一种突变型Sus scrofa猪源胰蛋白酶及其编码基因及获取方法和应用

摘要

本发明涉及一种突变型Sus？scrofa猪源胰蛋白酶及其编码基因及获取方法和应用，对原有的野生型Sus？scrofa猪源胰蛋白酶酶进行突变，得到热稳定性显著提高的突变酶，提供编码上述胰蛋白酶突变体的编码基因、氨基酸序列和胰蛋白酶酵母工程菌的构建方法。氨基酸序列为SEQ？ID？NO.1；编码中所述蛋白质DNA序列为SEQ？ID？NO.2。本发明为生物法产蛋白酶的研究、开发、生产工作奠定了基础，有利于早日实现生物制革的清洁、低能耗，及皮革的生物安全性的生产。应用该菌种生产猪胰蛋白酶，产量相对较高、工艺相对简单，便于工业化应用。

说明书

技术领域

本发明涉及分子酶学与生物技术，更具体涉及一种高热稳定性高活性Susscrofa猪源胰蛋白酶的编码基因以及该酶的获取方法金和应用。

背景技术

胰蛋白酶(EC.3.4.21.4)系一种223个氨基酸残基组成的单链丝氨酸蛋白酶，其前体胰蛋白酶原包含一段15个氨基酸组成的的信号肽，其后还包含一段8个氨基酸的前导肽，即酶原激活肽。胰蛋白酶原产生于脊柱类动物胰脏细胞中细胞粗面内质网上的核糖体，经过高尔基体的运输，进入胰腺运输管，最终被释放到肠腔，在肠腔里利用十二指肠肠粘膜细胞所分泌的肠激酶特异性识别胰蛋白酶原序列N端短肽链DDDDK，并切开DDDDK序列中赖氨酸C端，切除其以Lys-Ile为分割的前导肽，导致胰蛋白酶原三维结构改变，可特异性激活胰蛋白酶原成为具有催化活性的胰蛋白酶。

作为一种重要工具酶，胰蛋白酶作用温和，且高效无污染，已被广泛应用于各个领域。如在医学领域，胰岛素原转化为胰岛素的应用，用作口服药治疗肠胃紊乱，用作消炎药减轻炎症，用作清创剂，可清除创伤部位坏死的组织，也可用作血栓溶解剂治疗血栓紊乱。在食品应用领域，可水解一些食品工业里重要的动植物蛋白，如蚂蚁蛋白，蚕蛹蛋白及植物叶蛋白等等。另外，胰蛋白酶也广泛用于多种生物技术过程，例如表面附着细胞的分离，流感病毒的生产，荷尔蒙的水解和用于产生其他蛋白。

Ω-loop是蛋白质表面的一种非常规的二级结构形式，通常由6～16个氨基酸残基构成，因结构类似希腊字母Ω而得名。Ω环盖子结构相比于α-螺旋，β-折叠，reverseturn等结构含有更少的氢键，因此具有很高的灵活性。通常Ω-loop与蛋白质功能及分子的识别有关，当底物或者抑制物与其结合后Ω-loop灵活性才会得到控制。这一结构在诸多酶分子结构中发现，对于酶催化反应来说具有极其重要的意义。诸多文献酶活性区Ω-loop点突变结果表明,不同的突变选择对于蛋白质稳定性，如解折叠T_m值，会有不同程度的影响。

毕赤酵母中N糖基化是蛋白质翻译后的常见修饰，潜在的糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr,Xaa代表除脯氨酸外的任意氨基酸)的天冬酰胺约70％-90％是N糖基化的，若Xaa位置为Pro脯氨酸，疏水氨基酸如色氨酸或苯丙氨酸，则糖基化作用是受抑制的，带负电氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸会部分抑制糖基化，然而正电荷氨基酸如赖氨酸，组氨酸和精氨酸则会促进糖基化作用。N糖基化修饰的起始位置在内质网，由长醇焦磷酸盐引导寡糖单位Glc₃Man₉GlcNAc₂(其中Glc＝葡萄糖；GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，Man＝甘露糖)连接于天冬酰胺的酰胺基上。随后寡糖连修整成为Man₈GlcNAc₂。有文献报道，糖链的连接对于蛋白质的区域稳定性具有重要作用。

