用在提升抗癌药物输送及医疗效果的癌症标靶肽

摘要

本发明公开了用在提升抗癌药物输送及医疗效果的癌症标靶肽。具体地，本发明提供了一种肽标靶共轭体，该共轭体包含：a)一经分离或合成的长度小于15个氨基酸残基的标靶肽，其包含一氨基酸序列，其至少90％等同于选自SEQ？ID？NOs：1、2、及3的序列；以及b)一组分，其是共轭结合至标靶肽，该组分是选自药物输送载具、抗癌药物、微胞、纳米颗粒、微脂体、聚合物、脂质、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、细胞、显像剂、及标记剂。该共轭体可进一步包含抗癌剂，其是包膜在药物输送载具内。本发明亦公开治疗癌症的组合物及方法。

说明书

技术领域

本发明大体上是涉及有关癌症标靶肽，且更特定地是有关具癌细胞特异性的 肽标靶共轭体。

背景技术

包膜化学治疗剂的配体标靶纳米颗粒在癌症治疗上扮演越来越重要的角色， 且预期成为下一代的治疗模式。大肠癌是最常诊断出的癌症之一，且是全球癌症 死因的主因。目前大肠癌的治疗仅具有限的成功率，因此，这类病患迫切需要更 有效的治疗方式。发展标靶药物输送系统是有效输送抗癌药物至肿瘤所必需。发 展新颖方法以早期检测及有效治疗癌症，将取决在癌细胞表面的独特生物标记 (biomarkers)的识别及对此类生物标记具高度结合亲和性的肿瘤特异性配体的分 离。肽噬菌体展示(phagedisplay)是一有效方法，其通过全细胞淘选(whole-cell panning)而识别能结合至特定细胞类型的肽，使得肽内化(internalization)，其共轭 结合至纳米颗粒时可作为药物输送载具。此容许在细胞内使用肽输送有毒负载 (toxicpayloads)以达到治疗效果。然而，标靶肽的靶蛋白识别有其难度，是因肽的 结合亲和性低，且标靶肽与经分离的靶蛋白间难以在全膜萃取物(wholemembrane extracts)中维持原始结合作用。

因此，本领域存在迄今未解决的需求，以解决上述缺失及不足，特别是与癌 症标靶肽相关者。

发明内容

在一方面，本发明是涉及一共轭体，其包含：(a)一经分离或合成的长度小于 15个氨基酸残基的标靶肽，其包含一氨基酸序列，其至少90％等同于选自SEQID NOs：1、2、及3的序列；以及(b)一组分，其是共轭结合至标靶肽，该组分是选 自药物输送载具、抗癌药物、微胞、纳米颗粒、微脂体、聚合物、脂质、寡核苷 酸、肽、多肽、蛋白质、细胞、显像剂、及标记剂。标靶肽具结合在人类大肠癌 细胞的活性，但不结合在正常细胞。

前述标靶肽的长度可为10、11、12、13、或14个氨基酸残基，或甚而长度小 于10个氨基酸残基，其前提是维持肽标靶癌细胞的功能。

在本发明的一具体实施例中，组分是药物输送载具。药物输送载具可选自由 微脂体、聚合物微胞、脂蛋白系药物载体、纳米颗粒药物载体、树状体、干细胞、 及多肽组成的群组。

在本发明的另一具体实施例中，标靶肽可共轭结合至：(a)一或多个药物，其 是选自多索如比辛(doxorubicin)及温诺平(vinorelbine)；或(b)一寡核苷酸；或(c)一 显像剂。显像剂可为但不局限在，放射性分子、放射性药物、或氧化铁颗粒。

在本发明的另一具体实施例中，共轭体可进一步包含至少一抗癌药物，其是 包膜在药物输送载具内。该至少一抗癌药物可选自多索如比辛、温诺平、及其任 何结合物。

在本发明的另一具体实施例中，药物输送载具是微脂体。微脂体可经聚乙二 醇化(PEGylated)。

肽可包含一氨基酸序列，其至少95％等同于选自SEQIDNO：1、2、及3的 序列。

在本发明的另一具体实施例中，肽的序列是选自SEQIDNO：1、2、及3。

在本发明的另一具体实施例中，组分是标记剂，其是共轭结合至标靶肽的C 端。在本发明的此具体实施例中，共轭体可进一步包含：(a)癌细胞，其结合至标 靶肽，其中标靶肽的C端是共轭结合至标记剂；以及(b)交联剂，其将癌细胞交联 至标靶肽。

在本发明的另一具体实施例中，前述共轭体的组分为蛋白质，即α-烯醇酶。

在更另一方面，本发明是涉及一组合物，其包含：(a)一治疗有效量的前述共 轭体；以及(b)一医药上可接受的赋形剂、载体、或载具。

此外，本发明是涉及一组合物，其包含：(a)一治疗有效量的前述共轭体，其 中抗癌药物是多索如比辛；(b)一治疗有效量的前述共轭体，其中抗癌药物是温诺 平；以及(c)一医药上可接受的赋形剂、载体、或载具。

在另一方面，本发明是涉及治疗癌症的方法，其包含：投予前述组合物至具 癌症的个体。

在本发明的另一具体实施例中，癌症包含α-烯醇酶在其细胞表面。癌症可选 自由结肠癌、乳癌、神经胶质瘤、肺癌、血癌、肝细胞癌、食道癌、头颈癌、胰 腺癌、前列腺癌、睾丸癌、及卵巢癌组成的群组。在更另一方面，本发明是涉及 治疗癌细胞的方法，其包含：使癌细胞在体内或体外暴露在一有效量的前述共轭 体。癌细胞可存在于个体，或存在于取自个体的组织标本。癌细胞可过度表达α- 烯醇酶。

此等及其他方面将显见在下列较佳具体实施例的说明并伴随下列图标，尽管 其中可能存在变化及改进，但其不背离本发明新颖概念的精神及范围。

附图是说明本发明的一或多个具体实施例，并伴随书面描述，以阐述本发明 的原理。尽可能，整体图标中使用相同的参考编号，以表示具体实施例的相同或 类似组件。

附图说明

图1(A)-1(C)显示经选取的噬菌体克隆的体内肿瘤归巢能力的验证。(A)含有 HCT-116异种植体的NOD/SCID小鼠是静脉注射经选取的噬菌体克隆。在8分钟 后，以PBS灌流洗去游离的噬菌体，且移除异种植体及器官以测定噬菌体效价。 (B)以免疫组织化学进行噬菌体的定位检测。噬菌体克隆HCT-63、HCT-69、及 HCT-74显示强力累积在肿瘤，但未在正常器官如大脑、心脏、肺脏、及结肠检出。 (C)噬菌体克隆标靶肿瘤组织的活性是受其相对应肽的竞争抑制。

图2(A)-2(B)显示特异性噬菌体克隆结合至各癌细胞株及hCRC组织切片手术 标本的活性。(A)以流动式细胞测量术测定各克隆结合至hCRC细胞的表面结合活 性。红色：经选取的噬菌体克隆；黑色：对照组噬菌体(1×10¹⁰pfu/2×10⁵个细胞)。 (B)特异性噬菌体克隆结合至人类大肠癌组织切片的活性。源自大肠癌病患组织切 片的标本是以噬菌体培养，并以抗M13噬菌体抗体检测。人类大肠癌手术标本可 检出经选取的噬菌体而非对照组噬菌体。

