一种利用qRT-PCR鉴定啤酒大麦Gairdner品种纯度的方法

摘要

本发明公开了一种利用qRT-PCR鉴定啤酒大麦Gairdner品种纯度的方法。本发明方法根据双向电泳技术发现的啤酒大麦Gairdner标志蛋白BMAI-1设计特异引物，利用qRT-PCR技术测定不同纯度Gairdner种子中标志蛋白的相对表达量或相对含量，建立标志蛋白相对表达量与Gairdner纯度的相关性曲线，利用该相关性曲线检测对未知纯度的Gairdner样品。本发明可准确高效地检测啤酒大麦Gairdner的纯度，在制麦和啤酒行业具有良好的市场应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用qRT-PCR鉴定啤酒大麦Gairdner品种纯度的方法，属于制麦和啤酒酿造领域。

背景技术

啤酒大麦是是啤酒生产的主要原料，其品质优劣是决定啤酒质量的关键。啤酒大麦品种不同，大麦籽粒的饱满度和粗蛋白含量及麦芽的品质如水分、浸出物、色度、总蛋白及可溶性氮含量等指标也有所差异，最终也影响着成品啤酒的泡持性、浊度、成熟度和风味等质量指标。除了遗传特性之外，啤酒大麦的酿造品质也受环境因素和农艺措施的影响，对于某些品质性状，环境因子起着更大的决定作用。我国大麦主要产区相对集中，主要分布在长江流域、黄河流域和青藏高原，按酿造性能可将啤酒大麦产区分为三类：甘肃新疆产区，东北产区和江浙产区。啤酒工业的发展促进了对大麦原料的需求，其中西北和黑龙江等地啤酒大麦发展较快。20世纪90年代，我国啤酒行业主要使用进口啤酒大麦，随着国际市场的不稳定和价格上升，进入21世纪后，啤酒企业逐渐重视和使用国产啤酒大麦。尽管国内大麦产量不断上升，但农艺性状优良、适宜于酿造的啤酒大麦品系缺乏，在质量上仍存在大麦质量指标极差大、波动大、对应麦芽脆度低、微粉浸出物低，品质均一性差等质量缺陷，大部分只能做饲料用，而能用于啤酒行业的啤酒大麦只有150万吨左右。因此，每年需从澳大利亚、加拿大、法国等欧洲国家进口啤酒大麦，以满足国内啤酒行业发展的需要。

由于进口大麦品质优售价高，因而市场上常出现将混级大麦或国产质量稍好的大麦混入进口一级大麦等以次充好的情况，这不仅造成了对外贸易或采购的经济损失，更影响了以此为原料酿造的啤酒的品质，对生产周期、生产设备也可能造成一定影响，影响啤酒行业的经济效益。进口大麦的品种和质量直接关系到麦芽的制作和啤酒酿造的工艺，这就要求检验检疫部门能够准确地对进口大麦的品种和品种纯度进行鉴定。同时由于进口啤酒大麦成本高，国产啤酒大麦质量日益完善，加上相关部门对其品种鉴定手段还不完善，使得进口啤酒大麦在品种真实性问题上还存在一些挑战。因此，有必要对进口啤酒大麦进行品种纯度及真实性鉴定。

目前用于大麦品种鉴定的方法有感官评价法、物理化学法、DNA分子标记法、同工酶电泳法等，但这些鉴定方法只能对品种进行判断，无法鉴定大麦样品的纯度，此外在品种判断上也存在不确定性、假阳性或成本高、操作难度大等缺点。普遍被认可的方法是醇溶蛋白SDS-PAGE电泳法，此方法可同时判断大麦样品的品种和纯度，具有较高的准确性，然而，由于该方法需对大麦样品进行四分法取样，将取样得到的每一粒大麦种子的醇溶蛋白进行提取及SDS-PAGE电泳、染色、脱色及与标准图谱的比较后，才能判断其品种及纯度，工作量大，耗时长，因此存在一定的局限性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术鉴定啤酒大麦Gairdner品种纯度的方法。本发明利用啤酒大麦Gairdner品种标志蛋白BMAI-1(由基因IMAI-1编码)，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术建立其相对表达量与其纯度的相关性曲线，并拟合线性方程，通过该相关性曲线检测未知纯度Gairdner大麦样品的纯度。本发明方法检测的未知Gairdner大麦样品的纯度与传统SDS-PAGE方法检测的纯度相差无几，检测时间明显缩短，工作量大大降低。同时，本发明适用于其它啤酒大麦品种的纯度鉴定。

