鞍带石斑鱼神经肽B基因、蛋白及其应用

摘要

本发明属于水产养殖技术领域，具体地，公开了鞍带石斑鱼神经肽B基因、蛋白及其应用。神经肽B基因开放读码框序列、编码的氨基酸序列、成熟肽序列如SEQ？ID？NO:？1~3所示。本发明利用Real-time？PCR技术，检测了NPB在鞍带石斑鱼不同组织中的分布状况，同时研究了NPB成熟肽(NPB29)对石斑鱼的摄食及代谢相关基因表达的调控作用；本发明为开发以新型神经肽B为主要成分的添加剂产品奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，具体地，涉及鞍带石斑鱼神经肽B基因、蛋白及其应用。

背景技术

神经肽B（NeuropeptideB,NPB）是孤儿G蛋白偶联受体GPR7(NPBWR1)的内源性配体，最初是从牛的下丘脑中分离纯化得到。NPB的前体蛋白prepro-NPB包含一个含有29个氨基酸的成熟肽，该肽最典型的特征是在N-端的色氨酸残基通过翻译后加工被溴化。除了哺乳动物，NPB已经在硬骨鱼和蟾蜍中被克隆出来。NPB主要分布于中枢神经系统，在外周组织中，NPB也分布于哺乳动物的肾、性腺、肝和胃等组织。如此广泛的组织分布模式预示着NPB在脊椎动物中具有多种生物学功能。然而NPB的生理功能仅在人、大鼠、小鼠等少数哺乳动物及罗非鱼等极个别硬骨鱼中有相关报道。研究发现NPB可能参与摄食调节，能量代谢平衡，内分泌调节及痛觉感受等生理活动，但有关NPB在其他脊椎动物尤其是在硬骨鱼中的研究目前还几乎处于空白。

鞍带石斑鱼（Epinepheluslanceolatus）俗称龙趸、龙胆石斑鱼、紫石斑鱼，在分类学上隶属于鲈形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)。鞍带石斑鱼属暖水性岛礁性鱼类，是石斑鱼属中体型最大的种类，有“石斑鱼之王”之称，其具有适应性强、抗病力强、肉质鲜美、营养价值高等优点，市场价格高，销路好。2004年联合国粮农组织把石斑鱼与金枪鱼和黄尾鰤列为未来20年最有发展前途的三种养殖鱼类。近年来，我国南方沿海地区兴起了鞍带石斑鱼的养殖热潮，鞍带石斑鱼也成为日后深水网箱和工厂化养殖的理想品种选择之一。探讨新型神经肽NPB在鞍带石斑鱼中的生理功能为鞍带石斑鱼养殖提供理论指导。

发明内容

本发明的目的是为了充分研究鞍带石斑鱼的生殖生长，提供了鞍带石斑鱼神经肽B基因、蛋白及其应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

鞍带石斑鱼神经肽B基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

鞍带石斑鱼神经肽B蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

鞍带石斑鱼神经肽B的成熟肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。

本发明通过研究发现鞍带石斑鱼神经肽B基因主要在鞍带石斑鱼中枢神经系统中表达，其中在下丘、延髓和脊髓中的表达量较高；NPB在所检测的外周组织中均有表达，但表达量都较低。另外，发现在注射12小时后，10ng/gBW和100ng/gBW的NPB29能够显著促进石斑鱼orexinmRNA的表达，当分别注射100ng/gBW和1000ng/gBW的NPB293小时后，以及注射1000ng/gBW的NPB296小时候，石斑鱼脑区LeptinBmRNA的表达均有显著提高，说明LeptinB在石斑鱼脑区参与了摄食和/或脂肪代谢的调控。

因此，本发明要求保护鞍带石斑鱼神经肽B成熟肽在促进石斑鱼Orexin基因表达中的应用。

鞍带石斑鱼神经肽B成熟肽在提高石斑鱼瘦素B基因表达中的应用。

鞍带石斑鱼神经肽B基因在调控石斑鱼摄食和/或脂肪代谢的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次克隆出鞍带石斑鱼神经肽B基因，并研究了其在鞍带石斑鱼各组织中的表达情况，并对其生理代谢功能进行了充分的研究，为开发以新型神经肽B为主要成分的添加剂产品奠定了基础。