图3(A)-3(J)显示微脂体性药物标靶输送至hCRC细胞。(A)微脂体多索如比辛 (LD)的低温电子显微镜(Cryo-TEM)显微图片及经安定化的微脂体温诺平(sLV)。 (B)LD及sLV的粒径分布及ζ电位(zetapotential)。(C)DSPE-PEG-NHS及 DSPE-PEG-pHCT74共轭体的MALDI-TOF质谱分析。(D)pHCT74肽共轭结合的 LD及pHCT74肽共轭结合的sLV的低温电子显微镜显微图片。(E)pHCT74-LD及 pHCT74-sLV的粒径分布及ζ电位。(F)以不同微脂体制剂培养后(多索如比辛10 μg/ml)，HCT116细胞的多索如比辛摄取。以细胞裂解液样本的荧光测定进行多索 如比辛的定量。(G)LD或含0.05％至5％(摩尔)pHCT74-peg-DSPE脂质的LD的体 外细胞毒性轮廓，其是以人类HCT116大肠癌细胞进行。(H)以GraphPadPrism软 件计算IC₅₀值。(I)温诺平、sLV、或pHCT74-sLV的体外细胞毒性轮廓。(J)温诺平、 sLV、及pHCT74-sLV的IC₅₀估计值。所显示的数据是取自3个独立实验的平均值。 误差杠，SD。(*，0.05≥P>0.01；**，0.01≥P>0.001；以及***，P<0.001)。比例尺 条带代表50nm。

图4(A)-4(H)显示pHCT74肽的靶蛋白鉴定。(A)实验设计示意图。(B)以流动 式细胞测量术评估生物素化的pHCT74肽结合至HCT116细胞的特性。(C)生物素 化pHCT74肽与HCT116细胞表面蛋白的交联亲和性，其是以2-巯乙醇自链霉亲 和素(streptavidin)磁珠切断经交联的蛋白质。以银染显示条带。(D)以串联质谱演译 的标的条带肽序列(SEQIDNO：22)。(E)通过将特异性shRNA(ENO1-A、B、C、 及DshRNA)导入HCT116细胞以稳定减量ENO1基因，其是通过病毒载体感染。 (F)在α-烯醇酶基因减量后，HCT74噬菌体的结合活性下降。(G)当α-烯醇酶过度 表达时，HCT74噬菌体的结合活性增加。(H)HCT74噬菌体与重组型α-烯醇酶蛋 白的结合亲和性。将96孔培养盘预涂布2ug/mL的α-烯醇酶蛋白，并培养在浓度 渐增的HCT74噬菌体，之后培养在HRP共轭结合的抗M13抗体。数据是以平均 值±标准偏差表示。

图5(A)-5(I)显示标靶肽pHCT74的共轭结合提升微脂体多索如比辛及微脂体 温诺平在大肠癌异种植入模式的效果。含有人类HCT116((A)、(B)、(C))或 SW620((D)、(E)、(F))大肠癌异种植体的小鼠是分别处理1mg/kgpHCT74-LD、 1mg/kgLD、1mg/kgFD、及PBS。图5(G)、(H)、(I)显示温诺平负载的微脂体对人 类大肠癌HCT116异种植入小鼠的抗肿瘤功效。小鼠是分别投予1.5mg/kg pHCT74-sLV、sLV、及PBS。所有化合物是每周经由尾静脉注射二次。图5(B)、 (C)；(E)、(F)；(H)、(I)是在处理结束时，将肿瘤组织切片及秤重。*，0.05≥P>0.01； **，0.01≥P>0.001；以及***，P<0.001。误差杠，SEM。

图6(A)-6(G)显示pHCT74肽的共轭结合提升微脂体多索如比辛及微脂体温诺 平在大肠癌异种植入模式的效果。含有HCT116异种植体(250mm³)的小鼠是随 机分成7个处理组，其中每组6只小鼠。投予载具(PBS)、LD(1mg/kg)、 sLV(1.5mg/kg)、LD(1mg/kg)+sLV(1.5mg/kg)、pHCT74-LD(1mg/kg)、 pHCT74-sLV(1.5mg/kg)、或pHCT74-LD(1mg/kg)+pHCT74-sLV(1.5mg/kg)的 HCT116异种植入小鼠的肿瘤生长(A)及体重(B)曲线。在处理结束时，将肿瘤组织 切片(C)及秤重(D)。(E)以1mg/kgpHCT74-LD与1.5mg/kgpHCT74-LX组合治疗有 六分之三的肿瘤根除。以载具(PBS)、LD(1mg/kg)、sLV(2mg/kg)、LD(1mg/kg)+ sLV(2mg/kg)、pHCT74-LD(1mg/kg)、pHCT74-sLV(2mg/kg)、或 pHCT74-LD(1mg/kg)+pHCT74-sLV(2mg/kg)处理含有大型HCT116异种植体(650 mm³)的小鼠。治疗组的肿瘤生长(F)及体重(G)曲线。所有化合物是每周经由尾静脉 注射二次。*，0.05≥P>0.01；**，0.01≥P>0.001；以及***，P<0.001。误差杠，SEM。

图7(A)-7(F)显示pHCT74-LD与pHCT74-sLV组合治疗在原位大肠癌模式的提 升的抗肿瘤功效。NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ)是原位植入 HCT116-luc细胞，并在肿瘤接种5天后，处理载具(PBS)、FD(1mg/kg)+FV(2mg/kg)、 LD(1mg/kg)+sLV(2mg/kg)、或pHCT74-LD(1mg/kg)+pHCT74-sLV(2mg/kg)。所有 化合物是每周经由尾静脉注射二次。(A)以生物发光监控肿瘤生长，其是使用IVIS 200成像系统。(B)以生物发光定量法监控肿瘤进展。(C)体重。(D)卡本-麦尔存活 图(Kaplan–Meiersurvivalplot)。(E)各处理组的中位数存活天数。(F)对数秩 (log-rank)(曼特尔-考克斯(Mantel-Cox))检定的存活分析，其显示所有个体的存活率 (N＝8)。

图8为选自HCT116的噬菌体展示的肽序列的比对表。分配至各序列的SEQID NOs.由上而下分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11、2、1、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21。

具体实施方式

本发明更具体而言以下列实施例描述，其仅旨在说明，是因其中许多改进及 变化将由本领域的技术人员所显见。现详述本发明的各具体实施例。参照附图， 在整体观点中，相同数字代表相同组分。如本文的说明及所遵循的整体权利要求 所使用，“一”、“一种”、及“该”的意义包括多个参考体，除非文中另有明确规定。 同时，如本文的说明及所遵循的整体权利要求所使用，“其内”的意义包括“其内” 及“其上”，除非文中另有明确规定。此外，说明书可使用标题或子标题以方便读者， 其应不影响本发明的范围。此外，本说明书所用的一些术语是更特定地定义如下。

定义

本说明书所使用的术语一般而言具有其在本领域、本发明全文中、及使用各 术语的特定上下文中的普通含义。用在说明本发明的特定术语是讨论如下或本说 明书的他处，以提供实施者额外的指导关于本发明的说明。为方便起见，可使用 如斜体及/或引号突显特定术语。使用突显方式不会影响术语的范围及意义；无论 是否经突显，相同上下文的术语的范围及意义是相同。应理解到，可以一种以上 的方式描述相同事物。因此，本文所论及的术语的任一者或多者可使用另一语言 及同义词，且其非以任何特殊意义替代，不论本文所阐述或论及的术语为何。本 文提供特定术语的同义词。一或多个同义词的声明并未排除使用其他同义词。本 说明书中随处使用的实施例是仅用在阐述，该实施例包括本文所论及的任何术语 的实施例，且不以任何方式局限本发明或任何示例性术语的范围及意义。同样地， 本发明未局限在本说明书给定的各具体实施例。

除非另有定义，本文所使用的所有技术性及科学性术语具有本发明所属领域 的普通技术人员之一者所能常规理解的相同意义。一旦发生冲突，将以本文件为 基准，包括其的定义。

本文所使用的“约略”、“约”、或“大约”等词一般应指介于一给定数值或范围的 20百分比内，较佳是介于10百分比内，且更佳是介于5百分比内。本文给定的数 字量皆为近似值，是指若无明文规定时，可以“约略”、“约”、或“大约”等词推断。

