一种基于羟基卟啉的高选择性近红外硫离子荧光探针的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种基于羟基卟啉的高选择性近红外硫离子荧光探针的制备方法及应用。本发明的荧光探针是以单羟基苯基卟啉(TPP-OH)、4-氯-7-硝基苯呋咱(NBD-Cl)为原料，以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，以二氯甲烷为溶剂，室温下经一步反应制备而成。该探针制备方法简单，产品易于分离纯化。与现有的有机小分子荧光探针相比，本发明得到的荧光探针具有较长的荧光发射波长(λem＞650nm)，可在近红外区实现对微量硫化氢的高灵敏度、高选择性的快速识别和检测，在环境和生物检测领域有着巨大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及荧光传感材料制备及生物和环境检测技术领域，具体地说，涉 及具有识别硫离子(S^2-)功能的基于羟基卟啉的高选择性近红外荧光探针制备 方法以及在S^2-检测中的应用。

背景技术

硫离子存在于某些工业废水和生活污水中，是一种毒性极强的环境污染物； 生物体内的硫离子经质子化过程形成内源性硫化氢(H₂S)，近年来的许多研究表 明，内源性H₂S是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后被发现的第三种内源性气 体信号分子。内源性硫化氢参与心血管系统、消化系统和神经系统等多个生理 和病理调控过程。生物体内的硫离子浓度一旦不能维持正常的生理浓度水平， 就可能引发如肺动脉高压、胃粘膜损伤、肝硬化等各种疾病；因此发展高选择 性，高灵敏度的环境和生物体内硫离子的快速检测方法具有极其重要的意义。 传统的硫离子检测方法有比色法，电化学分析法和色谱分析法等方法，但这些 方法通常操作过程复杂且容易损伤样品，而荧光探针法是基于探针与被分析物 作用前后荧光信号的变化(如荧光强度的变化和波长的变化等)直观的体现分 析物的存在，对物质的分析和检测具有高的灵敏度，且对样品的破坏性小，这 些特点是传统方法无法比拟的。因此发展硫离子的荧光探针检测法具有重要的 现实意义。

荧光探针可以根据不同的机理进行设计，一般包括光诱导电子转移(PET)， 光诱导电荷转移(ICT)，和荧光共振能量转移(FRET)等几类。其中，典型PET 机理设计的荧光探针大多是由识别基团通过供电子基与荧光发色团连接，优点 在于该类探针与分析物结合前后，荧光信号变化非常明显。PET机理设计荧光 探针时必需选择性能好的一个发色团。卟啉具有较高的荧光量子产率，良好的 光热稳定性和脂溶性等基本特点，还特别地具有近红外荧光发射(λ_em>650nm) 和大的斯托克斯位移(﹥100nm)的优点；利用卟啉在近红外光区范围内进行检测 可以有效的减小对生物样品的光损伤和避免复杂生物样品中背景荧光的干扰， 大的斯托克斯位移可以有些的避免吸收光谱和发射光谱的重叠，从而提高检测 的准确性和分辨率，因此，卟啉是一种性能优良的近红外荧光发色团。目前大 多数根据PET机理设计合成的有机小分子荧光探针在紫外可见光区实现对硫离 子的检测，而近红外光区检测的比较少，因此开发卟啉类荧光探针具有重要的 应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于羟基卟啉的高选择性近红外硫离子荧光探 针的制备方法，进一步应用表明，该荧光探针能在THF-H₂O溶剂体系中实现对 硫离子的高灵敏度、高选择性的快速识别功能。

本发明的目的是通过下述方式实现的：

一种基于羟基卟啉的高选择性近红外硫离子荧光探针的制备方法，具体包 括以下步骤：

(1)称取一定量的5-(4-羟基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉(TPP-OH，或称 单羟基苯基卟啉)溶于二氯甲烷，然后加入一定量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)； 再称取一定量的4-氯-7-硝基苯并呋咱(NBD-Cl)溶于二氯甲烷，将TPP-OH溶液 充N₂保护20～30min后用恒压滴液漏斗将NBD-Cl的溶液滴入TPP-OH溶液中， 室温下搅拌24～36小时，得到单羟基苯基卟啉-7-硝基苯并呋咱(TPP-O-NBD) 的二氯甲烷溶液；

(2)将步骤(1)所得的单羟基苯基卟啉-7-硝基苯并呋咱的二氯甲烷溶液用 饱和氯化钠溶液洗涤2～4次，有机层再用无水硫酸钠干燥，然后减压蒸除二氯 甲烷，得紫黑色固体粗产品，然后固体粗产品经硅胶柱色谱进行分离纯化(淋 洗剂为石油醚：乙酸乙酯＝6:1-4:1，v/v)，再真空干燥，即得有金属光泽的紫黑 色固体纯品即基于羟基卟啉的高选择性近红外硫离子荧光探针(TPP-O-NBD)， 其结构如式(I)所示：

