人白介素17A和白介素26联合用于制备治疗轮状病毒感染的药物中的应用及方法

摘要

本发明公开了人白介素17A和白介素26联合用于制备治疗轮状病毒感染的药物中的应用及方法，通过先加入重组人IL-17A，抑制轮状病毒复制，而后加入IL-26，进一步清除轮状病毒，从而达到抑制其增殖并保护肠上皮细胞免受更深侵害，为细胞的轮状病毒感染治疗提供了新的思路，也为临床治疗轮状病毒感染奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及人白介素17A和白介素26联合用于制备治疗轮状 病毒感染的药物中的应用，还涉及利用人白介素17A和白介素26体外抑制轮状病毒的方法。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，RV)属于呼肠弧病毒科，为无胞膜双链RNA(dsRNA)病毒，11 条dsRNA各缠绕1分子的RNA依赖RNA多聚酶(VP1)和1分子的鸟苷酸及甲基转移酶(VP3) 位于病毒颗粒的核心，编码12种蛋白质，包括6种结构蛋白(VP1～4、6～7)与6种非结构 蛋白(NSP1～6)。VP2构成轮状病毒的内层衣壳包裹病毒基因组；VP6构成的中层衣壳包绕VP2 形成轮状病毒双层衣壳颗粒(DLP)；VP4和VP7构成的外层衣壳再包绕DLP形成完整的轮 状病毒三层衣壳颗粒(TLP)。轮状病毒在受体的介导下穿过细胞膜进入细胞，脱掉外层衣 壳形成DLP开始复制过程，新生成的病毒dsRNA与蛋白在胞浆中聚集形成病毒质粒，并在 其中组装生成DLP，DLP不具有感染能力，其随后进入内质网，与新合成的VP4和VP7装 配成具有感染能力的TLP并分泌出宿主细胞，完成病毒的复制过程。轮状病毒感染能抑制宿 主细胞蛋白的表达，激活宿主细胞内多种蛋白激酶如PKA、PKB、PKC、PKG以及酪氨酸蛋 白激酶的激活，引起肠上皮细胞连接的破坏、肠粘膜通透性增加。轮状病毒感染是导致婴幼 儿腹泻的主要病因，每年引起约1.25亿例儿童胃肠炎，仅我国每年就大约有千万婴幼儿患轮 状病毒感染性胃肠炎。

辅助性T细胞17(Th17)是CD4+的免疫细胞亚群，与多种感染性疾病和炎症性疾病密 切相关，Th17细胞可通过分泌人白介素17A(IL-17A)、人白介素17F(IL-17F)及白介素 26(IL-26)等细胞因子抵抗外来感染和促进炎症的发生，Th17细胞对轮状病毒感染也有一定 的防御作用。但是在轮状病毒感染的前期，适应性免疫细胞群未能及时发挥功能，Th17细胞 不能有效启动，致使病毒在肠道上皮细胞内大量增殖，所以即使有预防性疫苗，每年仍有大 量患儿遭受轮状病毒感染之痛，感染后的有效治疗显得尤为重要。

因此，急需一种能够快速高效抑制轮状病毒感染的方法，为临床治疗轮状病毒感染奠定 基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供白介素17A和白介素26联合用于制备治疗轮状 病毒感染的药物中的应用；本发明的目的之二在于提供白介素17A和白介素26联合用于制 备抑制轮状病毒复制的药物中的应用；本发明的目的之三在于提供利用白介素17A和白介素 26体外抑制治疗轮状病毒复制的方法。

为实现上述发明目的，经大量研究，本发明提供如下技术方案：

1、白介素17A和白介素26联合用于制备治疗轮状病毒感染的药物中的应用。

优选的，所述白介素17A为重组人白介素17A，所述白介素26为重组人白介素26。更 优选的，所述白介素17A的浓度为1.5-2ng/ml，所述白介素26的浓度为10-20ng/ml。

2、白介素17A和白介素26联合用于制备抑制轮状病毒复制的药物中的应用。

优选的，所述白介素17A为重组人白介素17A，所述白介素26为重组人白介素26。更优 选的，所述白介素17A的浓度为1.5-2ng/ml，所述白介素26的浓度为10-20ng/ml。