所述方法是针对Gairdner的品种标志蛋白，利用qRT-PCR技术建立该标志蛋白相对表达量与Gairdner品种纯度的相关性曲线，从而对Gairdner大麦样品纯度进行定量检测。

所述Gairdner的品种标志蛋白为由基因IMAI-1编码的α-淀粉酶抑制剂BMAI-1。

所述qRT-PCR的引物为：标志蛋白编码基因IMAI-1特异引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，内参基因为ACTIN。

所述内参基因的特异引物如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。

所述相关性曲线为y＝0.0129x-0.2748(R²＝0.972)，其中y为样品中标志蛋白编码基因IMAI-1相对于纯Gairdner大麦的IMAI-1基因的相对表达量，x为Gairdner大麦样品纯度。

所述方法是对未知Gairdner大麦样品进行qRT-PCR反应，通过标志蛋白的相对表达量和相关性曲线，计算未知样品中Gairdner大麦的纯度。

所述方法是：(1)人工制备不同纯度Gairdner啤酒大麦样品；(2)提取不同纯度Gairdner啤酒大麦样品的总RNA；(3)根据标志蛋白编码基因IMAI-1设计如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的特异引物，以肌动蛋白actin编码基因ACTIN为内参基因，分别进行qRT-PCR，获得标志蛋白基因及内参基因的Ct值，以2^-ΔΔCt表示标志蛋白基因的相对表达倍数；(4)以样品纯度为横坐标，以标志蛋白基因相对表达量即2^-ΔΔCt为纵坐标，绘制标志蛋白基因相对表达量与大麦样品纯度的拟合线性方程；(5)对任一未知大麦样品，提取总RNA，然后使用步骤3的方法进行qRT-PCR得到未知样品中标志蛋白基因相对表达量y，将y代入拟合线性方程，即得未知样品中Gairdner大麦的纯度x。

所述方法，具体由以下步骤组成：

(1)收集目前普遍采用的啤酒大麦样品(包括含Gairdner在内的6种澳大利亚啤酒大麦及4种国产啤酒大麦)，根据溶解性差别，分别进行分级提取种子醇溶蛋白，经过双向电泳分离，利用图像分析软件找到各品种的共同蛋白和差异蛋白，并对共同蛋白和差异蛋白进行质谱鉴定，不存在于共同蛋白中的差异蛋白即为Gairdner的特征蛋白或标志蛋白。

(2)通过人工混种，获得一系列纯度梯度(60％-100％)的Gairdner大麦样品，分别提取总RNA，根据其标志蛋白编码基因设计特异引物，以肌动蛋白actin编码基因ACTIN为内参基因，分别进行qRT-PCR，获得标志蛋白基因及内参基因的Ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)，以2^-ΔΔCt表示标志蛋白基因的相对表达倍数(ΔCt＝Ct_{(标志蛋白基因)}-Ct_(ACTIN)，ΔΔCt＝ΔCt_{(某一纯度)}-ΔCt_{(100％纯度)})，以样品纯度为横坐标，以标志蛋白基因相对表达量即2^-ΔΔCt为纵坐标，绘制标志蛋白基因相对表达量与其纯度的相关性曲线，并拟合线性方程。

(3)按步骤(2)的方法，分别提取纯度为100％的标准Gairdner样品及待测Gairdner大麦样品的mRNA，并进行qRT-PCR，根据Ct值计算2^-ΔΔCt并代入标志蛋白基因相对表达量与其纯度的相关性曲线方程，即可计算出待测样品的纯度。

本发明的有益效果：本发明方法与目前认可的SDS-PAGE方法具有相同的准确率，但在操作上更简便快捷、检测时间明显缩短、工作量大大降低。利用本发明检测啤酒大麦样品纯度，具有良好的应用前景。同时，本发明适用于其它啤酒大麦品种的纯度鉴定。