在胰酶酶切后未知蛋白短肽质谱分析中，未知蛋白质需经变性后才能有效被切割。变性蛋白通常是通过加入化学试剂，增加额外工序，这样就使得分析步骤复杂化。如果在高温条件下胰酶能保持活性，那么未知蛋白在高温解折叠的同时进行酶切反应将会避免变性剂的使用，这样则大大简化后续分析。同时，胰酶也是潜在的药用蛋白，糖基化蛋白可能降低蛋白质的免疫原性，提高其药用价值。所以，总得来说，如果能通过糖基化的方法提高胰蛋白酶热稳定性，那么将突破胰酶的应用瓶颈，提高胰酶的实用价值。因此有必要针对胰酶热稳定性进行理性设计探索，以期提高其热稳定性。

发明内容

本发明的第一个要解决的技术问题是进一步提高胰蛋白酶的稳定性，对原有的野生型Susscrofa猪源胰蛋白酶酶进行突变，得到热稳定性显著提高的突变酶，提高其应用价值。

本发明的第二个要解决的技术问题是提供编码上述胰蛋白酶突变体的编码基因。

本发明的第三个要解决技术问题是提供一种胰蛋白酶酵母工程菌的构建方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种具有Susscrofa猪胰蛋白酶活性的蛋白质,其氨基酸序列为SEQIDNO.1。

本发明的技术方案概述如下：

第一步热稳定性提高的胰蛋白酶重组质粒的构建

(1)在所构建的野生型重组Susscrofa猪源胰酶原表达载体pPIC9K-rpTry(由北京金唯智有限公司全基因合成)的基础上，去除原基因N端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点(DDDDK)。缩短后的Susscrofa猪源胰蛋白酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点。

(2)围绕Susscrofa猪源胰蛋白酶活性区氨基酸Asp89所在Ω环(His78～Met91)及侧翼链，以糖基化识别序列Asn-Xaa-Ser/Thr为模板，故选取距离活性位点氨基酸Asp89较近的82位Asn作为拟糖基化位点。

(3)为了突出糖基化的作用，尽量减少突变所造成的蛋白质原始结构破坏，在依据糖基化识别序列Asn-Xaa-Ser/Thr对原始序列进行改造中，Ser在Ω环中的出现频率比Thr出现频率高^[124]，故最终确定的拟突变位点为N84S。

编码中所述蛋白质的基因，DNA序列为SEQIDNO.2。

重组载体获取方法步骤如下：

1)含有野生型Susscrofa猪胰蛋白酶基因的重组载体的构建：

(1)以含有Susscrofa猪胰蛋白酶基因的质粒pPIC9K-rpTry的核苷酸序列，结合质粒pPIC9K(实验室自备)的多克隆位点与Susscrofa猪源胰蛋白酶基因的限制性内切酶位点设计引物；

(2)以含有Susscrofa猪源胰蛋白酶基因的质粒pPIC9K载体为模板，进行PCR扩增；含有Susscrofa猪源胰蛋白酶基因的PCR扩增产物纯化后，用限制性内切酶EcoRI和NotI(购自Thermo公司)进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pPIC9K用T4连接酶(购自Thermo公司)进行连接；连接产物转化进入大肠杆菌TOP10(购自康为世纪有限公司)；

(3)在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素(购自鼎国昌盛有限公司)的LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，提取质粒；利用EcoRI和NotI进行双酶切验证；验证成功的克隆子进行测序验证；

2)快速定点突变方法引入突变位点：

(1)设计引物，引物中包含使猪胰蛋白酶基因中84位天冬氨酸密码子改变为丝氨酸密码子的突变点；

(2)以上述步骤1)获取的含有野生型Susscrofa猪源胰蛋白酶基因的表达载体为模板，进行PCR扩增，扩增产物为突变型重组表达载体pPIC9K-rpTry-N84S；该突变型重组表达载体内含有SEQIDNO.2所示DNA序列。

