一株用于生产固定化碱性果胶酶纳米微球的工程菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一株用于一步法生产碱性果胶酶固定化纳米微球的工程菌及其构建方法，属于固定化酶技术领域。本发明通过基因重组的方法构建了一株重组大肠杆菌菌株E.coli？BL21λ(DE3)pABC-PGL，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，菌种保藏号为CGMCC？NO.10911。本发明基于上述公开的重组大肠杆菌菌株生产固定化碱性果胶酶纳米微球的方法：利用基因融合的方法，将目前工业上广泛应用的碱性果胶酶基因通过连接肽融合到PHA合成酶基因phaC的N末端上，并将此重组基因片段转化至重组菌中进行诱导表达，重组菌体内就能合成表面带有碱性果胶酶的纳米微球复合体，这样碱性果胶酶就有效地结合到了纳米微球表面，形成固定化碱性果胶酶，一步实现碱性果胶酶的固定化生产。

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶技术领域，涉及一种一步法生产固定化碱性果胶酶的新方法，特别涉及一株用于一步法生产碱性果胶酶固定化纳米微球的工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

碱性果胶酶一般指聚半乳糖醛酸裂解酶(E.C.4.2.2.2,polygalacturonatelyase,PGL)，其最适pH值在8～10，可以在高pH条件下断开果胶聚合物主链，产生不饱和的寡聚半乳糖醛酸。该酶在工业领域是一种重要的新兴酶类，广泛应用于诱导植物抗病、果胶废水处理和咖啡茶的发酵等方面。近几年研究发现碱性果胶裂解酶是一种重要的清洁生产用酶，主要运用于纸浆漂白和纺织品的生物精炼等行业，通过酶解精炼替代传统的纺织精炼来解决环境和能源等问题，在质量与环保方面都具有传统工艺无法相比的优点。随着碱性果胶裂解酶新用途的不断出现，市场对该酶的需求量越来越大，因此，碱性果胶酯裂解酶是近年国外研究的热点课题。

为了提高碱性果胶酶的稳定性，促进其重复使用，便于连续的工业化生产，碱性果胶酶的固定化一直是人们关注的热点。传统的碱性果胶酶固定化方法主要包括：吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法等。但传统的固定化方法各有利弊：①吸附法虽制作条件温和、简便、成本低，但酶与载体结合不牢，易脱落。②共价键结合法和交联法虽然酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。③包埋法虽未受到化学反应影响，可以制得较高活力的固定化酶，酶也不易脱落，但将酶限制在一定的载体内，使酶与底物结合的范围变小，影响了酶活性的发挥。同时，传统的固定化工艺大致可以分为三步：酶的分离提纯，载体制备以及酶与载体的结合；工艺复杂，成本高，酶活力回收率低。这些都限制了碱性果胶酶的工业化生产与应用。因此，探索廉价、高效、应用性强的固定化碱性果胶酶生产的新方法，是打破目前固定化酶的技术瓶颈，解决固定化碱性果胶酶工业化生产及应用的关键。

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是很多细菌在营养失衡的情况下合成的一种细胞内聚酯，球形，直径约50～300nm，该球形的细胞内聚酯由一个疏水的PHA核心和由磷脂界膜及膜上嵌入或附着蛋白构成。PHA合成酶phaC是PHA生物合成和纳米微球形成的关键酶，通过共价键与PHA分子主链合成末端相连，从而定位于PHA纳米微球的表面。

近年来，随着分子生物学的发展，将外源功能蛋白与PHA聚合酶进行融合表达，在重组微生物体内就能合成表面带有功能蛋白的纳米微球复合体，这样功能蛋白就高效地结合到了纳米微球表面，形成功能性微球。由于纳米微球在微生物细胞内是以单独的包涵体形式存在，因此通过细胞破碎和离心的方法就能简便、有效地使其从细胞中分离并得到纯化。目前，通过将抗体结合结构域、生物活性多肽分子、抗原片段等与PHA聚合酶PhaC的融合表达，已成功制备了用于生物分离、蛋白纯化、药物传递、疾病诊断和酶的固定化的生物活性微球，使其成为一种廉价、高效的蛋白固定化呈递新技术。

目前，利用该技术进行固定化碱性果胶酶的一步法生产还未见报道。

发明内容

为了克服现有固定化酶技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一株用于一步法生产碱性果胶酶固定化纳米微球的工程菌及其构建方法与应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一株重组大肠杆菌菌株，该大肠杆菌菌株命名为E.coliBL21λ(DE3)pABC-PGL，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.10911。