“药物输送载具”一词是指一载具，其能以一方式输送药物至病患，该方式增加 身体一些部位相对于其他部位的药物浓度。药物输送载具包括但不局限在，聚合 物微胞、微脂体、脂蛋白系药物载体、纳米颗粒药物载体、树状体、细胞、多肽 等。理想的药物输送载具须为无毒、生物兼容性、无免疫原性、生物降解性，且 须避免宿主防御机制的辨识。“处理”或“治疗”等词是指投予一有效量的化合物至有 需求的个体，该个体具有癌症或演变成此类疾病的症状或倾向，其目的在于治愈、 缓解、舒缓、补救、改善、或预防该疾病、其症状、或演变成该疾病的倾向。此 个体可由健康照护专业人员确认，其是基于任何适用诊断方法的结果而定。

“一有效量”是指在经治疗的个体赋予医疗效果所需的活性化合物的量。有效剂 量将可变，其取决于投予途径、赋形剂使用、及与其他医疗处理共同使用的可能 性，如本领域的技术人员的理解。

由美国卫生及公众服务部食品药物管理局公开的“成人健康自愿者治疗的临 床试验安全起始剂量的行业及审查人员评估手册(GuidanceforIndustryand ReviewersEstimatingtheSafeStartingDoseinClinicalTrialsforTherapeuticsin AdultHealthyVolunteers)”公开“治疗有效量”可取自下式的计算：HED＝动物剂量 (mg/kg)((动物重量(kg)/人体重量(kg))^0.33。

目前大肠癌的治疗成功率有限，是因药物在疾病位置缺乏药理选择性 (pharmacoselectivity)。因此，需要标靶药物输送系统，以有效输送抗癌药物至肿瘤。 本发明人成功地经由体外生物淘选(biopanning)确定结合至人类大肠癌(human colorectalcarcinoma；hCRC)细胞的特异性肽，其使用噬菌体展示的肽库。确定3 个大肠癌高度亲和性噬菌体克隆，并以细胞ELISA及流动式细胞测量术(flow cytometry)确认其结合活性。hCRC标靶噬菌体辨识5个大肠癌细胞株及源自病患 的大肠癌手术标本。以体内异种植入模式确认hCRC标靶噬菌体的肿瘤归巢能力。 欲探讨是否hCRC标靶肽可用在提升抗癌药物的医疗效果，本发明人合成包膜多 索如比辛(pHCT74-LD)或温诺平(pHCT74-sLV)的肽介导微脂体。值得注意的是， hCRC标靶肽共轭结合的微脂体药物在小鼠异种植入模式明显抑制hCRC肿瘤生 长。pHCT74-LD与pHCT74-sLV的结合治疗能完全根除六分之三的全部含肿瘤小 鼠的肿瘤而无任何复发迹象。含肿瘤小鼠的生物分布研究显示，投予hCRC标靶 肽共轭结合的微脂体多索如比辛后，化疗药物是在肿瘤组织定位。本发明人的发 现显示，hCRC标靶肽具发展成标靶药物输送系统及造影的极大潜力以治疗癌症， 包括但不局限在大肠癌。

本发明是涉及标靶肽及大肠癌细胞上靶蛋白的发现，其是以生物素化 (biotinylated)肽直接结合在完整细胞，而以亲和性捕获法(affinitytrappingmethod) 及LC/MALDI-MS/MS确定细胞的细胞膜上未知的靶蛋白。本发明人公开如何在肿 瘤细胞株直接筛选噬菌体库以产生肽，其能结合至细胞表面受体，并在结合时快 速内化。发明人亦证实以噬菌体展示的肽确定肿瘤抗原，其是以亲和性捕获法及 LC/MALDI-MS/MS进行。进行肽标靶及非标靶微脂体的肿瘤及器官分布轮廓及肽 标靶的微脂体性药物对含人类大肠癌异种植体小鼠的抗肿瘤活性评估。标靶的纳 米医药的结合物在具原位人类结肠癌小鼠显示强化的抗肿瘤效果及显着的延长存 活率，显示其发展为癌症治疗标靶药物输送系统的极大潜力。噬菌体克隆及经显 示的肽序列是列在图8。SEQIDNOs.如下：

HCT-74：SSMDIVLRAPLM(SEQIDNO:3)；HCT-01:AAPELVAPSIWL(SEQ IDNO:4)；

HCT-40：SLSLVAPVLSLL(SEQIDNO:5)；HCT-70：TMGFTAPRFPHY (SEQIDNO:6)；

HCT-50：SPGLSLVSHMQT(SEQIDNO:7)；HCT-41：LTRPNGIPHLSL(SEQ IDNO:8)；

HCT-21：TSYSINLLSTPM(SEQIDNO:9)；HCT-10：SPTGLFMTLSSR(SEQ IDNO:10)；

HCT-04：HHRTLSPSVSIL(SEQIDNO:11)；HCT-69：TSVSIVSTVLTP(SEQ IDNO:2)；

HCT-63：RLNLDIIAVTSV(SEQIDNO:1)；HCT-08：LATPFTATSATG(SEQ IDNO:12)；

HCT-71：VTSSLPRMFHTL(SEQIDNO:13)；HCT-12：GFLPLPRGEIFS (SEQIDNO:14)；

HCT-92：TPSLPPTMFRLT(SEQIDNO:15)；HCT-59：GHLIPLRQPSHQ (SEQIDNO:16)；

HCT-47：SPNFSWLPLGTT(SEQIDNO:17)；HCT-33：KVDAGLGSIFLL (SEQIDNO:18)；

HCT-34：WGITVETAYGTA(SEQIDNO:19)；HCT-35：SELHVRLSHINA (SEQIDNO:20)；

HCT-45：SSGGVRWSAHWS(SEQIDNO:21)。

产业应用说明

标靶肽(如pHCT74肽)可经由化学连接符如ADC(抗体-药物共轭体)连接至抗 癌药物。标靶肽的可能应用包括但不限于下列:

寡核苷酸的肽共轭体。肽寡核苷酸的合成及应用为本领域现有(Venkatesanet al.“PeptideConjugatesofOligonucleotides:SynthesisandApplications”Chem.Rev. 2006,106,3712-3761)。

肽共轭结合的微胞(Layeketal.“CellPenetratingPeptideConjugatedPolymeric MicellesasaHighPerformanceVersatileNonviralGeneCarrier”Biomacromolecules 2013,14,4071-4081)。

肽-药物共轭体:肽-药物-共轭体(Arapetal.“Cancertreatmentbytargeteddrug deliverytotumorvasculatureinamousemodel”Science1998,279(5349):377-80； Forneretal.“Peptide-drugconjugates:types,utility&Manufacturing”Specialty ChemicalsMagazineMay2012,p46-47；Fireretal.“Targeteddrugdeliveryforcancer therapy:theothersideofantibodies”JournalofHematology&Oncology2012,5:70； Majumdaretal.“PeptideMediatedTargetedDrugDelivery”MedicinalResearch Reviews32,No.3,637-658,2012；Zhangetal.“CellularUptakeandCytotoxicityof Drug-PeptideConjugatesRegulatedbyConjugationSite”BioconjugateChemistry 2013,24,604-613；Lelleetal.“Novelcleavablecell-penetratingpeptide–drug conjugates:synthesisandcharacterization”J.ofPeptidescience2014；20:323-333)。

肽-聚合物共轭体:AnnuRevPhysChem.2013；64:631-57；Cancer vaccines:(Arensetal.“Prospectsofcombinatorialsyntheticpeptidevaccine-based immunotherapyagainstcancer”SeminarsinImmunology25(2013)182-190)。

肽共轭结合至磁性纳米颗粒:(Xieetal.“Surface-engineeredmagnetic nanoparticleplatformsforcancerimagingandtherapy”AccountsofChemicalResearch 44(10)883-892,2011)。

肽-树状体共轭体:(Liuetal.“Novelpeptide-dendrimerconjugatesasdrugcarriers fortargetingnon-smallcelllungcancer”InternationalJ.ofNanomedicine2011:6 59-69)。

放射性标记的肽:(Fanietal.“RadiolabeledPeptides:ValuableToolsforthe DetectionandTreatmentofCancer”Theranostics2012,2(5):481-501)。