第二步热稳定性提高的胰蛋白酶工程菌的构建

将突变后的重组质粒pPIC9K-rpTry-N84S经SalI酶切线性化电击转入GS115毕赤酵母(实验室自备)，构建高效表达类胰蛋白酶的组成型毕赤酵母突变菌株。

毕赤酵母转化常采用的是电转方法

酵母感受态细胞的制备

接种50ul保存酵母GS115菌液于5mlYPD培养基，30℃，300rpm，摇21h，至OD₆₀₀至1.0；取100ul活化菌液，分别接种于2瓶盛有100mlYPD液体培养基的500ml三角瓶，30℃，过夜至OD₆₀₀＝1.0～1.3(16h左右)(测量OD时，需用无菌YPD稀释菌液值OD值在0.2～0.8之间，再乘相应稀释倍数，一般按菌液：无菌YPD＝1:5稀释)；4℃，1500g/5000rpm，离心5min，弃上清；100ml冰预冷无菌水重悬菌体；4℃，1500g/5000rpm，离心5min，弃上清；10ml冰预冷1M山梨醇重悬菌体；4℃，1500g/5000rpm，离心5min，弃上清；50ml冰预冷无菌水重悬菌体；4℃，1500g/5000rpm，离心5min，弃上清；10ml冰预冷1M山梨醇重悬菌体；4℃，1500g/5000rpm，5min，离心，弃上清(用移液枪吸除上清)；200μl冰预冷1M山梨醇重悬菌体，无菌预冷的1.5mlEp管，按每管80μl分装，以备转化(加上菌体体积，预计100ml培养液得到400μl感受态，能转化5杯)。

注：感受态细胞尽量现用现做，尽量不放置于-80℃保存。

线性化重组载体电转化酵母GS115感受态

实验前一天，用75％酒精浸泡电转杯3～4h，超声震荡处理3～4min，用去离子水冲洗干净，将点转杯及杯帽放置于超净台上，紫外照射过夜。同时提前将MD平板做好，封口膜封板，放于4℃，保存备用，使用时事先将平板取出，放置于超净台上，升温至室温；将80μl酵母感受态细胞与5～10μg线性化质粒混合，放入冰预冷的0.2cm电转杯中；将上述电转杯在冰上孵育15min，迅速进行电转。电转条件：电压1.5kV，电阻400Ω，电容25μF，电击持续5.0msec；迅速加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液，转移至1.5ml无菌Ep管中，30℃静置培养1h；取上述转化液涂MD固体培养基，每板约250μl，30℃避光培养，2～3天可见菌落。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产热稳定性提高的胰蛋白酶的方法，具体方法如下：

将上述酵母工程菌接种至250mL三角瓶，装液量50mL的BMGY培养基，培养温度为30℃，摇床转速250r/min，培养至OD600＝2-6(对数生长期，16-18h)；室温1500-3000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，接种至500mlBMMY培养基，至OD600＝1.0，进行诱导表达，发酵温度30℃，摇床转速250r/min，发酵时间为72h。

培养基的组成

诱导表达培养基BMGY：1L：酵母粉10g，蛋白胨20g，溶于700ml去离子水，121℃湿热灭菌20min，冷却后加入100ml1M，pH6.0，磷酸钾缓冲液，100ml10×YNB，2ml500×B，100ml10×GY，4℃保存，存2个月。

诱导表达培养基BMMY：1L：酵母粉l0g，蛋白胨20g，z溶于700ml去离子水，121℃湿热灭菌30min，冷却后加入100ml1MpH3.0，磷酸钾缓冲液，100ml10×YNB，2ml500×B，100ml10×M，4℃保存，存2个月。