本发明还公开了上述重组大肠杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1)将PHA前体合成酶基因phaAB、碱性果胶酶基因pgl和连接肽linker的融合基因pgl-linker以及PHA合成酶基因phaC依次插入载体质粒pCDFDuet-1中，构建得到重组质粒pABC-PGL；

(2)将重组质粒pABC-PGL转化大肠杆菌E.coliBL21λ(DE3)，得到基因工程大肠杆菌菌株E.coliBL21λ(DE3)pABC-PGL。

碱性果胶酶基因pgl选自枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。

PHA合成酶基因phaC来源于Ralstoniaeutropha。

步骤(1)构建重组质粒pABC-PGL的具体操作包括如下步骤：

1)利用PCR扩增得到PHA前体合成酶基因phaAB，然后采用限制性内切酶切割载体质粒pCDFDuet-1和PHA前体合成酶基因phaAB，将PHA前体合成酶基因phaAB插入载体质粒pCDFDuet-1中，得到载体质粒pAB；

2)采用限制性内切酶切割载体质粒pAB和基因pgl-linker，然后将基因pgl-linker插入质粒pAB中，得到载体质粒pAB-PGL；

3)利用PCR扩增得到phaC基因，然后采用限制性内切酶切割载体质粒pAB-PGL和基因phaC，将基因phaC插入载体质粒pAB-PGL中，得到重组质粒pABC-PGL。

所述碱性果胶酶基因pgl和连接肽linker的融合基因pgl-linker的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；PHA合成酶基因phaC的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明还公开了基于上述公开的重组大肠杆菌菌株一步法生产固定化生产碱性果胶酶纳米微球的方法，将重组大肠杆菌E.coliBL21λ(DE3)pABC-PGL菌株在矿物质培养基中进行诱导表达培养后，再经分离提纯，获得碱性果胶酶纳米微球。

所述将重组大肠杆菌E.coliBL21λ(DE3)pABC-PGL菌株在矿物质培养基中进行诱导表达，具体操作为：

首先，将重组大肠杆菌E.coliBL21λ(DE3)pABC-PGL菌株在LB培养基中过夜培养作为种子液，再按2％的接种量将种子液接入装有100mLMM培养基的500mL三角瓶中，其中MM培养基另加入1g/L的葡萄糖、100mg/L的Streptomycin和0.2g/L的IPTG，30℃、200rpm/min的条件下培养48小时；

其中0.5g/L的葡萄糖、Streptomycin及IPTG在培养开始时加入，另0.5g/L的葡萄糖在培养24小时后加入。

所述分离提纯，具体操作为：

收集发酵液，离心，弃上清；用10mM磷酸缓冲液对菌泥进行充分洗涤，再将菌泥重悬于10mM磷酸缓冲液中；然后，超声破壁处理20分钟；通过甘油密度梯度离心的方法从菌体细胞裂解液中纯化微球，并用50mM磷酸缓冲液对纯化的微球进行充分洗涤，去除甘油残留；最后经冷冻干燥得到碱性果胶酶固定化纳米微球固体粉末。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明通过基因重组的方法构建了一株重组大肠杆菌E.coliBL21λ(DE3)pABC-PGL，该重组大肠杆菌将目前工业上广泛应用的碱性果胶酶基因融合到PHA合成酶基因phaC的C末端上，并将此重组基因片段转化至宿主菌中进行诱导表达，宿主菌体内就能合成表面带有碱性果胶酶的纳米微球复合体，这样碱性果胶酶就有效地结合到了纳米微球表面，形成固定化碱性果胶酶，一步实现碱性果胶酶的固定化生产。该方法具有以下优势：

1、避免了传统方法的繁琐工序，使生产成本大大减低；

2、酶通过共价键与载体PHA相连，结合牢固，不易脱落；

3、酶在生产的同时实现固定化，酶的空间结构未受其他物理或化学因素破坏，制得的固定化酶活力较高；

4、酶连接在载体外部，酶与底物结合不受限，不影响酶活性的发挥；

5、由于纳米微球以单独的包涵体形式存在于细胞内，通过细胞破碎和离心的方法就能使其从细胞中分离，分离提取步骤简单、高效。

保藏说明

本发明对所述的重组大肠杆菌E.coliBL21λ(DE3)pABC-PGL进行了下述保藏：

保藏时间：2015年5月25日，保藏地点：中国，北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏号为CGMCCNo.10911。

分类命名为：大肠埃希氏菌，Escherichiacoli。

附图说明

图1为重组菌体内一步合成碱性果胶酶固定化纳米微球的模型图；

图2为重组质粒pABC-PGL构建的技术路线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明提供的一步法生产碱性果胶酶生物固定化纳米微球的方法。参见图1，首先碱性果胶酶基因PGL通过一段连接肽融合到PHA合成酶基因phaC的N末端上，然后将此重组基因片段转化至大肠杆菌中进行诱导表达，当PHA合成酶phaC在重组微生物体内合成PHA微球时，碱性果胶酶PGL也跟着一起负载到了PHA微球表面，成为固定化的碱性果胶酶纳米微球一步实现碱性果胶酶的固定化生产。

