一种抗炎、抗感染和促进成骨分化及骨矿化的杆菌肽固定钛合金假体及其制备方法

摘要

本发明涉及一种抗炎、抗感染和促进成骨分化及骨矿化的杆菌肽固定钛合金假体及其制备方法。本发明通过共价接枝的方法将杆菌肽固定到钛合金上，得到的杆菌肽修饰钛片能够保持其抗菌生物活性并且能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化及骨矿化，除此之外还具有抑制炎症因子分泌的功能，且制备工艺简单，反应条件温和，效率高，成本低，可重复性好。本发明可有效改善目前钛合金应用于临床生物功能单一的缺陷，减少钛合金植入体内后的感染与早期因过度的炎症反应引起的松动等相关并发症。

说明书

技术领域

本发明涉及骨科假体技术领域，具体地说，涉及一种抗炎、抗感染和促进 成骨分化及骨矿化的杆菌肽固定钛合金假体及其制备方法。

背景技术

一个完美的骨科种植体应当在植入后避免并发症的发生。赵(Zhao，Journal ofbiomedicalmaterialsresearchPartB,Appliedbiomaterials2009,91(1):470-480) 提出抗菌涂层是提高内植物感染的重要手段。张(Zhang，IntJMolSci2014, 15(7):11878-11921.)认为具有促进骨结合和抗感染的植入物具有减少无菌和感 染性松动风险的能力。Goodman(GoodmanSB，Biomaterials2013, 34(13):3174-3183)提出骨科生物涂层植入物在未来重点是提高骨整合，减少 感染，减少慢性炎症反应。总之，骨科内植物表面涂层不仅要能减轻感染，还 要提高骨整合和调节炎症，以有利于植骨融合，进一步提高机体的局部防御能 力。

机体对内植物的炎症反应被认为是影响假体体内性能的重要因素，基于 此，生物材料的设计应该基于避免宿主的炎症免疫反应。目前评价内植物材料 的骨结合研究主要采用材料与骨髓间充质干细胞或成骨细胞在成骨诱导液中 刺激的单因素培养模型，通过成骨分化指标(碱性磷酸酶，茜素红成骨相关基 因的表达)来评价，并没有考虑到内植物对宿主的固有炎症反应。宿主对内植 物的炎症反应能够很大程度上影响内植物在体内的性能尤其是骨整合，也即骨 髓间充质干细胞成骨分化。

虽然目前有通过(Ma，Biomaterials2014,35(37):9853-9867)调节控制钛 表面形貌来调节炎症反应从而控制向有利于骨整合的方向进行的报道，但这种 假体在体内复杂的环境下也只能促进骨整合，内植物抗感染却没有涉及。理想 上的内植物应当兼备抗感染、促进骨整合和抑制炎症反应的三重性能。

因此，在改性的具备抗菌作用的钛合金材料基础上，使之具有促进骨整合 和抑制炎症反应的性能，将改善目前骨科功能化材料作用单一的局面。杆菌肽， C₆₆H₁₀₃N₁₇O₁₆S，属多肽类抗生素，对革兰阳性细菌和阴性球菌、肺炎双球菌、 葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌及螺旋体等均有杀菌作用。目前关于杆菌肽 固定修饰的钛合金假体还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种抗炎、抗感染和促进成 骨分化及骨矿化的杆菌肽固定钛合金假体。

本发明的再一的目的是，提供所述的杆菌肽固定钛合金假体的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供所述的杆菌肽固定钛合金假体的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种抗炎、抗感染和促进成骨分化及骨矿化的杆菌肽固定钛合金假体，所 述的杆菌肽固定钛合金假体是在钛合金的表面固定杆菌肽。