附图说明

图1为啤酒大麦醇溶蛋白分级提取流程；

图2为大麦醇溶蛋白的双向电泳图谱，a.Gairdner；b.Baudin；

图3为大麦醇溶蛋白的双向电泳图谱，c.Hindmarsh；d.Vlamingh；e.Commander；f.Schooner；

图4为大麦醇溶蛋白的双向电泳图谱，g.苏啤3号；h.苏啤6号；i垦啤7号；j垦啤10号；

图5为标志蛋白相对表达量与Gairdner纯度的相关性曲线；

图6为三个未知Gairdner样品a,b,c各籽粒醇溶蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。

具体实施方式

以下实施例1～实施例3所涉及实验材料如下：

啤酒大麦：实施例中所用到的进口澳大利亚啤酒大麦Baudin、Commander、Vlamingh由北京中粮集团公司提供，进口澳大利亚啤酒大麦Gairdner、Hindmarsh、Schooner、FAQ由永顺泰麦芽公司提供；国产啤酒大麦苏啤3号、6号由江苏省盐城农科院提供，垦啤7号、10号由黑龙江省农垦总局红兴隆农业科学研究所提供；所有啤酒大麦均为2012-2013年度样品。

试剂与试剂盒：琼脂糖、溴酚蓝、碘乙酰胺(IAA)、二硫苏糖醇(DTT)、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、N,N,N’N’-四甲基乙二胺(TEMED)、尿素、硫脲为GE公司产品。矿物油、IPG胶条(pH3～10，17cm，非线性)、载体两性电解质(pH3～10，非线性)为Bio-Rad公司产品。α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、碳酸氢铵、三氟乙酸(TFA)、胰蛋白酶、乙腈等购于Sigma公司。RNAisoPluskit、OnestepSYBRPrimeScriptPLUSRT-PCRKit、10×DNaseIBuffer、RNaseinhibitor、RecombinantDNaseI等试剂购于大连宝生物工程有限公司。DEPC试剂、30％丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、牛血清蛋白、Tris、蛋白标准物为上海生工进口分装产品。无水乙醇、三氯甲烷、异丙醇、乙酸钠、三氯乙酸(TCA)、乙二胺四乙酸(EDTA)等为分析纯产品，购于国药集团试剂公司。

实施例1～实施例3实验中所使用引物序列如表1所示。

表1本发明所用到的引物序列

实施例1蛋白质组学技术发掘啤酒大麦Gairdner品种标志蛋白

1.啤酒大麦种子醇溶蛋白的分级提取和双向电泳分离

根据四分法，取20粒啤酒大麦种子，经粉碎机处理结合液氮研磨至粉末状，称取3g粉末先后经过去离子水、5％(W/V)、NaCl及75％(V/V)乙醇抽提，得到大麦醇溶蛋白，具体详见图1。

采取TCA-丙酮法沉淀蛋白，即向蛋白上清液中加入4倍体积20％的预冷的TCA-丙酮溶液，摇匀，-20过夜放置沉淀蛋白，412000×g离心30分钟。弃上清，收集沉淀，用预冷的90％丙酮清洗沉淀，47800×g离心30分钟，重复3次，沉淀自然挥发丙酮，即得醇溶蛋白。将醇溶蛋白溶解于适量的蛋白水化液(8mol/L尿素、2mol/L硫脲、4％(W/V)CHAPS、0.8％(W/V)两性电解质及1％(W/V)DTT)，并测定蛋白质浓度。

选用长度17cm的IPG胶条(pH3～10，非线性)，蛋白样品(500～800μg)加入水化液至终体积350μL，水化12～14h后，将胶条转移至等电聚焦仪EttanIPGhor3的聚焦槽中，胶面朝上两端加上润湿的电极纸片，在胶条上面覆盖上矿物油进行密封，设置好聚焦程序(表2)进行等电聚焦。等电聚焦完成后，利用两步平衡法进行胶条平衡：平衡液母液(尿素180g，甘油150mL，SDS10g，溴酚蓝0.1g，用100mL0.5molL^-1的Tris-HCl(pH6.8)稀释至500mL)+1％DTT(W/V)，15分钟；平衡液母液+1.25％IAA(W/V)，15分钟。胶条平衡后转移至配置好的12.5％丙烯酰胺凝胶上，用0.5％琼脂糖封住凝胶上部，进行第二向SDS-PAGE电泳：2W/gel电泳1小时后，14W·gel^-1至溴酚蓝指示剂迁移到凝胶底部时，关闭电源，结束电泳。剥离凝胶，置于考马斯亮蓝G-250染色液中染色过夜，置脱色液(3％冰醋酸)中脱色(约5～8h)，直到背景无色透明，蛋白点清晰为止。