进一步地，所述的单羟基苯基卟啉、4-二甲氨基吡啶及4-氯-7-硝基苯并呋 咱的摩尔比为1.0：1.8-2.2：1.2-1.6。

进一步地，所述氯化钠溶液为饱和氯化钠溶液。

进一步地，所述步骤(2)除去二氯甲烷的方法为减压蒸馏。

进一步地，所述步骤(2)的柱色谱，淋洗剂为石油醚与乙酸乙酯的混合物， 所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为4～6:1。

一种根据上述的的制备方法制备的硫离子荧光探针。

一种根据上述的制备方法制备的硫离子荧光探针在硫离子检测中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明制备的荧光探针(TPP-O-NBD)，由于羟基卟啉与7-硝基苯并呋 咱之间发生了PET过程而不发射荧光，往探针的THF-H₂O溶液中加入硫离子后， 打断了与NBD连接的C-O键，导致NBD与TPP-OH脱离，从而PET过程被抑 制，荧光团母体结构(TPP-OH)恢复，发射强的荧光，并且该探针能在1min 内对硫离子产生快速的荧光响应，5分钟即接近荧光强度最大值。随着硫离子浓 度的增加，荧光强度逐渐增强，且硫离子浓度和荧光强度比率有很好的线性相 关性，检测限低达54nM(3σ/k)；而加入其它阴离子，特别是巯基化合物和活性 氧相关物种，荧光强度几乎没有变化，因此，探针可实现对微量硫离子的高灵 敏度、高选择性、高时效性的识别和检测。

(2)本发明制备的探针，可在近红外光区实现对微量硫离子的高选择性检 测，能有效的减少对生物样品的光损伤和避免复杂生物样品背景荧光的干扰， 提高检测的分辨率和准确性。

(3)本发明制备的探针合成路线简单，制备条件温和，易于纯化，适合实 际生产应用。

附图说明

图1为硫离子荧光探针对硫离子的识别机理示意图。

图2为探针(TPP-O-NBD)的质谱图。

图3为不同浓度的S^2-与探针反应后的荧光发射光谱图：

溶剂体系THF：H₂O＝1：1(v：v)，pH为7.4(HEPES缓冲溶液)，探针浓度 10μmol·L^-1，S^2-浓度/μmol·L^-1：0，1.0，3.0，5.0，7.0，8.0，9.0，15.0，20.0， 25.0，30.0，λ_ex＝428nm，反应时间为5min，狭缝宽度为Ex＝5,Em＝10。

图4硫离子浓度与荧光强度比率(F/F₀)的线性拟合关系图：

F为反应体系加入S^2-反应后λ_em＝652nm的荧光强度，F₀为不加S^2-的探针溶 液在相同条件下的荧光强度。

图5为探针与不同的阴离子反应后的荧光发射光谱图：

溶剂体系THF：H₂O＝1：1(v：v)，pH为7.4，探针浓度10μmol·L^-1，S^2-浓度 30μmol·L^-1，其它阴离子浓度300μmol·L^-1，λ_ex＝428nm，反应时间为5min，狭缝 宽度为Ex＝5,Em＝10。

图6为不同的阴离子与硫离子共存时对反应体系荧光强度的影响的柱状图：

溶剂体系THF：H₂O＝1：1(v：v)，pH为7.4，探针浓度10μmol·L^-1，S^2-浓度 30μmol·L^-1，其它阴离子浓度300μmol·L^-1，λ_ex＝428nm。F为探针与硫离子和共 存阴离子反应后在λ_em＝652nm的荧光强度，F₀为不加阴离子的探针溶液在同等 条件下的荧光强度。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

一种基于卟啉的高选择性近红外硫离子荧光探针(单羟基苯基卟啉-7-硝基 苯并呋咱)的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)称取单羟基苯基卟啉(30mg，0.048mmol)和DMAP(0.014ml， 0.116mmol)溶于10ml精制二氯甲烷，得溶液A；再称取4-氯-7-硝基苯并呋咱 (13.2mg，0.066mmol)溶于10ml精制二氯甲烷，得溶液B。将A溶液充N₂保护 20～30min后，用恒压滴液漏斗将B的溶液缓慢滴入A中，室温搅拌24～36小时， 得到单羟基苯基卟啉-7-硝基苯并呋咱(TPP-O-NBD)的二氯甲烷溶液；

(2)将TPP-O-NBD的二氯甲烷溶液用饱和氯化钠溶液洗涤3～4次，每次 用15-20mL饱和氯化钠溶液，有机层再用无水硫酸钠干燥(搅拌30min)。

(3)将干燥后的有机层减压条件下除去大部分的二氯甲烷。在加入适量硅 胶减压蒸干二氯甲烷，干法上样经柱色谱分离纯化(淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯 ＝6:1-4:1)，再将过柱后的滤液旋干，真空干燥，即得一种紫黑色固体即基于卟啉 的高选择性近红外硫离子荧光探针(TPP-O-NBD)。