用在癌症分子造影的肽共轭体,如Fe₃O₄:AnticancerAgentsMedChem. 2012；12(5):476-99。

多索如比辛的数个官能基团是已用在共轭结合至肽。一级胺可直接连接至C 端羧酸基或肽载体的Asp侧链。药物-肽经由酰胺键共轭结合的进行是通过连接药 物的羧酸与间隔子(spacer)/肽的一级胺。在酰胺键形成方面，可以O-苯并三唑 -N,N,N’,N’-四甲基-脲-六氟磷酸盐(HBTU)或1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚 胺盐酸盐(EDC)与N-羟基苯并三唑(HOBT)的混合物活化间隔子、肽、或药物的羧 酸。随后，经活化的羧酸是溶在不同溶剂，包括二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，并 在强碱(即二异丙基乙基胺或三乙基胺)存在下与对应体(即药物或肽)的胺基反应， 以取得所欲的共轭体。欲在多索如比辛与肽载体间提供间隔子，将胺基与琥珀酸 酐或戊二酸酐反应，取得具游离羧酸基的产物，其可连接至肽的游离胺基。多索 如比辛的C14的一级醇是通过酯键连接至载体分子的羧酸基。多索如比辛的C13 酮基亦反应在肼(hydrazine)以形成腙(hydrazone)间隔子，其连接至肽载体。

酯键联是常规用在共轭结合药物与肽，是因其可化学上或酶上(即酯酶)水解以 释放药物。欲共轭结合多索如比辛与肽，以戊二酯修饰多索如比辛的C14，并将戊 二酸盐的其他羧酸连接至肽的D-Lys的侧链胺基，以取得多索如比辛-肽共轭体。

可以腙键联作为酸不稳键(acid-labilebond)，以在肿瘤细胞外环境及溶酶体的 pH降低时自共轭体释放药物分子。在C13具酮官能基的道诺鲁比辛(Daunorubicin) 及多索如比辛是衍生肼马来亚酰胺间隔子(即间-马来酰亚胺苯甲酸肼或对-马来酰 亚胺苯乙酸肼)，以取得酰肼(hydrazide)中间物。此类马来亚酰胺中间物是反应在 肽的Cys残基的巯基，以取得个别的共轭体。间隔子的芳环的存在提供调节腙键 稳定性的可能性。

喜树碱(camptothecin)及考布他汀(combretastatin)是共轭结合至肽，其是利用药 物与间隔子间的胺甲酸酯键进行。间隔子含有甲基-胺基乙基部分，其是连接至胺 甲酸酯氮以作为“内建的亲核剂辅助释放”(built-in-nucleophileassisted releasing；BINAR)部分，其作为亲核剂以释放喜树碱。此BINAR部分的二级胺是 攻击胺甲酸酯基的羰基碳，以在间隔子形成五元环脲；其随后释放药物至介质。

肽是以1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰 亚胺(NHS)共轭结合至多索如比辛。共轭体通过SephadexG25的凝胶过滤而释放 反应物。碳二亚胺共轭结合法避免使用质谱共轭体化学计量测定(Science1998， 279(5349):377-80)。

实施例

未意图局限本发明的范围，本发明具体实施例的示例性仪器、装置、方法、 及其相关结果描述如下。应注意到，标题或子标题可用在实施例以方便读者，其 不应以任何方式局限本发明的范围。此外，本文提出及公开特定理论；然而，不 论对错，其不应以任何方式局限本发明的范围，只要该发明根据本发明实施，且 不考虑任何特定理论或作用机制。

材料与方法

细胞株。HCT116、HT29、LS174T、SW620、COLO205、A498、HTB-10、 B16F10、SKOV3、PC3、U2OS、1112SK、H184、SAS、H460、MIAPaCa2、SK-HEP-1、 及Mahlavu细胞是购自AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，并由ATCC根据 DNA轮廓、细胞遗传学分析、及异构酶学而认证。此类细胞是根据ATCC的方法 培养，并在细胞复苏后传代六个月以内。

噬菌体展示生物淘选程序。本实验使用基于以随机肽12单体组合库融合至 M13噬菌体pIII壳蛋白的噬菌体展示的随机肽库(NewEnglandBiolabs，MA，USA)。 HCT116细胞是生长至70-80％满。将生长培养基移除，并以无血清的DMEM清洗 二次。随后，在4℃下以阻断缓冲液(含有1％BSA的无血清DMEM)阻断30分钟。 将2×10¹¹pfu的噬菌体展示肽库加至HCT116细胞。将具有反应混合物的细胞培养 在4℃的震荡器1小时。在培养后，以PBS清洗细胞4次，移除未结合的噬菌体。 以溶解缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.4、150mMNaCl、1％NonidetP-40)回收结合 至细胞的噬菌体。经回收的噬菌体是以大肠杆菌ER2738培养物(NewEngland BioLabs，MA，USA)放大及滴定。经放大的噬菌体是进行下一轮的生物淘选，其 使用HCT116细胞。第五轮的噬菌体析出物是在LB/IPTG/X-Gal盘上滴定，以确 定噬菌体克隆。

以ELISA确定噬菌体克隆。经选取的噬菌体是进一步以ELISA筛选确定。将 1×10⁴个细胞种植在96孔ELISA培养盘(Falcon，CA，USA)的各孔内隔夜，并在 室温下以2％聚甲醛或甲醇/丙酮(1:1)固定10分钟。培养盘以PBS清洗二次并在室 温下以含有1％BSA的PBS(w/v)阻断30分钟。接着，将个别的噬菌体克隆加入并 在室温下培养1小时。在PBS清洗三次后，培养盘在室温下以山葵过氧化酶 (horseradishperoxidase；HRP)共轭结合的小鼠抗M13噬菌体抗体(GEHealthcare) 培养1小时,其中稀释倍率为1:2000。培养盘再次以PBS清洗三次,之后以过氧化酶 受质邻苯二胺二盐酸盐(o-phenylenediaminedihydrochloride；OPD,Sigma)及H₂O₂培 养。以3NHCl终止反应,并以微盘读仪(Model680,BioRad)在490nm下测定析光 值。

流动式细胞测量术分析。将细胞生长至70-80％满,并以含有10mMEDTA的 PBS收取。以Ficoll-PaquePlus密度梯度分离法制备末梢血球单核细胞。以FACS 缓冲液(含1％胎牛血清的PBS)清洗及悬浮细胞后,细胞在4℃下以5×10⁹、1×10⁹cfu 的个别噬菌体克隆或对照组噬菌体分别培养1小时。以FACS缓冲液清洗二次后, 细胞在4℃下以小鼠抗M13单株抗体(GEHealthcare)培养1小时，其中稀释倍率为 1:2000，之后以藻红素(phycoerythrin；PE)共轭结合的山羊抗小鼠二次抗体(Jackson ImmunoResearch)培养30分钟,其中稀释倍率为1:250。以FACSCantoII(Becton Dickinson)测定发射的荧光信号并以FlowJo软件分析。

噬菌体DNA序列的确定。经选取的噬菌体克隆是以1/6体积的聚乙二醇 (PEG)-NaCl[20％(wt/vol)PEG8000及2.5MNaCl]放大及沉淀。将噬菌体沉淀物再 次悬浮在100μl的碘缓冲液(10mMTris-HCl,pH8.0、1mMEDTA、4MNaI),并在 室温下以250μl的100％乙醇培养10分钟。在离心后分离噬菌体DNA、以70％ 乙醇清洗、风干、及以50μl的二次蒸馏水再次悬浮。以二脱氧核苷酸链终止法 (di-deoxynucleotidechainterminationmethod)确认经纯化的噬菌体DNA序列，其是 使用自动化DNA序列仪(ABIPRISM377,Perkin-Elmer,CA,USA)。以–96gIII测序 引物5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG–3’(SEQIDNO:23)进行测序,该引物对应 于噬菌体次要壳蛋白pIII基因序列。