所述的杆菌肽是以共价键接枝方式固定在钛合金的表面。

所述的钛合金的表面引入有功能官能团氨基、羧基或巯基，并与所述杆菌 肽的功能官能团羧基或氨基发生共价键结合。

所述的杆菌肽固定钛合金假体的制备方法为：

a)将钛合金浸入浓度为5-10M的强碱溶液中，60-80℃下反应10-12h，取 出后除去残留的碱性溶液，干燥；

b)将所述的钛合金浸入到1-5mg/ml的多巴胺Tris-HCl溶液中，pH＝8-9， 25-37℃下反应6-12h，去离子水清洗，干燥；

c)将所述的钛合金放入浓度为1-5mg/ml的杆菌肽的乙酸溶液中，pH＝3-5， 滴加EDC水溶液和NHS水溶液，使得EDC最终浓度为2.5-3.5mg/mL，NHS 最终浓度为0.25-0.35mg/mL，在惰性气体回流下保护反应6-12h后终止反应， 反应过程中温度为25-37℃，去离子水清洗，干燥，即得所述的杆菌肽固定钛 合金假体。

所述的惰性气体为氮气或氩气。

所述的杆菌肽的乙酸溶液是用5μM的乙酸配制。

所述的杆菌肽固定钛合金假体的制备方法为：

a)将钛合金浸入浓度为5M的强碱溶液中，80℃下反应12h，取出后除去 残留的碱性溶液，干燥；

b)将所述的钛合金浸入到2mg/ml的多巴胺Tris-HCl溶液中，pH＝8.5， 30℃下反应8h，去离子水清洗，干燥；

c)将所述的钛合金放入浓度为3mg/ml的杆菌肽的乙酸溶液中，pH＝4， 滴加EDC水溶液和NHS水溶液，使得EDC最终浓度为3mg/mL，NHS最终 浓度为0.3mg/mL，在氮气回流下保护反应8h后终止反应，反应过程中温度为 30℃，去离子水清洗，干燥，即得所述的杆菌肽固定钛合金假体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种抗炎、抗感染和促进成骨分化及骨矿化的杆菌肽固定钛合金假体的制 备方法，包括以下步骤：

a)将钛合金浸入浓度为5-10M的强碱溶液中，60-80℃下反应10-12h，取 出后除去残留的碱性溶液，干燥；

b)将所述的钛合金浸入到1-5mg/ml的多巴胺Tris-HCl溶液中，pH＝8-9， 25-37℃下反应6-12h，去离子水清洗，干燥；

c)将所述的钛合金放入浓度为1-5mg/ml的杆菌肽的乙酸溶液中，pH＝3-5， 滴加EDC水溶液和NHS水溶液，使得EDC最终浓度为2.5-3.5mg/mL，NHS 最终浓度为0.25-0.35mg/mL，在惰性气体回流下保护反应6-12h后终止反应， 反应过程中温度为25-37℃，去离子水清洗，干燥，即得所述的杆菌肽固定钛 合金假体。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述的杆菌肽固定钛合金假体在制备骨科假体中的应用。

如上任一所述的杆菌肽固定钛合金假体在制备抗炎、抗感染和促进成骨分 化及骨矿化的骨科假体中的应用。

所述的抗炎是指抑制炎症反应，可以是抑制炎症因子肿瘤坏死因子 (TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-10及相关炎症基因 的表达等。

所述的抗感染主要针对骨科感染常见菌，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性 菌，其中革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、耐药金黄色葡萄球菌、表皮葡萄 球菌及耐药表皮葡萄球菌等，革兰氏阴性菌包括大肠杆菌等。

本发明优点在于：

1、本发明使用杆菌肽对钛片进行修饰，得到的杆菌肽修饰钛片不仅具有 抗感染的功能，还意外地发现其具有促进成骨分化和骨矿化以及抑制炎症反应 的功能，本发明可有效改善目前钛合金应用于临床生物功能单一的缺陷，减少 钛合金植入体内后的感染与早期因过度的炎症反应引起的松动等相关并发症。

2、本发明是利用氨基与羧基发生的脱水缩合反应将杆菌肽与钛合金共价 连接，工艺简单，反应参数设置恰当，反应条件温和，可在常温下进行，效率 高，成本低，可重复性好，获得的杆菌肽修饰钛片抗菌、促进成骨分化和骨矿 化以及抑制炎症反应的效果十分显著。