表2等电聚焦程序

2.双向电泳图谱分析及共同/差异蛋白的质谱鉴定

利用PDQuest凝胶分析软件比较得到的各大麦醇溶蛋白双向电泳图谱(图2-图4)，找到共同蛋白点及各大麦品种凝胶图谱上的特异蛋白点。通过切点、脱色、胶内胰酶酶解，将酶解液点于质谱样品板，与基质混合后，利用基质辅助激光解吸的时间飞行质谱进行肽段分离及二级裂解分离，得到肽指纹图谱后，与NCBI数据库比对，得到鉴定结果。其中在Gairdner品种的谱图中特异的蛋白点，经鉴定分别为醇溶蛋白B(HordeinB)、α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16(α-amylase/trypsininhibitorCM16)和α-淀粉酶抑制剂BMAI-1(α-amylaseinhibitorBMAI-1)。。

实施例2Gairdner品种标志蛋白BMAI-1与其纯度的相关性曲线的构建

1.人工混种

取Gairdner、苏啤6号、垦啤7号大麦种子，以20粒种子混合，得到纯度分别为100％、95％、90％、85％、80％、70％和60％的混合大麦。

2.种子总RNA的提取与纯化

将混和大麦种子放入液氮冷冻，迅速转移至液氮预冷的研钵中，研磨至粉末状后立即转入预冷的离心管中，利用宝生物公司的RNA提取试剂盒(RNAisoPlusKit)提取RNA，具体步骤如下：

(1)加入适量RNAisoPlus，充分混匀，室温(15-30)静置5分钟；

(2)12000×g4离心5分钟，小心吸取上清液，移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)；

(3)加入1/5体积的氯仿，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5分钟；

(4)12000×g4离心15分钟，此时液体分为三层：无色的上清(含RNA)、白色的中间层(含蛋白和DNA)、有色的有机相。吸取上清至新的离心管。

(5)加入0.5-1倍体积的异丙醇，充分混匀后，室温静置10分钟；

(6)12000×g4离心10分钟，沉淀即为总RNA，加入等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒清洗RNA；

(7)7500×g4离心5分钟，弃上清，室温干燥；

(8)加入适量DEPC水溶解RNA。

提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳确定为RNA，为减小实验误差，对提取的RNA进行纯化，去除基因组DNA，具体步骤如下：

(1)在微量离心管中配置反应液(表3)

表3

总RNA 10×DNaseIBuffer 5μL RecombinantDNaseI(RNase-free) 2μL DEPC水 补足体积至50μL

(2)将反应管置于37反应30分钟；

(3)向反应体系中加入2.5μL0.5mol/LEDTA，混匀，80热处理2分钟，使RecombinantDNaseI失活，加DEPC水定容至100μL；

(4)加入10μL3mol/L醋酸钠和250μL冷乙醇，混匀后-80冷却20分钟；

(5)10000×g4离心10分钟，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤，10000×g4离心5分钟，弃上清。

(6)室温挥发乙醇，用适量DEPC水溶解沉淀RNA，进行琼脂糖凝胶电泳确认是否完全去除基因组DNA，利用NanoDropND-1000分光光度计测定各样品RNA浓度，RNA样品贮存于-80待用。

3.qRT-PCR及标志蛋白基因相对表达量的确定

qRT-PCR反应体系为20μL，根据OneStepSYBRPrimeScriptPLUSRTPCR试剂盒配置体系，每个样品做三个平行反应管(表4)：

表4

BufferIV 10μL ExTaq 1.2μL RTMixII 0.4μL 引物1 0.4μL 引物2 0.4μL RNA 100ng DEPC水 补足体积至20μL

所用引物如表1所示

qRT-PCR反应在CFX96Touch^TMReal-TimePCR仪上完成，反应程序为表5所示：

表5

用CFXManagerSoftwareVersion2.1软件分析所得扩增曲线及对应的Ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)，根据公式

ΔCt＝Ct(IMAI)-Ct(ACTIN)