体内标靶及竞争试验的动物模式。将5×10⁶个HCT116细胞皮下(s.c.)注射至非 肥胖糖尿病/联合免疫缺陷(Non-obesediabetic-severecombined immunodeficiency；NOD/SCID)小鼠的背外侧腹。当异种植入肿瘤尺寸达到300±50 mm³时,小鼠以2×10¹¹pfu的标靶噬菌体或对照组噬菌体M13KO7进行静脉(i.v.)注 射。在注射后7分钟,将小鼠牺牲,且通过心脏灌流50mL的PBS以清洗未结合的噬 菌体。在灌流后,取出异种植入肿瘤及小鼠器官、以冰冷PBS清洗三次、及切成碎 块,其中一些进行均质化。以对数期大肠杆菌ER2738培养物回收结合至各组织标 本的噬菌体,并滴定在LB/IPTG/X-Gal琼脂培养盘。在肽竞争性抑制实验中,共同注 射2×10⁹pfu的噬菌体与100μg的对应肽或不相关的对照组肽。

噬菌体在异种植入肿块的免疫组织化学定位。将取自体内噬菌体归巢实验的 组织标本包埋在冷冻蜡块。欲以免疫组织化学法评估各组织的噬菌体分布，将冷 冻样本切成8-μm厚的切片并收集在经涂布的玻片。以冰冷PBS清洗玻片以移除 OCT，并在室温下以4％聚甲醛固定10分钟。欲阻断内源性过氧化酶活性，在室 温下将玻片浸泡在含有3％过氧化氢的甲醇中30分钟。通过室温下将切片浸入含 有1％BSA的PBS中30分钟，阻断非专一性抗体结合位点。组织切片以小鼠抗 M13单株抗体培养1小时，其稀释倍率为1:250；之后加入SuperEnhancer试剂 (SuperSENSITIVE^TMPolymerHRPDetectionSystem/DAB,BioGenex)中反应20分钟 及在Poly-HRP试剂(BioGenex)中反应30分钟。在清洗后,切片以DAB(3,3’-二胺基 联苯胺)色素原(BioGenex)显影,其中补充StableDAB缓冲液。加入PBS终止反应。 在细胞核染色方面,将玻片浸入苏木精(hematoxylin)中5分钟,且随后以覆盖液覆盖 以终止反应。拍摄切片影像,并以自动化撷取系统(TissueGnostics)分析。

通过免疫组织化学法的噬菌体克隆肿瘤结合分析。人类大肠癌手术标本是取 自台湾大学附设医院病理部(DepartmentofPathology,NationalTaiwanUniversity Hospital)样本库。将OCT包埋的冷冻组织蜡块切成8-μm厚的组织切片、收集在经 涂布的玻片、及在室温下以2％聚甲醛固定10分钟。将含有3％过氧化氢的甲醇加 至玻片上30分钟,之后以含有1％BSA的PBS阻断30分钟。样本以小鼠抗M13 单株抗体培养1小时,其稀释倍率为1:200,之后加入SuperEnhancer试剂(Super SENSITIVE^TMPolymerHRPDetectionSystem/DAB,BioGenex)中反应20分钟及在 Poly-HRP试剂(BioGenex)中反应30分钟。在清洗后,切片以DAB(3,3’-二胺基联苯 胺)色素原(BioGenex)显影,其中补充StableDAB缓冲液,且加入PBS终止反应。在 细胞核染色方面,将玻片浸入苏木精中5分钟,且随后以覆盖液覆盖以终止反应。拍 摄切片影像,并以自动化撷取系统(TissueGnostics)分析。

肽合成及标记。肽是在CEMLiberty自动化微波肽合成仪(Matthews，NC，USA) 合成，其使用标准Fmoc系固相化学、HOBt/HBTU活化、及Wang树脂(0.55meq/g 取代)。生物素化形式的肽包括一额外的N端或C端生物素及Gly-Gly-Gly间隔子。 肽是N端以生物素ρ-硝基苯基酯(biotinρ-nitrophenylester；biotin-ONp)生物素化。生 物素NOVATAG^TM树脂是用在C端生物素化肽的合成。以二阶段加入7ml含有 20％哌啶的DMF进行去保护反应，其中初始去保护为45℃下30秒，之后为75℃ 下3分钟。在75℃下，以5当量的Fmoc-AA-OH与1:1:1AA/DIC/Oxyma反应5 分钟，完成偶合反应。在合成完成后，在室温下以TFA/TIS/水(95:2.5:2.5)自树脂裂 解肽2.5小时，之后沉淀并加入冰冷乙醚清洗。

肽-PEG-DSPE共轭体的合成。将含有N-羟基琥珀酰亚胺基-羧基聚乙二醇 (MW,3400)衍生的二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺(distearoylphosphatidyl ethanolamine；NHS-PEG-DSPE；8.5mg)的0.25ml二氯甲烷加入含有3.1mg肽的0.25 mlDMSO。其之后与0.011ml的三乙基胺混合以催化反应。肽与NHS-PEG-DSPE 的化学计量摩尔比为1.1:1。反应是在室温下进行72小时。以2kDa截止膜(cut-off membrane；Spectrum)透析，以纯化肽-PEG-DSPE共轭体，之后以冷冻干燥法干燥。

细胞存活率试验。细胞以每孔1，000个细胞种植在96孔培养盘，并在37℃ 下以含有不同浓度药物的培养基培养72小时。以MTT试验检测细胞存活率,其是 根据制造商的说明。各试验重复四次。数据是以细胞存活百分比表示,并比较未经 处理的对照组细胞。

肽-微脂体性药物的制备。脂质薄膜水合法(lipidfilmhydrationmethod)是用在 制备聚乙二醇化(PEGylated)微脂体,该微脂体由二硬脂酰基磷脂酰基胆碱 (distearoylphosphatidylcholine)、胆固醇、及mPEG₂₀₀₀-DSPE组成,其之后用在包膜 多索如比辛(3:2:0.3摩尔比)或温诺平(3:2:0.15摩尔比)。脂质薄膜是在60℃的250 mM硫酸铵或300mM5-磺柳酸铵盐溶液水合,并在55℃下以高压挤压设备(Lipex Biomembranes,Vancouver,BritishColumbia)挤压通过0.1μm孔径的聚碳酸酯滤膜。 多索如比辛及温诺平是以遥装法(remoteloadingmethod)包膜,其中每10μmol磷脂 质的包膜浓度为1mg的多索如比辛及3.5mg的温诺平。以磷酸盐试验评估微脂体 的最终浓度。随后,将肽-PEG-DSPE并入预成形的微脂体，其是在60℃共培养0.5 小时，该温度为脂质双层的转变温度，并伴随轻晃。以Sepharose4B(GEHealthcare) 凝胶过滤层析法移除释出的游离药物、未经共轭结合的肽、及未经并入的共轭体。 测定溶析液分液的多索如比辛浓度,其是以分光荧光计(SpectraMaxM5,Molecular Devices)测定λEx/Em＝485/590nm的荧光强度。以HPLC方法测定温诺平浓度。

pHCT74肽结合蛋白的鉴定。将HCT116细胞生长至70-80％满,并以含有10mM EDTA的PBS收取。将生物素化的pHCT74肽加入细胞并在4℃下培养1小时。 在培养后,以冰冷PBS清洗细胞,并将DTSSP溶液加入,使最终浓度达到2mM。反 应混合物在冰上培养2小时。加入20mMTris-HCl终止反应。以MEM-EukaryoticMembraneProteinExtractionReagentKit(ThermoFisher Scientific,Rockford,IL,USA)制备细胞膜裂解液,其是根据制造商的说明。将 MYONE^TMStreptavidinC1(Invitrogen,CA,USA)加入上述蛋白质裂 解液且充分混合。以免疫-磁性分离法(immuno-magneticseparation)下拉(pulldown) 肽-蛋白质复合体。最后,以SDS-PAGE分离经纯化的蛋白质,并以 SILVERQUESTTMSilverStainingKit(Invitrogen,CA,USA)进行银染。以胰蛋白酶 (trypsin)分解蛋白质带,并以LC/MS/MS鉴定肽片段。进行蛋白质鉴定,其是以 Mascot(MatrixScience,London,UK)及TurboSequest搜索引擎(ThermoFisher Scientific,Rockford,IL,USA)搜寻SwissProteinDatabase。