附图说明

图1-1是NPB中间片段克隆第一轮电泳结果，M为Marker，在1对应的模板中出现预期片段。

图1-2是NPB中间片段克隆第二轮电泳结果，NC为阴性对照，M为Marker，在1对应的模板中出现预期片段。

图2-1是NPB3’RACE克隆第一轮电泳结果，NC为阴性对照，其中1为所取的脑组织，M为marker。

图2-2是NPB3’RACE克隆第二轮电泳结果，其中1为所取脑组织，M为marker。

图3-1是NPB5’RACE克隆第一轮电泳结果，其中1为所取脑组织，M为Marker。

图3-2是NPB5’RACE克隆第二轮电泳结果，NC为阴性对照，其中1为所选取脑组织，M为Marker。

图4-1是NPBORF克隆第一轮电泳结果，其中1为所选取脑组织，M为Marker。

图4-2是NPBORF克隆第二轮电泳结果，其中1为所选取的脑组织，M为Marker。

图5是NPBmRNA在鞍带石斑鱼不同组织中的表达状况。

图6是腹腔注射NPB成熟肽（NPB29）对下丘脑中Orexin基因的表达调控作用。

图7是腹腔注射NPB成熟肽（NPB29）对全脑中LeptinB基因的表达调控作用。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1鞍带石斑鱼NPB全长cDNA的克隆

基因克隆的整体思路：利用NCBI的Blast检索功能，从本实验室已完成的鞍带石斑鱼脑组织的转录组中检索到NPB的部分cDNA序列，根据此序列设计基因特异引物，进行NPBcDNA中间片段克隆；根据此中间片段，设计5’/3’-RACE的特异性引物，并结合5’/3’RACE的通用引物进行PCR扩增，从而获得NPB前体的全长cDNA序列；最后在3`和5`非编码区设计特异引物，进行开放读码框ORF的克隆。具体步骤如下：

1、鞍带石斑鱼NPB中间片段克隆：利用Invitrogen公司的M-MLV，把总RNA合成第一链cDNA。中间片段PCR扩增按照Toyobo公司产品聚合酶blendtapplus所要求的反应条件进行。第一轮PCR反应条件：94℃3min；94℃15s，温度梯度（50℃，54℃，58℃，62℃）15s，72℃1min，30个循环；72℃5min；4℃，保存。把第一轮的PCR产物按照1：100的比例稀释后作为模板进行第二轮PCR反应，反应条件为94℃3min；94℃15s，温度梯度（50℃，54℃，58℃，62℃）15s，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃，保存。

神经肽NPB中间片段克隆电泳结果如图1-1所示，经过第一轮PCR，在300bp之间出现了预期条带，第二轮如图1-2所示，在200bp到300bp之间出现了预期条带，将预期条带进行回收测序得到269bp的片段，经blast比对证明为NPB序列。

2、鞍带石斑鱼NPB3`RACE和5`RACE：利用设计的3`RACE特异引物与通用引物AUAP扩增获得了NPB3’末端序列，3`RACEPCR反应条件如下：第一轮：94℃3min；94℃15s，温度梯度（58℃，60℃，62℃，64℃）15s，72℃1min，30个循环；72℃5min；4℃保存；把第一轮的PCR产物按照1:100的比例稀释后作为模板进行第二轮PCR反应，反应条件为：94℃3min；94℃15s，温度梯度（58℃，60℃，62℃，64℃）15s，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃保存；

利用已设计的5’RACE特异引物与通用引物AUAP和AAP扩增获得NPB5`末端序列，5`RACEPCR反应条件：第一轮：94℃3min；94℃15s，温度梯度（58℃，60℃，62℃，64℃）15s，72℃1min，30个循环；72℃5min；4℃保存；同样把第一轮的PCR产物按照1:100的比例稀释后作为模板进行第二轮PCR反应，反应条件为：94℃3min；94℃15s，温度梯度（58℃，60℃，62℃，64℃）15s，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃保存；

NPB3`RACE和5`RACE克隆的第一轮电泳结果分别如图2-1和3-1所示，第二轮的电泳结果分别如图2-2和3-2所示，获得长度分别为349bp和216bp的片段，与NPB中间片段重合部完全相同，经blast也确定为NPB的部分序列。

3、鞍带石斑鱼NPB开放读码框（OpeningReadingFrame,ORF）的克隆

在5`和3`的非编码区分别设计上下游特异引物NPB-ORF-F：5’-CTCGACATGGACATGCCCGCTAA-3’(SEQIDNO：4)和NPB-ORF-R：5’-CTGTCGGCTTCACTGCTCAGTCTGC-3’（SEQIDNO：5）来克隆NPBORF序列。PCR反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃15s，复性58℃15s，延伸72℃30s，40个循环；延伸72℃10min，4℃保存。在第一轮出现500bp的预期条带，如果图4-1所示。第二轮出现400bp的预期条带，如图4-2所示，经回收测序为409bp，。