附图说明

图1为各组钛片表面元素XPS分析结果。

图2为杆菌肽修饰钛片的电镜扫描图片。

图3为各组钛片表面活菌的定量结果。Ti-BC与Ti、Ti-A、Ti-DOPA相比， *P＜0.05。A组实验细菌为金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，B组实验细菌为 耐药金黄色葡萄球菌(ATCC43300)。

图4为不同时间点各组钛片表面金黄色葡萄球菌(ATCC25923)存活情 况的CLSM观察结果。绿色表示存活细菌，红色表示死亡细菌。放大倍数×400， 比例尺50μm。

图5为各组钛片成骨早期分化的碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果。Ti-BC 与Ti、Ti-A、Ti-DOPA相比，P＜0.05。Ti与Ti-A、Ti-DOPA相比，P＜0.05。

图6为各组钛片成骨晚期分化的茜素红染色结果。Ti-BC与Ti、Ti-A、 Ti-DOPA相比，*P＜0.05。Ti与Ti-A、Ti-DOPA相比，#P＜0.05。

图7为各组钛片与巨噬细胞共培养后炎症因子TNF-α及IL-1β的分泌结 果。Ti-BC与Ti、Ti-A、Ti-DOPA相比，*P＜0.05。Ti与Ti-A、Ti-DOPA相比， #P＜0.05。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1本发明的杆菌肽固定钛合金假体的制备(一)

1、钛片表面引入功能官能团氨基

通过两步法在钛合金表面引入功能官能团氨基。首先将钛合金Ti6AL4V (上海艳钛金属材料有限公司)浸入浓度为5M的NaOH溶液中，80℃ 下反应12h。然后取出钛片用去离子水超声清洗3次，取出后在去离子水中浸 泡除去残留的碱性溶液，干燥。再将钛片浸入到2mg/ml的多巴胺Tris-HCl (pH＝8.5)溶液中，30℃下反应8h，去离子水超声清洗3次，干燥。

2、钛片表面共价键固定杆菌肽

将引入功能官能团氨基的钛片放入杆菌肽的乙酸溶液中(杆菌肽浓度为 3mg/ml，用5μM的乙酸配制)，pH＝4，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液，使得EDC最终浓 度为3mg/mL，NHS最终浓度为0.3mg/mL，在惰性气体氮气回流下保护反应 8h后终止反应，反应过程中温度为30℃。去离子水超声清洗，真空干燥。

3、钛片表面共价键固定杆菌肽的表征

随机取Ti(普通钛片)、Ti-A(碱处理钛片)、Ti-DOPA(多巴胺修饰的 钛片)、Ti-BC(本实施例制备的杆菌肽修饰钛片)进行表面X光电子能谱检 测，确定杆菌肽是否成功接枝到钛片上。图1为各组钛片表面元素XPS分析 结果，可见，钛片表面固定杆菌肽后N1s、C1s峰增强，Si2p、O1s和Ti2p3 峰减弱，并出现S元素峰。S元素为杆菌肽中的特殊元素，证明杆菌肽已成功 固定在钛片表面。