体内肿瘤标靶医疗研究。将癌细胞(5×10⁶)皮下注射至雌性 NOD.CB17-Prkdc^scid/J小鼠(4-6周大)的背外侧腹。随后，将含有异种植入的小鼠随 机分成数组以进行不同处理。经由尾静脉注射，每周投予药物二次，且连续四周。 以电子秤及测径仪测量体重及肿瘤尺寸。以下列公式计算肿瘤体积:长度×(宽度)²×0.52。在实验结束时，移除各小鼠的肿瘤块及其内脏器官如大脑、肺脏、心脏、 肝脏、及肾脏，并以OCT包埋，以进行进一步的组织病理学检查。根据台湾中央 研究院(AcademiaSinica,Taiwan)的方针进行动物照护。

原位植入及医疗研究。原位植入方法学是详述在先前的报告(Tsenget al.,2007)。HCT116细胞是以Lenti-luc病毒(含有荧光素酶基因的慢病毒(lentivirus)) 感染。以NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ)用在原位植入。将小鼠麻醉, 是以剂量250mg/Kg的2,2,2-三溴乙醇(阿佛丁；Avertin)(SIGMAChemicalCo)进行 腹腔注射。在原位植入程序方面,进行1公分的剖腹手术(laparotomy),并取出盲肠及 升结肠。将呈指数生长的HCT116-Luc细胞(表达荧光素酶的HCT116细胞)接种至 盲肠壁。将肠送回腹腔,并以吸收性5-0薇乔缝线缝合腹部及以5-0普理灵缝线缝合 皮肤。以生物发光造影监控肿瘤发育。在原位医疗研究方面,小鼠随后以不同制剂 的抗癌药物处理。以生物发光定量法监控肿瘤进展。测定小鼠体重及存活率。根 据台湾中央研究院的方针进行动物照护。

统计分析。发明人以双面非配对Student'st检定分析噬菌体效价、肿瘤体积、 体重、及多索如比辛浓度数据。发明人将所有分析的P值低于0.05者视为具显着 性。数值以平均值±标准偏差(S.D.)表示。

结果

通过体外噬菌体展示筛选识别大肠癌-标靶肽配体

发明人进行体外淘选，其始于噬菌体展示的12单体随机肽库，并以HCT116 细胞作为标靶细胞。在五回的亲和性选取后，相比于第一回，观察到第五回的回 收率增加28.7倍。由第五回选取随机取得个别噬菌体克隆以进一步筛选。发明人 以95个噬菌体克隆进行第一次确效，其是以HCT116细胞进行ELISA试验。在 95个经选取的噬菌体克隆中，有59个显示弱或无结合。然而，相比于对照组无插 入噬菌体(M13KO7噬菌体)，有36个噬菌体展示肽具有高特异性结合。以多重序 列比对软件比较取自候选噬菌体的肽序列。在数组相关序列中识别出肽模体(图8， 表1)。

欲厘清经选取的噬菌体结合至标靶细胞的分泌或细胞内蛋白的可能性，以流 动式细胞测量分析法确认细胞表面结合活性。结果显示，36个噬菌体克隆中有7 个强力反应在HCT116细胞的表面受体，而8个噬菌体克隆具有中度反应性，其 余仅呈现弱反应性。选取对HCT116具有高度表面结合活性的噬菌体克隆以进一 步进行体内确效。

大肠癌标靶噬菌体克隆肿瘤归巢能力的体内确效

欲评估经选取的噬菌体克隆的体内标靶能力，以2×10¹¹pfu的经选取的噬菌体 或对照组噬菌体经由尾静脉注射在含有HCT116异种植体(300mm³)小鼠。噬菌体 是经循环，之后以PBS缓冲液灌流，以洗去循环中的非特异性结合物。在灌流后， 发明人回收及测定肿瘤块及正常器官的噬菌体效价。结果显示，相比于正常器官 如大脑、肺脏、及心脏，3个噬菌体克隆(HCT63、HCT69、及HCT74)，而非对照 组噬菌体，是明显在肿瘤块中累积。

此外，发明人以肿瘤归巢实验确认3个经选取的噬菌体的组织分布。以抗噬 菌体抗体进行衍生自肿瘤及正常器官的冷冻组织切片的免疫染色。结果显示， HCT63、HCT69、及HCT74噬菌体是选择性定位在肿瘤组织而非正常器官组织如 大脑、心脏、肺脏、及结肠(图1A及B)。不令人意外地，对照组噬菌体无法在肿 瘤及正常器官组织中检出免疫反应性(图1B)。

以肽竞争性抑制实验进一步确认HCT63、HCT69、及HCT74噬菌体的肿瘤归 巢能力。以含HCT116异种植体的小鼠共同注射HCT63、HCT69、及HCT74噬菌 体克隆与同型同源合成肽；其分别为pHCT63、pHCT69、及pHCT74肽(分别为SEQ IDNOs:1-3)。结果显示，同源肽明显抑制噬菌体颗粒在肿瘤组织的回收率(图1C)。

经选取的噬菌体克隆结合至各人类癌细胞的确效

欲进一步评估是否其他人类大肠癌(hCRC)细胞可受经选取的噬菌体克隆的每 一者辨识，将5种hCRC细胞株，包括HCT116、HT29、LS174T、SW620、及 COLO205，培养在经选取的噬菌体，并以FACS分析其结合活性。结果显示，HCT63 噬菌体强力反应在HCT116、HT29、LS174T、及SW620，但仅中度反应在COLO205 细胞。HCT69及HCT74噬菌体展示对HCT116、HT29、及SW620具高结合亲和 性、对LS174T细胞具中度亲和性、及对COLO205细胞株仅具弱亲和性(图2A)。

欲确认经选取的噬菌体克隆未交叉反应在正常细胞，发明人检测各经选取的 噬菌体与周边末梢血球单核细胞(PBMC)间的结合亲和性。人类PBMC是首先经分 离，并以各个别的噬菌体植株培养，之后以FACS分析法进行分析。结果显示， 所有经选取的噬菌体对PBMC不具结合活性(图2A)。HCT63、HCT69、及HCT74 噬菌体克隆能结合至hCRC细胞，而非正常细胞。选择此3个噬菌体克隆进行进 一步研究。

欲评估3个经选取的噬菌体克隆对各人类癌细胞株的结合活性，进行细胞 ELISA以检测16种人类癌细胞株，包括A498、HTB-10、B16-F10、SKOV3、PC-3、 U2OS、1112SK、H184、SAS、H460、MIAPaca-2、HCT116、HUVAC、CL1-5、 Mahlavu、及MDA-MB-231。结果显示，所有3个经选取的噬菌体对各癌细胞株呈 现大的结合活性。HCT63对所有癌细胞株呈现高结合特异性，除了HTB-10以外。 HCT69及HCT74显示高度特异性结合至A498、B16-F10、SKOV3、PC-3、U2OS、 1112SK、H184、SAS、H460、MIAPaca-2、HCT116、HUVAC、Mahlavu、及 MDA-MB-231，但仅中度结合至HTB-10及CL1-5。