NPB的ORF长度为387bp（SEQIDNO:1），编码一个128个氨基酸的前体蛋白（SEQIDNO：2）。这个前体蛋白包括一个推测的25个氨基酸的信号肽和29个氨基酸的成熟肽（SEQIDNO：3），以及末尾74个功能不详的氨基酸。

实施例2鞍带石斑鱼NPBmRNA的组织分布状况

为了探讨NPB基因在鞍带石斑鱼不同组织中的分布状况，我们从3条体重约50g左右的鞍带石斑鱼中取了端脑（Telencephalon,Tel）、中脑（Diencephalon,Die）、小脑(Cerebellum,Cer)、下丘（Hypothalamus,Hyp）、垂体（Pituitary,Pit）、延髓（Medulla,Med）、脊髓（Spinalcord，Spi）、鳃（Scale，Sca）、头肾（HeadKidney，HK）、肾（Kidney，Kid）、胸腺（Thymusgland，TG）、脾脏（Spleen，Spl）、心（Heart，Hea）、肝（Liver，Liv）、胃（Stomach，Sto）、肠（Intestine，Int）、脂肪（Fat,Fat）、肌肉（Muscle，Mus）和性腺（Gonald，Gon）共19种组织，利用Invitrogen公司的Trizol提取获得总RNA，利用M-MLV，通过RT-PCR把各个组织总RNA合成第一链cDNA。根据克隆所得NPB的ORF片段，设计了基因特异性上游引物NPB-Q-F：5’-AACTCGTGTTCCCCATCGTG-3’(SEQIDNO：6)和下游引物NPB-Q-R：5’-CAGGCATGGTCTTCAGGATG-3’(SEQIDNO：7)。以各个组织的cDNA为模板，利用Real-timePCR技术检测NPB在鞍带石斑鱼中枢及外周不同组织中的表达丰度。Real-timePCR的反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃15s，复性58℃15s，延伸72℃30s，40个循环；然后是56℃-99℃的溶解曲线分析；4℃，保存。实验结果显示，NPB主要在鞍带石斑鱼中枢神经系统中表达，其中在下丘、延髓和脊髓中的表达量较高；NPB在所检测的外周组织中均有表达，但表达量都较低（图5）。

实施例3鞍带石斑鱼NPB成熟肽（NPB29）的生物学功能研究

根据克隆所得NPB的ORF核苷酸序列推导出相应的氨基酸序列，利用软件预测及序列比对的方法，我们推断出鞍带石斑鱼NPB的成熟肽序列（NPB29）：WYKQMAGPSYYSVGRASGLLSGIRRSPYI。利用人工合成的方法得到了NPB29多肽蛋白，通过腹腔注射在体实验，我们探讨了NPB29对石斑鱼摄食和能量代谢的影响。

实验所用鞍带石斑鱼取自海南省，平均体重30g~60g，体长10~13cm，驯养于循环海水养殖系统，自然光照，每天早9：30和下午4：00分别进行饱食投喂，驯养一周，在注射实验进行前，对实验用鱼进行饥饿1天处理，以利于实验结果的观察，同时还可排除饲料投喂不均匀所造成的影响。在注射实验当天，实验鱼随机分成5组，每组40条，分别注射0ng/gB.W.，10ng/gB.W.，100ng/gB.W.，1000ng/gB.W.的NPB29，NPB29用1ΧPBS稀释，对照组0ng/gB.W.注射PBS。每组注射后在0h、3h、6h、12h的时间点取每条鱼的脑（不包括下丘脑）和下丘脑组织，立即放于液氮中速冻，随后保存于-80℃备用。利用Invitrogen公司的Trizol提取获得所取组织总RNA，利用M-MLV，通过RT-PCR把总RNA反转录成为第一链cDNA。以这些cDNA为模板，利用Real-timePCR技术检测NPB29对目标基因食欲素和瘦素表达的调控作用。Real-timePCR的反应条件为：预变性94℃3min；变性94℃15s，复性56℃15s，延伸72℃30s，40个循环；然后是56℃-99℃的溶解曲线分析；4℃，保存。

鞍带石斑鱼NPB29对促摄食因子食欲素（Orexin）基因表达的影响：根据石斑鱼OrexinORF核苷酸序列，设计了该基因特异性上游引物(Orexin-Q-F:5’-'TGTTGCTTTGTCGCTCTGG-3’)和下游引物(Orexin-Q-R:5’-TCTTCAGTCCTCTTGCCCAT-3’）。以腹腔注射所取脑组织的cDNA为模板，通过Real-timePCR技术，我们检测了不同剂量NPB29在不同时间点对石斑鱼Orexin的影响。Orexin是一种主要在下丘脑表达的神经肽，又称为食欲素或下丘脑泌素，它具有调节机体摄食行为，糖脂代谢和睡眠觉醒等多种功能。我们的研究结果显示，在注射12小时后，10ng/gBW和100ng/gBW的NPB29能够显著促进石斑鱼orexinmRNA的表达，说明NPB对石斑鱼的摄食和/或代谢有调控作用（图6）。