随机取本实施例制备的杆菌肽修饰钛片进行电镜扫描。电镜扫描图片见图 2，可见钛片表面连接有杆菌肽化学基团。

4、杆菌肽修饰钛片的抗菌实验

本实验采用的细菌为金黄色葡萄球菌(ATCC25923)及耐药金黄色葡萄 球菌(ATCC43300)，但其他G+及G-菌同样适用于本实验。

实验分为四组：Ti(普通钛片)、Ti-A(碱处理钛片)、Ti-DOPA(多巴胺 修饰的钛片)、Ti-BC(本实施例制备的杆菌肽修饰钛片)。将各组钛片消毒灭 菌置于24孔板中，每组设3个复孔。将两种骨科感染最常见的细菌金黄色葡 萄球菌(ATCC25923)及耐药金黄色葡萄球菌(ATCC43300)以每孔500μl (浓度调整为1×10⁶CFU/ml)分别接种于上述各组钛片上，37℃下静态培养 6h、12h、24h，培养到特定时间点后取出各组钛片，用无菌PBS清洗3次以 去除未黏附的浮游细菌，材料表面黏附的细菌通过超声震荡技术洗脱，然后进 行倍比稀释TSA涂板，培养箱37℃培养，24小时后计数分析。抗菌率＝(Ti 片上CFU数量–Ti-BC上的CFU)/Ti片上CFU数量×100％。另外各组随机 取一组材料在6h及24h时间点用PBS清洗去除粘附及粘附不牢固的细菌，2.5％ 戊二醛溶液固定1h，使用LIVE/DEADBacLightBacterialViabilityKits (MolecularProbes，L13152，Invitrogen，美国)染色后，PBS清洗以除去非 特异性染色，最后在激光共聚焦显微镜(CLSM，德国)下观察材料表面黏附 细菌的量及活力(Live/Dead染液中含两种荧光染料，荧光染料SYTO9能使 活细菌发出绿光，荧光染料PI(Propidiumiodide)可使死菌发出红光)。

图3为涂板法各组钛片表面活菌的定量结果。可以看出碱处理的钛片 (Ti-A)及多巴胺修饰的钛片(Ti-DOPA)能够一定程度上促进细菌尤其是耐 药金黄色葡萄球菌在其上的生长，而杆菌肽修饰的钛片(Ti-BC)能够明显抑 制金黄色葡萄球菌及耐药金黄色葡萄球菌生长，其抗菌率在90％以上。

图4为不同时间点各组钛片表面金黄色葡萄球菌(ATCC25923)存活情 况的CLSM观察结果。可见6h及24h时未被杆菌肽修饰的钛片细菌粘附较多， 24h可见细菌成团聚集及成膜生长，杆菌肽修饰钛片(Ti-BC)表面无细菌聚 集成团，细菌粘附较少，主要为散在、单一的形态，24h后有较多的死菌存在， 没有成膜生长的细菌。

5、杆菌肽修饰钛片的促进成骨分化和骨矿化实验

本实验采用的细胞为人骨髓间充质干细胞，但其他人成体干细胞(脂肪间 充质干细胞、内皮祖细胞等)和具有成骨分化潜能的干细胞同样适用于本实验。

实验分组同抗菌实验。将各组钛片消毒灭菌置于24孔板中，每孔设3个 复孔。将第三代人骨髓间充质干细胞(humanbonemarrowmesenchymalstem cell，hBMMSC)接种于各组钛板上，控制细胞密度为2×10⁵，每孔1ml。37℃、 5％CO₂条件下在细胞培养箱内培养24小时达到细胞贴壁后，将细胞培养基 更换为含有成骨诱导液的a-MEM培养基(成骨诱导液：10％胎牛血清培养液 中加入50μM维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠和100nM地塞米松)。此后，每3 天换液，7d后进行碱性磷酸酶染色评价人骨髓间充质干细胞成骨细胞早期分 化，14d天后进行茜素红染色评价细胞外基质矿化即成骨晚期分化标志。

碱性磷酸酶染色具体方法为：各组钛片与hBMSC共培养7天后，移去成 骨培养基，取出钛片，根据ALP染色试剂盒(碧云天)说明书进行ALP染色： PBS清洗3次后，放入固定液4℃固定30s；PBS再次清洗3次，加入工作液 并置于37℃水浴箱45min；最后吸去工作液，PBS冲洗3次后，干燥拍照。

茜素红染色具体方法为：各组钛片与hBMSC共培养14天后，吸去成骨 培养基并PBS清洗3次，95％乙醇固定10min，再清洗3次；在48孔板中加 入0.1％茜素红溶液，置37℃水浴箱45min；双蒸水反复清洗去除多余染液， 最后晾干拍照。

图5为各组钛片成骨早期分化的碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果。由图 可知杆菌肽修饰钛片ALP活性在第7天显著高于其他各组，Ti-BC与Ti、Ti-A、 Ti-DOPA相比，*P＜0.05。Ti与Ti-A、Ti-DOPA相比，#P＜0.05。表明杆菌肽 修饰钛片能够促进成骨早期分化。