3、利用白介素17A和白介素26体外抑制治疗轮状病毒复制的方法，包括以下步骤：

A.将液氮中冻存的Caco-2细胞取出后置入37℃水浴中使其融化，然后将Caco-2细胞转 入DMEM培养基中，混匀，然后在1200rpm/分钟条件下离心10分钟；弃上清，再加入含10％ (v/v)胎牛血清的DMEM高糖培养基，混匀，然后将细胞转入培养瓶中，于37℃、CO₂体 积分数为5％的培养箱中贴壁培养12小时；

B.倒掉瓶内培养液，用DMEM培养液清洗细胞2-3次，然后吸除残余液体，在培养瓶 中加入猪胰蛋白酶至质量分数为0.25％，于37℃培养箱中消化5-10分钟，再加入含体积分数 为5％FBS的DMEM培养基，轻轻吹打使团块细胞分散均匀，然后于1200rpm/分钟条件下离 心10分钟，再加入DMEM完全培养基；接着按照1×10⁵/孔的密度将细胞接种到24孔板中， 于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中贴壁培养12小时，再按1×10⁷/孔的浓度将轮状病毒 接种到细胞中，继续培养24小时；

C.倒掉旧培养基，加入新鲜的含体积分数10％FBS的DMEM高糖培养基，然后加入 1.5～2ng/ml的白介素17A，于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养12小时；然后再在 培养基中加入浓度为10～20ng/ml的白介素26继续培养24小时，即可。

优选的，所述白介素17A为重组人白介素17A，所述白介素26为重组人白介素26。

本发明的有益效果在于：本发明提供了白介素17A和白介素26联合用于制备治疗轮状 病毒感染的药物的新用途，通过合理利用抗轮状病毒的细胞因子(IL-17、IL-26)抑制其在细 胞内复制，即当细胞被轮状病毒感染后，通过先加入重组人IL-17A，抑制轮状病毒复制，而 后加入IL-26，进一步清除轮状病毒。从而达到抑制其增殖并保护肠上皮细胞免受更深侵害。 为细胞的轮状病毒感染治疗提供了新的思路，也为临床治疗轮状病毒感染奠定了基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为CCK-8鉴定不同实验组Caco-2细胞活性。

图2为RT-PCR检测不同实验组Caco-2细胞内轮状病毒的DNA数量。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的 实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中重组人IL-17A、IL-26均购自英国abcame公司(货号分别为：ab194179、 ab163231)；CCK-8购自日本Dojindo公司(货号：CK04)，DMEM高糖培养基购自美国 ThermoFisher公司(货号：11965-118)；荧光定量检测试剂盒SYBRGREENRealtimePCR MasterMix购自日本TOYOBO公司(货号为：FSQ-101)。

实施例1

利用白介素17A和白介素26体外抑制治疗轮状病毒复制的方法，具体步骤如下：

A.从液氮罐中取出Caco-2细胞(人结直肠腺癌细胞株)冻存管，立即置入37℃水浴中， 不时摇动，1分钟内使其融化；将冻存管表面擦拭干净，酒精消毒后在超净工作台上进行后 续操作；将冻存管中的细胞转入装有5mlDMEM培养基的10ml离心管中，玻璃滴管混匀； 将装有Caco-2细胞的10ml离心管置于水平离心机中，1200rpm/分钟，离心10分钟；弃上清， 加入5mlDMEM高糖(含体积分数为10％的胎牛血清)完全培养基，玻璃滴管混匀，将细胞 转入50ml细胞培养瓶中；37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中贴壁培养12小时；

B.倒掉瓶内培养液，用1mlDMEM培养液清洗细胞，清洗3次，然后玻璃滴管吸除残 余液体；在培养瓶中加入猪胰蛋白酶至质量分数为0.25％(10μl/cm²)，瓶底所有细胞均能被 胰酶覆盖；37℃培养箱中消化10分钟，细胞收缩、变圆，逐渐从培养瓶底部脱落；立即加入 5ml含5％FBS的DMEM培养基到细胞瓶中，玻璃滴管轻轻吹打，使团块细胞分散均匀，然 后在1200rpm/分钟条件下离心10分钟，加入DMEM培养基；血球计数板细胞计数，按照1×10⁵/ 孔的密度将细胞接种到24孔板中，于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中贴壁培养12小 时，然后按照1×10⁷/孔的浓度将轮状病毒接种到细胞中，继续培养24小时；