种子培养基：YPD培养基

发酵培养基(ml，g/L)：H3PO426.7ml；CaSO40.93g；K2SO418.2g；MgSO4·7H2O14.9g；KOH4.13g；甘油40g(31.67ml)；PTM14.35ml，氨水调制pH5.0,定容1L。

PTM1微量元素溶液(ml，g/L)：CuSO4·5H2O6.0g；KI0.08g；MnSO4·H2O3.0g；Na2MoO4·2H2O0.2g；H3BO30.02g；CoCl20.5g；ZnCl220.0g；FeSO4·7H2O65.0；Biotin0.2；H2SO45.0ml；混匀过滤除菌，4℃，避光保存。

甘油补料培养基：甘油50％，PTM14.35ml/L。

甲醇补料培养基：甲醇100％，PTM14.35ml/L。

胰蛋白酶的酶活测定

胰蛋白酶测定的基本原理

胰蛋白酶作为一种蛋白质水解酶，除了能水解碱性氨基酸和其它氨基酸所形成的肽键之外,还能够水解碱性氨基酸形成的酯键，催化活性具有高度专一性。

因此，可以利用人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-argineethylester,简称BAEE)为底物测定胰酶的活性.N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)能在碱性条件下，在胰蛋白酶水解作用下，去除一个乙基而生成N-苯甲酰-L-精氨酸(BA),催化反应原理。

发酵液蛋白质含量测定

发酵液经截留分子量为10kDa的超滤管超滤后，更换成等体积的测定酶活时溶解BAEE底物所用缓冲液。用北京鼎国生物技术有限公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒进行浓度测定，以BSA作标准曲线。蛋白质定量后配置50ug/ml蛋白液。

酶活测定步骤

首先，BAEE底物溶液需要在25℃条件下提前水浴处理。3.0mlBAEE底物溶液与100μl1mMHCl水溶液预混于石英比色皿中。将肠激酶处理过的胰蛋白酶溶液加到盛有上述预混液的比色皿(比色皿光程为1cm)，迅速放至紫外分光光度计检测槽中，开始测定反应液在253nm处的吸光值变化，根据反应液在253nm处每分钟吸光度的变化值ΔOD253/min，利用如下公式(2-1)计算胰蛋白酶酶活：

$BAEEunits(U/ml)=\frac{\Delta OD253\min \times df}{0.001\times 0.1}---(2-1)$

注：df，稀释因子，本测定体系df为32

最终结果验证，突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶的半衰期相比于野生型提高了177.89min。突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶的活性较野生型亦提高了1.18倍。

因而，本发明有效地提供了一种构建一株高效分泌表达热稳定性高的Susscrofa猪胰蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌的方法，得到热稳定性显著提高的突变酶，提高该酶的应用价值。本发明为生物法产蛋白酶的研究、开发、生产工作奠定了基础，有利于早日实现生物制革的清洁、低能耗，及皮革的生物安全性的生产。应用该菌种生产猪胰蛋白酶，产量相对较高、工艺相对简单，便于工业化应用。

附图说明

图1重组载体pPIC9K-rpTry构建示意图；

图2突变载体测序结果；

图3突变重组载体SalI线性化1:N84S未通过酶切线性化；2:N84S通过酶切线性化；M：Marker；

图4酶切特异性初步验证1:WT；2:WT+RNaseA；3:N84S；4:N84S+RNaseA；5:RNaseA；

图5野生型及突变型胰蛋白酶失活曲线比较；

图6野生型及突变型胰蛋白酶失活半衰期测定；

图7最适反应温度测定。

具体实施方式

(1)野生型Susscrofa猪源胰蛋白酶原表达载体的构建

所构建野生型重组猪源胰酶原表达载体pPIC9K-rpTry载体由北京金唯智有限公司全基因合成，如图1所示。其中去除了原基因N端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点(DDDDK)。缩短后的Susscrofa猪源酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点。

(2)Quick-ChangePCR技术获得突变载体

按照TransGenFastMutagenesisSystem试剂盒引物设计原则，我们针对突变N84S进行了突变引物设计，见表1-1。PCR反应聚合酶为Thermo公司的PhusionHigh-fidelityDNApolymerase.PCR体系建立如表1-2。