鞍带石斑鱼NPB29对瘦素B（LeptinB）基因表达的影响：瘦素（Leptin）是肥胖基因（OBgene）编码的激素样细胞因子，在哺乳动物中，Leptin由单拷贝基因编码，因而只有一种形式。而在硬骨鱼中，由于基因组复制，在很多鱼类中都发现了两种类型的Leptin，命名为LeptinA和LeptinB。两种Leptin的组织表达谱在不同鱼类中有所不同。在斜带石斑鱼中，LeptinA主要在肝脏中表达，而LeptinB则在脑区中的表达丰度较高。研究显示Leptin作用于下丘脑的代谢调节中枢，发挥抑制食欲，减少能量摄取，增加能量消耗，抑制脂肪合成的作用。本研究中，根据石斑鱼LeptinBORF的核苷酸序列，设计了该基因的特异性上游引物（LeptinB-Q-F:5’-CTCCTTCGCCCTCACCAT-3’）和下游引物（LeptinB-Q-R:5’-AATAAACTTCTCCAGGTAGCG-3’）。利用腹腔注射实验所取脑组织（下丘脑除外）的cDNA为模板，通过Real-timePCR技术，检测了不同剂量NPB29注射后在不同时间点对石斑鱼LeptinB基因表达的调控作用。结果显示，与对照组相比，当分别注射100ng/gBW和1000ng/gBW的NPB293小时后，以及注射1000ng/gBW的NPB296小时候，石斑鱼脑区LeptinBmRNA的表达均有显著提高，说明LeptinB在石斑鱼脑区参与了摄食和/或脂肪代谢的调控（图7）。

SEQUENCELISTING

序列表

<110>中山大学

<120>鞍带石斑鱼神经肽BcDNA序列及其成熟肽对摄食和代谢的作用

<130>NPB-29

<160>7

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>387

<212>DNA

<213>鞍带石斑鱼NPBORF

<400>1

atggacatgcccgctaaactcgtgttccccatcgtggtgatctccgtgctggtggcttgc60

agtccgacggaggcgtggtacaagcagatggccggtccgagctactactcagtgggcagg120

gcgtccggcttgctgtccggaatccggaggtcaccgtacatcaggagagccgagccgcag180

ccgtcagacggcgaagagctggcgactaacaacgtgtttcctgagttcactgcgcagagt240

tacatcctgaagaccatgcctgtttgcatcaaagacatcacaccaaacctgcagagctgt300

gaactcttccaggcaacgaagggttcatttaagtgcaaagcggacatcttcctcactctg360

gactccgcagactgtgcagcagactga387

<210>2

<211>128

<212>PRT

<213>鞍带石斑鱼NPB前体氨基酸序列

<400>2

MetAspMetProAlaLysLeuValPheProIleValValIleSer

151015

ValLeuValAlaCysSerProThrGluAlaTrpTyrLysGlnMet

202530

AlaGlyProSerTyrTyrSerValGlyArgAlaSerGlyLeuLeu

354045

SerGlyIleArgArgSerProTyrIleArgArgAlaGluProGln

505560

ProSerAspGlyGluGluLeuAlaThrAsnAsnValPheProGlu

657075

PheThrAlaGlnSerTyrIleLeuLysThrMetProValCysIle

808590

LysAspIleThrProAsnLeuGlnSerCysGluLeuPheGlnAla

95100105

ThrLysGlySerPheLysCysLysAlaAspIlePheLeuThrLeu

110115120

AspSerAlaAspCysAlaAlaAsp

125

<210>3

<211>29

<212>PRT

<213>鞍带石斑鱼NPB成熟肽（NPB29）氨基酸序列

<400>3

TrpTyrLysGlnMetAlaGlyProSerTyrTyrSerValGlyArg

151015

AlaSerGlyLeuLeuSerGlyIleArgArgSerProTyrIle

2025

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>NPB人工引物

<400>4

ctcgacatggacatgcccgctaa23

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>NPB人工引物

<400>5

ctgtcggcttcactgctcagtctgc25

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>NPB人工引物

<400>6

aactcgtgttccccatcgtg20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>NPB人工引物

<400>7

Caggcatggtcttcaggatg20