C.倒掉旧培养基，加入新鲜的含体积分数为10％FBS的DMEM高糖培养基，加入重组 人IL-17至终浓度为2ng/ml，于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养12小时；然后在 培养基中加入浓度为20ng/ml的重组人IL-26，继续培养24小时。实验过程中以添加等量的 PBS处理和添加IL-17A或IL-26作为对照。接着，CCK-8检测细胞活性，荧光定量PCR检 测轮状病毒DNA含量，结果如图1和图2所示。结果显示，IL-17、IL-26细胞因子添加组 Caco-2细胞的活性显著强于细胞因子添加组和未添加组，同时轮状病毒DNA的数量也明显 低于单细胞因子添加组和未添加组，证实IL-17、IL-26双细胞因子显著抑制了轮状病毒的复 制，进而有效降低了病毒导致的细胞死亡率。其中，两种细胞因子处理组轮状病毒DNA的 浓度较未处理组降低约40％，也比两种细胞因子单独处理组较低约20％，可见两者的联合应 用有效抑制了轮状病毒在Caco-2细胞内的复制。

本实施例为本发明的最佳实施例。其中CCK-8检测细胞活性检测方法如下：取对照(PBS 处理)组、轮状病毒感染对照组、轮状病毒感染后IL-17A、IL-26、IL-17A+IL-26处理组的细 胞，按照CCK-8试剂盒说明书，检测其细胞活性。荧光定量PCR检测轮状病毒DNA含量的 方法是用TRIZOL裂解液分别提取上述各组细胞内总RNA(内含轮状病毒RNA)，然后使用 逆转录试剂盒ReverTraqPCRRTKit合成cDNA。再根据轮状病毒基因设计荧光定量引 物，并以人GAPDH基因为内参，其荧光定量使用的引物如下：

RotavirusVP7Forward：5’-tcctcacttctacactttgcc-3’(SEQIDNO.1)；

RotavirusVP7Reverse：5’-tatccatttattcgcttcgtc-3’(SEQIDNO.2)；

GAPDHForward：5’-ctctgatttggtcgtattggg-3’(SEQIDNO.3)；

GAPDHReverse：5’-tggaagatggtgatgggattt-3’(SEQIDNO.4)。

将合成的cDNA和荧光定量引物按照荧光定量检测试剂盒SYBRGREENRealtimePCR MasterMix说明书配制PCR反应体系，用荧光定量PCR仪(美国安捷伦MX3000P)，反应条 件为94℃预热60秒；94℃变性3秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒，进行30个循环，最 后72℃延伸10分钟进行实时监测，将检测结果通过Applicatio软件统计分析结果。

实施例2

利用白介素17A和白介素26体外抑制治疗轮状病毒复制的方法，具体步骤如下：

A.从液氮罐中取出Caco-2细胞冻存管，立即置入37℃水浴中，不时摇动，1.5分钟内 使其融化；将冻存管表面擦拭干净，酒精消毒后在超净工作台上进行后续操作；将冻存管中 的细胞转入装有8mlDMEM培养基的10ml离心管中，玻璃滴管混匀；将装有Caco-2细胞的 10ml离心管置于水平离心机中，1200rpm/分钟条件离心5分钟；弃上清，加入5mlDMEM高 糖(含10％胎牛血清)完全培养基，玻璃滴管混匀，将细胞转入50ml细胞培养瓶中；于37℃、 体积分数为5％的CO₂培养箱中贴壁培养6小时；弃上清，加入新鲜培养基；