表1-1定点突变所用引物

Table1-1Primersforsite-mutation

表1-2快速定点突变PCR反应体系

Table1-2Reactionsystemofsite-mutation

反应设定如下：98℃预变性30s，98℃变性15s，X℃退火20s，72℃延伸5min，从变性到延伸共15个循环，循环后再72℃延伸10min，最终4℃保存。其中退火温度参考引物合成Tm。

突变后的载体经DMT酶(购自NEB公司)消化，去除非突变重组pPIC9K-rpTry载体。消化后的载体转化大肠杆菌TOP10菌株(康为世纪(北京)生物科技有限公司)中，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑取LB上的单克隆菌株利用TianGen质粒小提试剂盒(天根(北京)生物有限公司)提取突变载体，并送外利用通用引物测序。反馈结果显示，突变成功，如图2所示。

(3)突变酵母菌株的获得

将上述测序正确载体pPIC9K-rpTry-N84S经SalI酶线性化，如图3所示，然后转化入酵母GS115感受态细胞，并涂布于MD固体培养基中，30℃培养2～3天。待菌落长出后，将MD固体培养基上菌株用无菌水收集于无菌EP管中。并涂布于含有1.0mg/mlG418的YPD-G418抗性培养基上，30℃培养3～4天。待菌落长出后，挑取单菌落于5mlYPD种子培养基中，30℃过夜培养至OD600＝1.0，提取突变菌基因组，进行表型鉴定。

(4)突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶菌株表达及糖基化验证

上述表型鉴定呈阳性菌落将种子培养基按1：100(v:v)接种于100mlBMGY培养基中，30℃过夜培养OD₆₀₀至1.0。8000rpm，常温，离心10min。菌体沉淀用BMMY诱导培养基进行诱导，诱导条件为：甲醇添加量1.0％，诱导培养基BMMYpH3.0，诱导时长120h。发酵液8000rpm，离心10min，去除菌体，上清液利用截留分子量为10kDa的超滤管进行缓冲液的更换。所更换的缓冲液为67mMNaH2PO4，pH7.6。

更换缓冲液的样品按照如下体系(表1-3)首先进行变性处理，孵育温度为100℃，煮沸10min，然后按照表1-4体系进行去糖基化处理，37℃孵育时间为1h。所用的去糖基化酶EndoH为NEB公司生产。

表1-3样品变性处理体系

Table1-3Systemfordenaturation

表1-4样品去糖基化处理体系

Table1-4Systemfordeglycosylation

结果显示，突变体形成糖基化。

(5)突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶的活性检测

将突变体产生诱导发酵液，8000rpm，离心10min，将上清保留。然后利用截留分子量为10kDa的超滤管进行缓冲液(配制BAEE底物溶液所用缓冲液)更换，2500g，离心20min，直至发酵液颜色不再改变。利用BCA蛋白质浓度测定试剂盒对更换缓冲液后的样品进行蛋白质浓度测定。根据测定结果，将蛋白质浓度统一至200ug/ml。然后，对胰蛋白酶原利用肠激酶酶切激活的最佳时间进行测定(即活性达到最大是的激活时间)，激活体系为100ul样品加2ul肠激酶，肠激酶来自上海生工有限责任公司，25℃孵育，每10min测定一次样品活性。

首先，BAEE底物溶液需要在25℃条件下提前水浴处理。3.0mlBAEE底物溶液与100ul1mMHCl水溶液预混于石英比色皿中。将肠激酶处理过的胰蛋白酶溶液加到盛有上述预混液的比色皿(比色皿光程为1cm)，迅速放至紫外分光光度计检测槽中，开始测定反应液在253nm处的吸光值变化酶活的计算公式同公式2-1。

通过计算，突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶的酶活为12596.666667U/ml，野生型Susscrofa猪源胰蛋白酶的酶活为11520U/ml。可见，突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶的酶活要高于野生猪源胰蛋白酶的酶活。