利用免疫组织化学方法，以大肠癌病患的手术标本进一步测试经选取的噬菌 体对hCRC细胞的结合特异性。结果显示，所有3个经选取的噬菌体可辨识大肠 癌手术标本的肿瘤细胞，而非其正常对应体。对照组噬菌体在肿瘤组织未显示免 疫反应性(图2B)。

hCRC标靶药物输送纳米载体的生产及确认

欲厘清有效化学治疗剂以治疗大肠癌，发明人检测数个抗癌药物的细胞毒性。 温诺平显示细胞毒性轮廓明显优于FDA批准的其他结肠癌及直肠癌药物。在本研 究中，选择多索如比辛及温诺平进行脂质系纳米颗粒包膜。微脂体多索如比辛是 第一个FDA批准的微脂体性药物，且为抗癌剂的微脂体制剂最广为使用的成员。 遵照完善建立的步骤，可易于制备微脂体多索如比辛(图3A及B)。然而，相同方 法可能无法直接应用在开发微脂体性温诺平，是因其高膜通透性及不同药物滞留 性质。发明人成功地以改进的脂质结合物建立稳定的温诺平微脂体性制剂(sLV)， 并以5-磺基水杨酸铵梯度法负载温诺平。温诺平可在微脂体内捕获及沉淀(图3A)。 并入不同药物的微脂体平均粒径，如动态光散射分析仪的测定，其范围为90至110 nm(图3B)。微脂体的ζ电位(zetapotential)范围为-20至-30mV(图3B)。

由于对hCRC细胞的特异性结合亲和性及体内肿瘤归巢能力，选择在HCT63、 HCT69、及HCT74噬菌体展示的肽配体进行后续研究。其相对应的合成肽是分别 称作pHCT63、pHCT69、及pHCT74。通过将肽配体偶合至商业上可购的NHS活 化的聚乙二醇化脂质，合成DSPE-PEG₃₄₀₀-pHCT63及DSPE-PEG₃₄₀₀-pHCT74。肽- 脂质共轭体是以冻干法及透析法纯化，并以质谱确认结构。pHCT63-PEG₃₄₀₀-DSPE 及pHCT74-PEG₃₄₀₀-DSPE共轭体的主要尖峰是分别集中在5631.544及5651.576 质荷比，其与肽-脂质共轭体的经计算分子量一致(图3C)。随后，经由后插入技术 (post-insertiontechnique)，将共轭体并入微脂体多索如比辛或微脂体温诺平，以形 成hCRC标靶微脂体。在肽后插入后，微脂体的型态、尺寸分布、及ζ电位未显着 改变(图3D及E)，显示此过程不改变此微脂体性药物的安定性。

微脂体性药物体外标靶至hCRC细胞

欲确定是否合成的pHCT63及pHCT74肽具标靶活性，发明人检测含有微脂 体的肽的输送效果，其是通过测定微脂体多索如比辛内化进入HCT116细胞的量。 后插入各浓度的肽-PEG₃₄₀₀-DSPE的多索如比辛负载的微脂体是在各时间周期内 培养。在第0.5、1、4、6、及24小时的时间点，测定HCT116细胞摄取 pHCT63^0.5％-LD(肽-PEG₃₄₀₀-DSPE与磷脂质在0.5摩尔％的比)、pHCT63^5％-LD、 pHCT74^0.5％-LD、pHCT74^5％-LD、及非标靶的LD的动力学(图3F)。在微脂体与细 胞的培养且接着清洗以移除任何未结合的纳米颗粒后，将细胞及微脂体溶解，并 通过测定总多索如比辛的荧光而量化经内化的多索如比辛。

结果显示，相比于非标靶对照组，细胞以pHCT63^0.5％-LD培养24小时，细胞 内多索如比辛摄取增加2.1倍。由于pHCT63-PEG₃₄₀₀-DSPE的比由0.5％增至5％， 相比于相同条件下的LD，多索如比辛摄取由2.1倍增至5.2倍。然而，pHCT74 标靶肽明显提升微脂体多索如比辛输送至HCT116细胞。在初期培养期间， pHCT74-LD摄取的增加比pHCT63-LD的更快。pHCT74^0.5％-LD及pHCT74^5％-LD 证实药物摄取至多比非标靶的LD多11至16倍(图3F)。此结果显示，微脂体表面 的低pHCT74肽密度足以改进微脂体输送。

相比于非标靶对照组，pHCT74-LD明显提升微脂体输送至hCRC细胞。虽然 pHCT63-LD亦证实提升输送至HCT116细胞，但相比于pHCT74-LD，其改进是中 度。明显地，pHCT74微脂体的输送效果证实比pHCT63微脂体的更高。此结果显 示，作为输送微脂体至hCRC细胞的标靶配体，pHCT74肽是优于pHCT63肽。

合理推测，细胞摄取增加将改进微脂体多索如比辛的细胞毒性。因此，发明 人试图确认此假设，其是比较各含有多索如比辛负载的微脂体的肽细胞毒性效应。 如预期，根据药物累积的结果，pHCT63-LD及pHCT74-LD比非标靶微脂体更具 细胞毒性(图3G)。各微脂体制剂所测得的IC₅₀值是详述在图3H。pHCT63-LD及 pHCT74-LD的IC₅₀值低于非标靶LD约2倍。更重要地，IC₅₀值随肽浓度的增加 而降低。发明人亦开发温诺平负载的标靶微脂体。如预期，pHCT74-sLV明显提升 药物对HCT116细胞的细胞毒性(图3I)。pHCT74-sLV的IC₅₀值是低于非标靶sLV 的4.23倍(图3J)。

hCRC标靶微脂体的药物动力学及生物分布

在药物动力学分析方面，pHCT74-LD及LD是以相符的2mg多索如比辛/kg 经由尾静脉注射投予至NOD.CB17-Prkdc^scid/J小鼠。在所选的时间点采集血液样 本，并分析多索如比辛的量。以荧光定量法进行确效分析。在整个研究中， pHCT74-LD及LD的血液轮廓随时间逐渐下降的情况类似。在投予二微脂体性药 物制剂后，测定pHCT74-LD及LD在肿瘤及各器官的生物分布时间进程。每克肿 瘤1.95±0.58μg多索如比辛的肿瘤最大总多索如比辛浓度发生在pHCT74-LD投 予后24小时，并在注射后72小时维持1.60±0.99μg/g。2mg/kg(0.98±0.42μg/g)LD 的最大肿瘤累积发生在投剂后48小时，并在72小时注射后随时间逐渐降至0.73± 0.18μg/g。在24小时，相比于LD，pHCT74-LD观察到1.95倍高的肿瘤累积。相 反地，在各时间点，所有非恶性组织的pHCT74-LD分布是类似在LD。pHCT74-LD 的肿瘤多索如比辛AUC0-72是106.69±36.13μgh/g，且LDAUC0-72是57.53± 17.93μgh/g，代表经处理小鼠的多索如比辛AUC0-72增加1.85倍。

欲测定生物可用性(bioavailable)药物在肿瘤细胞中的量，本发明人在生物分布 分析前以DPBS通过心脏左心室进行全身灌流。此操作可消除残留在血管及肿瘤 间质空间的血液及微脂体。在全身灌流后，收取肿瘤块、大脑、心脏、肺脏、肝 脏、及肾脏，并定量多索如比辛。发明人以细胞内多索如比辛的累积作为微脂体 性药物的生体可用率的指示剂。通过静脉注射，将LD及pHCT74-LD投予至含有 肿瘤(HCT116)的小鼠(NOD.CB17-Prkdc^scid/J)，其相符于1mg多索如比辛/kg。在不 同时间点，以荧光定量法测定血液的多索如比辛浓度。pHCT74-LD及LD的血液 轮廓类似。在投剂后24小时，达到0.76±0.14μg/g的尖峰量前，1mg/kgpHCT74-LD 的肿瘤摄取逐渐增加，并在72小时维持0.28±0.20μg/g。1mg/kgLD的最大肿瘤 摄取(0.45±0.17μg/g)发生在投剂后24小时，且注射后72小时几乎不随时间变化 (0.18±0.06μg/g)。在24小时，相比于LD，观察到1.69倍高的pHCT74-LD摄取。 pHCT74-LD的肿瘤多索如比辛AUC0-72是35.17±6.50μgh/g，且LDAUC0-72 是20.62±5.87μgh/g，代表经处理小鼠的多索如比辛AUC0-72增加1.71倍。在多 数非恶性组织中，注射后最初1小时的两药物摄取量低。两药物的肝脏及肾脏摄 取在24小时逐渐增加，之后缓慢下降。

pHCT74肽的靶蛋白鉴定

本发明人提出使用生物素化pHCT74肽及化学交联剂DTSSP，以鉴定HCT116 细胞的膜上未知靶蛋白。图4A显示实验设计示意图。生物素分子是共轭结合至合 成的pHCT74肽C端。以流动式细胞测量术评估生物素化pHCT74肽结合至 HCT116细胞的特性，以分析结合作用的浓度依赖性(图4B)。此单一生物素加至肽 C端不会影响细胞结合活性。HCT116细胞的膜蛋白是与生物素-pHCT74肽结合、 以DTSSP交联；之后进行SDS-PAGE分离及LC/MS/MS分析。通过银染检测到 尖带(图4C)，且后续在胰蛋白酶分解后以LC/MS/MS分析。12个胰蛋白酶分解肽 经鉴定为α-烯醇酶(ENO1)片段，其是通过基于MASCOT软件的搜寻算法。经鉴 定的肽的α-烯醇酶序列覆盖率是57％，且机率评分是424(图4D)。