图6为各组钛片成骨晚期分化的茜素红染色结果。可见杆菌肽修饰钛片的 矿化结节形成高于其他各组钛片。茜素红定量结果表明，Ti-BC与Ti、Ti-A、 Ti-DOPA相比，*P＜0.05。Ti与Ti-A、Ti-DOPA相比，#P＜0.05，说明杆菌 肽修饰钛片能够显著促进细胞外基质矿化。

6、杆菌肽修饰钛片的巨噬细胞炎症反应实验

实验分组同抗菌实验。人外周血单核细胞系THP-1细胞(中国科学院细胞 库)经丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)诱导1天作 为巨噬细胞来源。各组钛片消毒后置于24孔板底，将细胞以2×10⁴接种到各 组钛片表面，在含5％CO₂的37℃培养箱中培养，培养基中不添加诱导巨噬细 胞炎症反应的药物，分别于第1、3天获取细胞上清液，使用试剂盒 1000TNF-α,1000 (SIEMENS)通过化学发光检测仪immulite1000(Siemenshealthcare diagnosticsInc)测定炎症因子。

图7为各组钛片与巨噬细胞共培养后炎症因子TNF-α及IL-1β的分泌结 果。可见Ti-A、Ti-DOPA和Ti-BC在各个时间点均能显著的抑制TNF-α及IL-1β 炎症因子的分泌，并且Ti-BC与Ti-A、Ti-DOPA相比具有轻微的抑制炎症因子 TNF-α及IL-1β分泌的效果。Ti-BC与Ti、Ti-A、Ti-DOPA相比，*P＜0.05。 Ti与Ti-A、Ti-DOPA相比，#P＜0.05。

实施例2本发明的杆菌肽固定钛合金假体的制备(二)

1、钛片表面引入功能官能团氨基

通过两步法在钛合金表面引入功能官能团氨基。首先将钛合金圆片浸入浓 度为10M的NaOH溶液中，60℃下反应10h。然后取出钛片用去离子水超声清 洗3次，取出后在去离子水中浸泡除去残留的碱性溶液，干燥。再将钛片浸入 到5mg/ml的多巴胺Tris-HCl(pH＝9)溶液中，25℃下反应12h，去离子水超 声清洗3次，干燥。

2、钛片表面共价键固定杆菌肽

将引入功能官能团氨基的钛片放入杆菌肽的乙酸溶液中(杆菌肽浓度为 5mg/ml，用5μM的乙酸配制)，pH＝3，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液，使得EDC最终浓 度为2.5mg/mL，NHS最终浓度为0.35mg/mL，在惰性气体氮气回流下保护反 应6h后终止反应，反应过程中温度为37℃。去离子水超声清洗，真空干燥。 实施例3本发明的杆菌肽固定钛合金假体的制备(三)

1、钛片表面引入功能官能团氨基

通过两步法在钛合金表面引入功能官能团氨基。首先将钛合金圆片浸入浓 度为5M的NaOH溶液中，70℃下反应11h。然后取出钛片用去离子水超声清 洗3次，取出后在去离子水中浸泡除去残留的碱性溶液，干燥。再将钛片浸入 到1mg/ml的多巴胺Tris-HCl(pH＝8)溶液中，37℃下反应6h，去离子水超声 清洗3次，干燥。

2、钛片表面共价键固定杆菌肽

将引入功能官能团氨基的钛片放入杆菌肽的乙酸溶液中(杆菌肽浓度为 1mg/ml，用5μM的乙酸配制)，pH＝5，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液，使得EDC最终浓 度为3.5mg/mL，NHS最终浓度为0.25mg/mL，在惰性气体氩气回流下保护反 应12h后终止反应，反应过程中温度为25℃。去离子水超声清洗，真空干燥。