ΔΔCt＝ΔCt(某一纯度Gairdner样品)-ΔCt(纯Gairdner样品)

2^-ΔΔCt即代表该纯度Gairdner样品中IMAI基因相对表达量

4.Gairdner品种标志蛋白与其纯度的相关性曲线的构建

每个纯度样品均得到相应的IMAI相对表达量(即2^-ΔΔCt)，以Gairdner样品纯度为横坐标，IMAI标志蛋白的相对表达量为纵坐标，绘制标志蛋白相对表达量与Gairdner样品纯度的相关性曲线(图5)，拟合线性方程为y＝0.0129x-0.2748，其中y为标志蛋白相对表达量，x为Gairdner大麦样品纯度。

实施例3双盲实验检测未知Gairdner样品纯度

将Gairdner和垦啤7号人工混合成三个纯度的大麦样品(20粒)，交予实验者进行样品纯度检测。

1.qRT-PCR方法检测未知Gairdner样品纯度

按照实例2的步骤，提取并纯化各大麦样品及纯Gairdner样品的RNA，继而进行qRT-PCR，得到各纯度样品标志蛋白IMAI的相对表达量(表6)，分别代入线性方程为y＝0.0129x-0.2748，计算得到各样品的纯度(表7)。

表6三次qRTPCR重复得到的样品a,b,c的Ct值

2.SDS-PAGE方法检测未知Gairdner样品纯度

分别提取每一纯度每一大麦籽粒的醇溶蛋白，具体操作如下：

(1)将大麦籽粒研碎，放入1.5mL离心管中；

(2)加入500μL醇溶蛋白提取液(0.5％(W/V)Tris,50％(V/V)正丙醇，5％(W/V)DTT)，混合均匀，80水浴20分钟；

(3)3000×g4离心10分钟，取上清50μL，加入等体积醇溶蛋白提取液，80水浴20分钟，即得到大麦醇溶蛋白，4贮存备用。

对每一籽粒醇溶蛋白进行SDS-PAGE(12.5％)电泳，同一纯度的20粒大麦醇溶蛋白同时进行电泳，醇溶蛋白上样量为10μL，不同纯度之间的大麦醇溶蛋白电泳条件相同，得到如图6所示SDS-PAGE电泳图谱。从图6中可以看出，每组SDS-PAGE图谱中均存在两种不同的蛋白条带，即为Gairdner和垦啤7号两种啤酒大麦的醇溶蛋白条带，每组图谱中用方框圈出的即为该纯度大麦样品中不同于其余蛋白条带的蛋白条带，即是Gairdner大麦中混杂的垦啤7号。因此，根据图谱可粗略计算出这3种Gairdner大麦样品的纯度分别为95％、90％、80％。

表73种人工混种Gairdner大麦样品的检测纯度值

其次，本发明通过实施例1的方法同样得到了Gairdner大麦图谱中的特异蛋白醇溶蛋白B和α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂CM16，然而这两种蛋白利用qRT-PCR的方法根本没有办法将Gairdner大麦与其他大麦品种进行区分。

此外，发明人也利用类似的方法，找到了其他大麦品种的特异蛋白，如Baudin中的醇溶蛋白B₁和Schooner中的BTI-CMe2.2。然而采用实施例2-3的类似方法，将这两种特意蛋白分别用于Baudin、Schooner大麦的鉴定。结果发现该蛋白mRNA水平与其纯度不呈线性关系，无法得到线性相关性曲线；同时，发明人还针对Hindmarsh中的醇溶蛋白D和Vlaming中的醇溶蛋白B₃，采用实施例2-3的类似方法，得到相关性曲线分别为Y＝0.3634X+0.8418(R²＝0.2905)和Y＝0.3563X+0.6866(R²＝0.7225)，其R²值均小于0.95，表示特异蛋白mRNA水平与大麦品种纯度的线性相关性低，若用于纯度检测存在较大误差，准确性欠佳。

综上所述，本发明通过蛋白质组学技术发现的啤酒Gairdner大麦品种标志蛋白BMAI-1，建立了利用qRT-PCR方法检测品种纯度的方法，该方法与目前认可的SDS-PAGE方法具有相同的准确率，但在操作上更简便快捷。利用本发明检测啤酒Gairdner大麦样品纯度，具有良好的应用前景。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。