(6)突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶的酶切特异性检测

对野生型及突变型胰蛋白酶样品的酶切特异性进行检测，所用的底物蛋白为RNaseA蛋白，RNaseA来自北京全式金生物技术有限公司，分子量大小为13.7kDa。酶切反应体系按质量比(胰蛋白酶：RNaseA＝1:500)进行，37℃，反应时间为3h。反应结束后对反应液进行SDS-PAGE分析。如图4所示。

进一步分析，第5泳道为RNaseA(不添加任何猪源胰蛋白酶)，作为空白对照，另一组对照第2泳道为RnaseA与野生型Susscrofa猪源胰蛋白酶作用后的，而实验组第4泳道RNaseA与突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶作用后的反应物相比，从图4可以看出两种酶都能对RNaseA进行反应，即黑色区域变淡，因而可知与野生型Susscrofa猪源胰蛋白酶相比，突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶的酶切特异性未发生改变。

(7)野生型及突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶的热稳定性测定

蛋白质热稳定性与其活性有关，主要指其在经历不可逆失活之前保持其活性的时间。对热稳定性的检测，我们主要考察了野生型及突变型胰蛋白酶的失活半衰期t_1/2及最适反应温度T_opt。

失活半衰期t_1/2的测定方法是，利用肠激酶激活胰蛋白酶样品，激活时间为上述最佳时间。然后在50℃条件下孵育，按照孵育时间0min，30min，60min，120min，180min的时间点取出一定样品，冰浴30s，测定一次酶活。以孵育前的酶活为100％，根据实际酶活计算不同孵育时间点酶残留活性百分比。以酶残留活性自然对数为纵坐标，孵育时间t为横坐标，进行线性拟合。其斜率即为失活速率常数kd，利用如下公式计算其半衰期。

半衰期计算公式t_1/2＝ln2/kd(7-1)；

野生型及突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶原在最佳时间的肠激酶激活，对应的野生型最佳激活时间为240min，突变N84S的最佳肠激酶激活时间为240min。迅速转移至50℃条件下孵育，每5min测定样品的酶活性，得到失活曲线，如图5所示。

从图中可以看出野生型失活速度较N84S失活速度快，50℃放置60min后，野生型胰蛋白酶保持了77.55％的残留活性，而N84S保持了85.42％的残留活性。

利用上述失活曲线测定的活性相对值，以Ln(相对活性)为纵坐标，以时间为横坐标，利用Origin9.0进行线性拟合，如图6所示。按照上述公式(7-1)计算野生型及突变型胰蛋白酶在50℃条件下的半衰期。野生型Susscrofa猪源胰蛋白酶的半衰期t_1/2为155.35min，突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶的半衰期t_1/2为333.24min。突变型N84S相比于野生型则提高了177.89min。

最适反应温度的测定方法是，将BAEE酶活测定底物溶液分别放置于25℃，27℃，29℃，31℃，33℃，35℃，37℃，39℃，41℃，43℃，45℃，47℃，49℃，51℃，53℃，55℃，57℃，59℃，61℃，63℃，65℃，75℃，80℃及85℃条件下孵育。胰蛋白酶原样品按照最佳肠激酶激活时间进行激活，然后分别利用上述预孵育的底物溶液进行酶活测定，酶活性最大的温度即为最适反应温度T_opt。

实验对野生型及突变型N84S最适反应温度测定，结果如图7所示，以胰蛋白酶的BAEE酶活性为纵坐标，以反应体系温度为横坐标，结果显示，随着反应温度的增加，其BAEE活性正相关的增加。当反应体系温度达到65℃后，野生型及突变型N84S均存在一定的酶反应活性。当温度提升到75℃后野生型胰蛋白酶表现出一定的抗热能力，活性达到20266.67BAEEu/ml，而N84S活性高达44373.33BAEEu/ml，说明在此温度下其野生型及N84S并未失活。但突变型Susscrofa猪源胰蛋白酶的活性较野生型提高了1.18倍。