实施例2

硫离子的检测实验。

(1)往10ml容量瓶中加入5.0ml的THF、1.50mmol·L^-1的探针溶液66.5μl， pH值为7.4的1.0mol.L^-14-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液0.5ml，用二次 蒸馏水稀释至10ml，得到浓度为10μmol·L^-1的探针溶液。取3.0ml探针溶液加 入4ml比色皿中，分别加入S^2-，使其浓度分别为0，1.0，3.0，5.0，7.0，9.0， 15.0，20.0，25.0，30.0μmol·L^-1。常温下搅拌反应5min测其荧光发射光谱 (λ_ex＝428nm，λ_em＝652nm)。得到探针与不同浓度S^2-反应的荧光发射光谱图(见 图3)。由图3可知，探针溶液本身的荧光强度很小，当加入S^2-反应5min后， 反应体系的荧光强度明显增强，且随着S^2-浓度的增加，体系的荧光强度逐渐增 强，以上结果说明探针能对硫离子产生荧光增强效应，即使微量的硫离子也能 效应明显，并且时效性很高。

(2)以F/F₀为纵坐标(F为S^2-与探针溶液反应后在最大发射波长λ_em＝652nm 处的荧光强度，F₀为一个不加S^2-的探针溶液在相同条件下的荧光强度)，以硫离 子浓度(μmol·L^-1)为横坐标，得到硫离子浓度与荧光强度比率(F/F₀)的线性 拟合关系图(见图4)。由图4可知，S^2-浓度在3.0-30.0μmol·L^-1的范围内与F/F₀有很好的线性关系，线性方程为F/F₀＝0.1791c(μmol·L^-1)+0.6748(R²＝0.9967，n＝8), 通过对检测限的计算，得到检测限为54nM(3σ/k)。以上结果表明探针能对微量 硫离子实现高灵敏度的检测。

实施例3

硫离子的选择性实验。

(1)往10ml容量瓶中加入5.0mlTHF,1.50mmol.L^-1的探针溶液66.5μl，pH 值为7.4的1.0mol.L^-1的HEPES缓冲溶液0.5ml，用二次蒸馏水定容至10ml，得 到浓度为10μmol·L^-1探针溶液。取3.0ml探针溶液加入4ml比色皿中，分别加入 阴离子或相关物种：S^2-，I^-，Cl^-，Br^-,C₂O₄^2-，SO₃^2-，HSO₃^-，F^-,NO₂^-，SO4^2-,NO₃^-， S₂O₃^2-，CO₃^-，SCN^-，HCO₃^-，Cys，Asp，H₂O₂，ClO^-,GSH。使S^2-浓度为30μmol.L^-1， 其他离子和相关物种的浓度为300μmol.L^-1，常温搅拌5min后测其荧光强度 (λ_ex＝428nm)，得到探针与不同阴离子或相关物种反应后的荧光发射光谱图(见 图5)。由图5可知，加入S^2-后，荧光强度显著增强，而加入其它阴离子或相关 物种后，即使它们的浓度是硫离子的10倍，荧光强度也几乎没有变化，这说明 探针体系对硫离子有极高的选择性。

(2)在盛有3ml10μmol.L^-1探针溶液的4ml比色皿中，加入30μmol.L^-1的 S^2-和300μmol.L^-1阴离子或相关物种，S^2-+阴离子序号从1到20分别为S^2-，S^2-+I^-, S^2-+Cl^-,S^2-+Br^-,S^2-+C₂O₄^2-，S^2-+SO₃^2-，S^2-+HSO₃^-，S^2-+F^-，S^2-+NO₂^-，S^2-+SO₄^2-S^2-+NO₃^-，S^2-+S₂O₃^2-,S^2-+CO₃^2-，S^2-+SCN^-，S^2-+HCO₃^-，S^2-+Cys，S^2-+Asp， S^2-+H₂O₂，S^2-+ClO^-，S^2-+GSH。常温搅拌反应5min后，测其荧光光谱 (λ_ex＝428nm)，记录最大发射波长λ_ex＝652nm处的荧光强度F，同时以一个不加 阴离子的探针溶液做为空白对照，相同条件下测其荧光强度F₀，以F/F₀为纵坐 标，阴离子序号为横坐标，得到S^2-不同的与共存阴离子对反应体系荧光强度的 影响的柱状图。结果如图6所示。由图6可知，当10倍量的阴离子与S^2-共存时， 对S^2-与探针反应产生的荧光强度几乎没有影响，进一步说明探针对硫离子的检 测具有极高的选择性和抗干扰能力。

上述实施例仅用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明 的精神和权利要求的保护范围内，对本发明所作出的任何修改和改变，都落入 本发明的保护范围。