B.倒掉瓶内培养液，用1mlDMEM培养液清洗细胞，清洗2次，然后玻璃滴管吸除残 余液体；在培养瓶中加入0.25％的猪胰蛋白酶(10μl/cm²)，瓶底所有细胞均能被胰酶覆盖； 37℃培养箱中消化10分钟，细胞收缩、变圆，逐渐从培养瓶底部脱落；立即加入5ml含5％FBS 的DMEM培养基到细胞瓶中，玻璃滴管轻轻吹打，使团块细胞分散均匀；然后在1200rpm/ 分钟条件下离心5分钟，加入完全培养基；血球计数板细胞计数，按照1×10⁵/孔的密度将细 胞接种到24孔板中，于37℃、体积分数5％的CO₂培养箱中贴壁培养12小时，然后按照1 ×10⁷/孔的浓度将轮状病毒接种到细胞中，继续培养20小时；

C.倒掉旧培养基，在新DMEM高糖完全培养基(含10％FBS)中加入重组人IL-17至 终浓度为1ng/ml，于37℃、体积分数5％的CO₂培养箱中培养12小时；然后在培养基中加入 重组人IL-26至终浓度为10ng/ml，继续培养24小时。实验过程中以添加等量的PBS处理和 添加IL-17A或IL-26作为对照。最后，CCK-8检测细胞活性，荧光定量PCR检测轮状病毒 DNA含量。IL-17、IL-26细胞因子添加组Caco-2细胞的活性显著强于细胞因子添加组和未添 加组，同时轮状病毒DNA的数量也明显低于单细胞因子添加组和未添加组，证实IL-17、IL-26 双细胞因子显著抑制了轮状病毒的复制，进而有效降低了病毒导致的细胞死亡率。

本实施检测结果与实施例1相同。

实施例3

利用白介素17A和白介素26体外抑制治疗轮状病毒复制的方法，具体步骤如下：

A.从液氮罐中取出Caco-2细胞冻存管，立即置入37℃水浴中，不时摇动，2分钟内使 其融化；将冻存管表面擦拭干净，酒精消毒后在超净工作台上进行后续操作；将冻存管中的 细胞转入装有3mlDMEM培养基的10ml离心管中，玻璃滴管混匀；将装有Caco-2细胞的10ml 离心管置于水平离心机中，1200rpm/分钟，离心5分钟；弃上清，加入5ml含体积分数10％ 胎牛血清的DMEM高糖培养基，玻璃滴管混匀，将细胞转入50ml细胞培养瓶中；于37℃、 体积分数5％的CO₂培养箱中贴壁培养6小时；

B.倒掉瓶内培养液，用1mlDMEM培养液清洗细胞，清洗1次，然后玻璃滴管吸除残 余液体；在培养瓶中加入0.25％的猪胰蛋白酶(10μl/cm²)，瓶底所有细胞均能被胰酶覆盖； 37℃培养箱中消化5分钟，细胞收缩、变圆，逐渐从培养瓶底部脱落；立即加入5ml含质量 分数5％FBS的DMEM培养基到细胞瓶中，玻璃滴管轻轻吹打，使团块细胞分散均匀； 1200rpm/分钟，离心5分钟，加入完全培养基；血球计数板细胞计数，按照2×10⁵/孔的密度 将细胞接种到24孔板中，37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中贴壁培养12小时；然后按 照1×10⁷/孔的浓度将轮状病毒接种到细胞中，继续培养24小时。

C.倒掉旧培养基，在新DMEM高糖完全培养基(含10％FBS)中加入重组人IL-17至 终浓度为1ng/ml，于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养12小时；然后在培养基中 加入重组人IL-26至终浓度为15ng/ml，继续培养24小时。实验过程中以添加等量的PBS处 理和添加IL-17A或IL-26作为对照。接着，CCK-8检测细胞活性，荧光定量PCR检测轮状 病毒DNA含量。IL-17、IL-26细胞因子添加组Caco-2细胞的活性强于细胞因子添加组和未 添加组，同时轮状病毒DNA的数量也明显低于单细胞因子添加组和未添加组，证实IL-17、 IL-26双细胞因子显著抑制了轮状病毒的复制，进而有效降低了病毒导致的细胞死亡率。

本实施例获得检测结果与实施例1相同。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。