对比例1

1、钛片表面引入功能官能团氨基

通过两步法在钛合金表面引入功能官能团氨基。首先将钛合金圆片浸入浓 度为10M的NaOH溶液中，60℃下反应10h。然后取出钛片用去离子水超声清 洗3次，取出后在去离子水中浸泡除去残留的碱性溶液，干燥。再将钛片浸入 到6mg/ml的多巴胺Tris-HCl(pH＝9)溶液中，25℃下反应12h，去离子水超 声清洗3次，干燥。

2、钛片表面共价键固定杆菌肽

将引入功能官能团氨基的钛片放入杆菌肽的乙酸溶液中(杆菌肽浓度为 5mg/ml，用5μM的乙酸配制)，pH＝3，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液，使得EDC最终浓 度为2.5mg/mL，NHS最终浓度为0.35mg/mL，在惰性气体氮气回流下保护反 应6h后终止反应，反应过程中温度为37℃。去离子水超声清洗，真空干燥。

对比例2

1、钛片表面引入功能官能团氨基

通过两步法在钛合金表面引入功能官能团氨基。首先将钛合金圆片浸入浓 度为5M的NaOH溶液中，70℃下反应11h。然后取出钛片用去离子水超声清 洗3次，取出后在去离子水中浸泡除去残留的碱性溶液，干燥。再将钛片浸入 到1mg/ml的多巴胺Tris-HCl(pH＝8)溶液中，37℃下反应6h，去离子水超声 清洗3次，干燥。

2、钛片表面共价键固定杆菌肽

将引入功能官能团氨基的钛片放入杆菌肽的乙酸溶液中(杆菌肽浓度为 1mg/ml，用5μM的乙酸配制)，pH＝5，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亚胺(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液，使得EDC最终浓 度为3.5mg/mL，NHS最终浓度为0.25mg/mL，在惰性气体氩气回流下保护反 应12h后终止反应，反应过程中温度为22℃。去离子水超声清洗，真空干燥。

实施例4

应用涂板法检测实施例2-3、对比例1-2制备得到的杆菌肽修饰钛片分别 接种细菌金黄色葡萄球菌(ATCC25923)及耐药金黄色葡萄球菌(ATCC 43300)后培养24h的抗菌率。结果见表1，实施例2和3制备的杆菌肽修饰钛 片抗菌率显著高于对比例1和2。

表1实施例2-3、对比例1-2的杆菌肽修饰钛片的抗菌率

实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 ATCC 25923 80.5％ 82.1％ 64.8％ 53.3％ ATCC 43300 76.7％ 79.0％ 59.2％ 51.8％

将实施例2-3、对比例1-2制备得到的杆菌肽修饰钛片分别与hBMSC共培 养7天后，碱性磷酸酶染色评价人骨髓间充质干细胞成骨细胞早期分化情况。 结果见表2，实施例2和3制备的杆菌肽修饰钛片促进成骨细胞早期分化的效 果显著优于对比例1和2。

表2实施例2-3、对比例1-2的杆菌肽修饰钛片碱性磷酸酶活性

实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 ALP相对活性 2.1 2.2 1.9 1.8

将实施例2-3、对比例1-2制备得到的杆菌肽修饰钛片分别与hBMSC共培 养14天后，茜素红染色评价细胞外基质矿化即成骨晚期分化标志。结果见表3， 实施例2和3制备的杆菌肽修饰钛片促进成骨细胞晚期分化的效果显著优于对 比例1和2。

表3实施例2-3、对比例1-2的杆菌肽修饰钛片茜素红染色结果

实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 吸光度 0.48 0.45 0.38 0.35

将实施例2-3、对比例1-2制备得到的杆菌肽修饰钛片分别与巨噬细胞共 培养3天后测定细胞上清液炎症因子。结果见表4，实施例2和3制备的杆菌 肽修饰钛片抗炎效果显著优于对比例1和2。

表4实施例2-3、对比例1-2的杆菌肽修饰钛片炎症因子测定结果

实施例2 实施例3 对比例1 对比例2 TNF-α(pg/ml) 18.3 21.5 27.8 28.4 IL-1β(pg/ml) 2.1 2.2 2.3 2.5

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。