1、重组大肠杆菌菌株的构建

1.1PCR扩增phaAB基因和phaC基因

根据pBHR68质粒(含有来源于Ralstoniaeutropha菌株的phaABC基因簇，由清华大学陈国强教授惠赠)中phaAB基因和phaC基因的DNA序列设计引物phaABEcoRI/phaABHindⅢ、phaCnostartXhoI/phaCstopAvrⅡ，分别扩增编码PHA前体合成酶基因phaAB和编码PHA合成酶基因phaC。

引物序列如下：

phaABEcoRI:TTGGAATTCTTGATGACTGACGTTGTCATCGTATCCG

phaABHindⅢ：ACTAAGCTTTCAGCCCATATGCAGGCCGC

phaCnostartXhoI：AAACTCGAGGCGACCGGCAAAGGCG

phaCstopAvrⅡ：TTTCCTAGGTCATGCCTTGGCTTTGACGTATCG

PCR反应体系(50μl)：5×SFBuffer(with10mMMgSO₄):10μl，dNTPMix(10mMeach):1μl，phaABEcoRI/phaABHindⅢ:各1μl或phaCnostartXhoI/phaCstopAvrⅡ:各1μl，PhantaSuperFidelityDNAPolymerase：0.5μl，pBHR68:0.3μl,DMSO:1.5μl,DDWupto50μl。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸5min。

1.2人工合成碱性果胶酶基因pgl-linker。

合成的pgl基因序列参考NCBI中B.subtilispelgene(GenBank:X74880)，去掉5’端的信号肽序列及3’端的终止密码子序列，并在3’端末尾加上一段由36个碱基编码的12个氨基酸的柔性linker(GGGSGGGSGGGGS)，使pgl基因和phaC基因用该linker连接在一起。

1.3表达质粒pABC-PGL的构建

将扩增得到的phaAB基因片段用凝胶分离纯化后，经EcoRI、HindⅢ酶双酶切，同时用EcoRI、HindⅢ双酶切表达载体pCDFDuet-1。双酶切后的PCR产物和载体经PCR产物纯化试剂盒(generay，GK2051)回收。将回收到的PCR产物和表达载体22℃连接3h，构建表达载体pAB，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子，并对阳性转化子做菌落PCR及酶切鉴定。

继续将合成得到的pgl-linker基因和上一步构建得到的表达载体pAB分别用BglⅡ、XhoI进双酶切。双酶切后的pgl-linker基因片段和载体经切胶回收，回收到的pgl-linker片段和表达载体pAB在22℃连接3h，构建表达载体pAB-PGL。然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子，并对阳性转化子做酶切鉴定。

最后将PCR扩增得到的phaC基因片段用凝胶分离纯化后，经XhoI、AvrⅡ双酶切。同时用EcoRI、HindⅢ双酶切表达载体pAB-PGL。双酶切后的PCR产物经经PCR产物纯化试剂盒回收，载体用切胶回收。将回收到的PCR产物和表达载体22℃连接3h，构建表达载体pABC-PGL，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子，并对阳性转化子做菌落PCR及酶切鉴定。

构建表达质粒的流程图如图2所示，其中：T7：T7启动子；phaA(Re):来源于R.eutropha菌株的β-酮基硫解酶基因；phaB(Re):来源于R.eutropha菌株的乙酰乙酰辅酶A还原酶基因；PGL：碱性果胶酶基因；PhaC(Re):来源于R.eutropha菌株的PHA合成酶基因；SmR：链霉素抗性基因。碱性果胶酶基因pgl和PHA合成酶基因phaC插入到第二个T7启动子下游，在T7启动子启动下表达出PGL-phaC融合蛋白。

1.4将表达载体pABC-PGL转化大肠杆菌E.coliBL21λ(DE3)

取100μl感受态细胞，加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min。将离心管42℃热激90s。快速将离心管放入到冰上，使其冷却2min。每管加入800μl不含抗生素的SOC培养基，于37℃摇床低速培养1h。低速离心，弃去约500μl上清，取剩余500μl菌液直接涂布于含100μg/ml链霉素的LB固体培养皿上。平板于37℃正向放置至液体被吸收，置平板于37℃培养18-24h。挑取单克隆进行酶切验证，并送至上海生工进行测序鉴定。

