-Gly1,Gly2,Gly3特利加压素定位色谱图

附图4：[AC-Gly1]特利加压素定位色谱图

附图5：[D-Phe6]特利加压素定位色谱图

附图6：[Glu7]特利加压素定位色谱图

附图7：[Asp8,Gly12-OH]特利加压素定位色谱图

附图8：[β-Asp8]特利加压素定位色谱图

附图9：[Gly12-OH]特利加压素定位色谱图

附图10：[Glu7,Gly12-OH]特利加压素定位色谱图

附图11：δAva10特利加压素定位色谱图

附图12：[Des-Gly12]特利加压素定位色谱图

附图13：样品检测代表性色谱图

具体实施方式

通过以下具体实施方式对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。 实施例1：注射用特利加压素的制备

成分 单位剂量用量 特利加压素 1.0mg 甘露醇 10.0mg 盐酸 适量 合计 11.0mg

制备工艺：

1.处方量分别称取原料药醋酸特利加压素及辅料甘露醇、盐酸备用；

2.取处方量70％(w/w)注射用水，将处方量的甘露醇溶解；

3.按0.1％(w/w)加药用炭，搅拌吸附15分钟，用0.45μm钛棒滤芯进行 脱炭过滤，脱炭循环5min。

4.称取处方量醋酸特利加压素,溶解，再补加注射用水至处方量(w/w)，搅拌 5分钟；

5.用6mol/L的盐酸调节pH3.5-4.0；

6中间体检测，检测性状、含量、pH、内毒素；

7用0.22μm聚醚砜的微孔滤芯进行过滤，三次；

8.将所得含药溶液，灌装入体积合适的中硼硅玻璃管制注射剂瓶中，半加塞；

9冻干

10.真空全压塞，扎铝盖，即得成品。

实施例2：

液相色谱条件如下：

色谱柱：AgilentPoroshell120EC-C18(4.6×100mm，2.7μm)；

流动相A：0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH值3.5)-乙腈(92:8，v/v)；

流动相B：0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH值3.5)-乙腈(80:20，v/v)；

检测波长：210nm；

流速：1.2ml/min

柱温：40℃

梯度洗脱程序如下表所示：

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 100 0

4 100 0 18 65 35 42 0 100 42.1 100 0 50 100 0

其中，步骤1，供试品溶液制备：取des-Gly1特利加压素，des-Gly1,Gly2 特利加压素，des-Gly1,Gly2,Gly3特利加压素，[AC-Gly1]特利加压素，[D-Phe6] 特利加压素，[Glu7]特利加压素，[Asp8,Gly12-OH]特利加压素，[β-Asp8]特利加 压素，[Gly12-OH]特利加压素，[Glu7,Gly12-OH]特利加压素，δAva10特利加压 素，[Des-Gly12]特利加压素，各约10mg，分别置50ml量瓶中，加水溶解并稀 释至刻度，摇匀，作为定位溶液储备液，量取上述各储备液5ml分别置100ml 量瓶中，加水稀释至刻度作为杂质定位溶液。

其中，步骤2，杂质定位：精密量取各供试品溶液20μl，分别注入液相色谱 仪，记录色谱图，各杂质保留时间如下表所示：

杂质名称 保留时间(min) des-Gly1特利加压素 15.910 des-Gly1,Gly2特利加压素 15.141 des-Gly1,Gly2,Gly3特利加压素 13.463 [AC-Gly1]特利加压素 22.102 [D-Phe6]特利加压素 12.007 [Glu7]特利加压素 18.841 [Asp8,Gly12-OH]特利加压素 19.669 [β-Asp8]特利加压素 15.064 [Gly12-OH]特利加压素 17.734 [Glu7,Gly12-OH]特利加压素 19.960 δAva10特利加压素 16.107 [Des-Gly12]特利加压素 17.056

各杂质定位色谱图如附图1-12所示。

实施例3：

液相色谱条件如下：

色谱柱：AgilentPoroshell120EC-C18(4.6×100mm，2.7μm)；

流动相A：0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH值3.5)-乙腈(92:8，v/v)；

流动相B：0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH值3.5)-乙腈(80:20，v/v)；

检测波长：210nm；

流速：1.2ml/min

柱温：40℃

梯度洗脱程序如下表所示：

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 100 0 4 100 0 18 65 35 42 0 100 42.1 100 0 50 100 0

其中，步骤1，供试品溶液制备：方法如下：取注射用特利加压素5支，加 水溶解并稀释至25ml，摇匀，作为供试品溶液，配制6份。

其中，步骤2，自身对照品溶液的制备：方法如下：精密量取供试品溶液1ml， 置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为自身对照溶液，配制6份。

其中，步骤3，有关物质的含量计算：方法如下：取对照溶液20μl注入液相 色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高约为满量程的10％-20％，精密量取供 试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算结果如 下表所示：

序号 A(％) B(％) C(％) D(％) E(％) F(％) 总杂(％) 1 0.07 0.03 0.04 0.16 0.12 0.08 0.5 2 0.08 0.04 0.03 0.17 0.11 0.08 0.51 3 0.07 0.03 0.03 0.17 0.11 0.08 0.49 4 0.07 0.03 0.03 0.17 0.12 0.09 0.5 5 0.07 0.03 0.03 0.17 0.12 0.09 0.51 6 0.07 0.03 0.03 0.16 0.12 0.08 0.49 均值 0.072 0.032 0.032 0.167 0.117 0.083 0.500 RSD(％) 5.70 12.89 12.89 3.10 4.43 6.20 1.79

注：A、B、C、D、E和F分别指未知杂质1、未知杂质2、des-Gly1,Gly2特利 加压素+[β-Asp8]特利加压素、[Des-Gly12]特利加压素、[AC-Gly1]特利加压素 和未知杂质3。

样品检测色谱图如附图13所示。