2、纳米微球在工程菌中的诱导表达及分离纯化

2.1纳米微球在工程菌内的诱导表达

含pABC-PGL质粒的表达宿主菌E.coliBL21λ(DE3)在LB培养基中培养过夜作为种子液，按照2％的接种量将种子液接种到100ml发酵培养基(矿物质培养基，表1)中，并加入葡萄糖(1g/L)、Streptomycin(100mg/L)和IPTG(0.2g/L)，30℃、200rpm培养48小时。其中0.5g/L的葡萄糖、Streptomycin及IPTG在培养开始时加入，另0.5g/L的葡萄糖在培养24小时后加入。

表1矿物质培养基配方

组分Ⅰ、Ⅱ配置时以蒸馏水为溶剂，组分Ⅲ、Ⅳ配置时以1mol/LHCl为溶剂。组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别在121℃下湿热灭菌20min，以防各组分成分之间在高温下发生反应。

1LMM培养基中：组分Ⅱ：840mL；组分Ⅰ：100mL；组分Ⅲ：10mL；组分Ⅳ：1mL；20％葡萄糖母液：25mL；50mMIPTG：2mL；Amp/Sm：2/1mL；20％葡萄糖母液(培养24h后加)：25mL。

2.2纳米微球的分离提纯

收集50mL发酵液，4000r/min离心10min，弃上清。10mM磷酸缓冲液将菌泥充分洗涤后，将菌泥重悬于15ml10mM磷酸缓冲液中。

菌悬液于400W冰浴超声20min，超声5S停5S，充分裂解菌体细胞。

15mL菌体裂解液进行甘油密度梯度离心，40mL离心管中从底部到顶部依次为：88％甘油7.5mL，44％甘油7.5mL，菌体裂解液15mL。100000×g超高速离心2.5h。

离心后，纳米颗粒位于88％甘油层上面的白色层，小心吸取此白色层收集微球，用10倍体积的50mM磷酸缓冲液将收集的微球进行充分洗涤，最后经冷冻干燥得到微球粉末。

2.3PGL-phaC蛋白的SDS-PAGE检测及鉴定

将提纯得到的纳米微球10mg，加入1mLPBS重悬，Bradford方法进行蛋白定量后，取适量的微球溶液与5×SDS凝胶加样缓冲液混合后，煮沸10min，进行10％SDS-PAGE蛋白电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：安装Bio-Rad电泳装置，灌制5％积层胶和下层10％分离胶，各需凝固约1h。将上述已制备好了的样品依顺序加样。电泳起始电压为90V，当染料前沿达分离胶后，调电压至110V，继续电泳至溴酚蓝染料前沿到达分离胶底部时，停止电泳。取下凝胶置于考马斯亮蓝染液中室温染色1-3小时，放入脱色液中脱色直至凝胶条带清晰、背景透明为止，观察电泳结果。

2.4碱性果胶酶固定化纳米微球的酶活力测定

一步法生产出的碱性果胶酶生物固定化纳米微球经碱性果胶酶酶活力测定为：129U/g。

测定方法如下：取10mg的微球粉末，充分溶解于1mL50mM的PBS溶液中，稀释一定倍数。酶反应体系为：酶稀释液20μL，含0.2％PGA的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol.L^-1，0.44mmol.L^-1的CaCl₂，pH9.4)2mL，无活性的酶液为空白对照。反应条件为：45℃水浴15min，使用3mL磷酸溶液(0.03mol.L^-1)终止反应，235nm处测定反应物吸光度值。

酶活单位定义为：1分钟裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol不饱和聚半乳糖醛酸所对应酶量。

本发明所述的碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2)固定化纳米微球，所述的纳米微球是由疏水性高分子材料制备的，疏水性高分子微球材料为PHA，由聚羟基丁酸酯、聚羟基辛酸酯、聚羟基癸酸酯、羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯、羟基丁酸-羟基己酸共聚酯、羟基丁酸-羟基辛酸共聚酯、羟基丁酸-羟基戊酸-羟基己酸共聚酯中的一种或几种聚合而成。

该纳米微球表面上负载有碱性果胶酶蛋白分子，碱性果胶酶蛋白分子通过共价键与微球表面的PHA合成酶蛋白分子phaC相连接。

该碱性果胶酶蛋白分子与微球表面的蛋白分子phaC是由融合基因表达的融合蛋白，该融合蛋白为PGL-PhaC；碱性果胶酶分子与phaC蛋白之间还设有连接肽，连接肽为GGGSGGGSGGGS。

所述的碱性果胶酶基因选自枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(GenBank:X74880)的碱性果胶酶基因pgl；所述的PHA合成酶基因phaC来源于Ralstoniaeutropha。