欲进一步确认α-烯醇酶为pHCT74肽的靶蛋白，测定HCT74噬菌体结合活性 与ENO1表达间的相关性。发明人建立表达shRNAs标靶ENO1基因的稳定细胞 株(图4E)，并以流动式细胞测量术测试HCT74噬菌体的结合活性。在ENO1基因 减量后，HCT74噬菌体的结合活性降低(图4F)。相反地，在短暂过度表达ENO1 基因后，HCT74噬菌体的结合活性增加(图4G)。结论为，ENO1的表达与HCT74 噬菌体的结合活性一致。此外，亦以直接ELISA试验确认HCT74噬菌体特异性结 合至α-烯醇酶蛋白(图4H)。

肽标靶微脂体性药物在人类大肠癌异种植体的医疗效果

以含有HCT116及SW620大肠癌肿瘤的小鼠测试肽标靶微脂体性药物的体内 抗肿瘤活性。欲评估全身性投予pHCT74-LD并比较LD的抗肿瘤效果， NOD.CB17-Prkdc^scid/J是皮下接种HCT116及SW620肿瘤。将含有大肠癌异种植体 (～100mm³)的小鼠分成四组以进行不同处理：A，pHCT74-LD；B，FD；C，LD； 以及D，PBS。治疗是经由尾静脉注射投予，每3.5日1mg/kg，共8剂，总累积 剂量为8mg/kg。HCT116异种植入模式在第28天时，相比于未经处理的对照组， 投予pHCT74-LD明显抑制肿瘤生长达80.1％(p<0.01)，而处理LD及FD分别抑 制肿瘤生长达65.8％(p<0.01)及44.6％(p>0.01)(图5A)。在第28天，LD组的肿瘤尺 寸逐渐增至pHCT74-LD组的1.72倍。在处理结束时，以pHCT74-LD处理小鼠的 最终平均肿瘤重量为0.15g，相对于以LD处理小鼠的0.24g及以PBS缓冲液注射 小鼠的1.1g(图5B及C)。pHCT74-LD的生长抑制比LD的更明显(p<0.01)。SW620 异种植体的治疗观察到类似结果。在含SW620异种质体小鼠，以pHCT74-LD处 理的肿瘤尺寸明显比非标靶LD处理的小(图5D、E、及F)。在处理期间，pHCT74-LD 组及LD组不具明显体重变化。

亦评估温诺平负载的pHCT74标靶微脂体对HCT116细胞皮下异种植入的 NOD.CB17-Prkdc^scid/J小鼠的生长抑制效果。治疗是经由尾静脉注射投予，每3.5 日1.5mg/kg，共8剂，总累积剂量为12mg/kg。在第28天，相比于未经处理的对 照组，投予pHCT74-sLV明显抑制肿瘤生长达68％(p<0.01)，而以sLV处理抑制肿 瘤生长达34％(p<0.01)(图5G)。在第28天，sLV组的肿瘤尺寸逐渐增至pHCT74-sLV 组的2.1倍。在处理结束时，以pHCT74-LD处理小鼠的最终平均肿瘤重量为0.21g， 相对于以LD处理小鼠的0.45g及以PBS缓冲液注射小鼠的0.86g(图5H及I)。 pHCT74-sLV的生长抑制比sLV的更明显(p<0.01)。

体内全身性投予pHCT74-LD及pHCT74-sLV的组合对HCT116异种植入肿瘤 小鼠模式的影响

接着，本发明人测定是否pHCT74肽可改进多索如比辛与温诺平的组合治疗 效果。发明人以42只NOD.CB17-Prkdc^scid/J小鼠(每组6只小鼠)建立HCT116异种 植入。一旦肿瘤达到280mm³尺寸，则发明人每3.5日静脉注射(i.v.)载具(PBS)、 LD(1mg/kg)、sLV(1.5mg/kg)、LD(1mg/kg)与sLV(1.5mg/kg)、pHCT74-LD(1mg/kg)、 pHCT74-sLV(1.5mg/kg)、或pHCT74-LD(1mg/kg)与pHCT74-sLV(1.5mg/kg)以处理 小鼠，总共处理8剂。

1mg/kgLD与1.5mg/kgsLV中度抑制肿瘤生长，而LD与sLV的组合治疗导 致统计上明显抑制肿瘤生长(图6A)。在第35天，相比于未经处理的对照组，投予 LD(1mg/kg)与sLV(1.5mg/kg)抑制肿瘤生长达92.1％，而以LD及sLV处理分别抑 制肿瘤生长达50.6％及73.3％。此外，接受pHCT74标靶微脂体性药物的组别具有 比所有非标靶微脂体处理组别更佳的肿瘤生长抑制。投予pHCT74-LD(1mg/kg)与 pHCT74-sLV(1.5mg/kg)明显抑制肿瘤生长达97.4％，而以pHCT74-LD及 pHCT74-sLV处理分别抑制肿瘤生长达67.5％及83.1％。在处理结束时，将肿瘤组 织切片及秤重(图6C及D)。以pHCT74-LD与pHCT74-sLV的组合处理小鼠的最 终平均肿瘤重量为0.038g，相对于以PBS缓冲液注射小鼠的2.46g。相比于未经处 理的对照组，以pHCT74-LD与pHCT74-sLV的组合治疗明显抑制肿瘤生长达 98.4％。此外，以1mg/kgpHCT74-LD与1.5mg/kgpHCT74-sLV的组合处理，有六 分之三的肿瘤根除(图6E及6D)。

在许多人类癌症病例，肿瘤变大时才能检测。由于pHCT74-LD与pHCT74-sLV 的组合治疗为hCRC的候选治疗策略，发明人测定此组合对大型肿瘤模式的功效。 发明人以载具(PBS)、LD(1mg/kg)、sLV(2mg/kg)、LD(1mg/kg)与sLV(2mg/kg)、 pHCT74-LD(1mg/kg)、pHCT74-sLV(2mg/kg)、或pHCT74-LD(1mg/kg)与 pHCT74-sLV(2mg/kg)静脉注射处理含有大型HCT116异种植体(650mm³)小鼠，共 8剂。发明人随后测量肿瘤体积以分析肿瘤发育(图6F)。大型HCT116异种植入模 式的治疗观察到类似结果。1mg/kgLD及2mg/kgsLV中度抑制肿瘤生长，而LD 与sLV的组合治疗导致统计上显着抑制肿瘤生长。相比于单独的微脂体性药物， 共同处理pHCT74-LD与pHCT74-sLV提升肿瘤生长抑制。此外，以1mg/kg pHCT74-LD与2mg/kgpHCT74-sLV的组合处理，大型肿瘤动物模式有六分之二的 肿瘤根除(图6F)。组合化疗的毒性轮廓是可比拟。在实验期间，在处理小鼠未观 察到致死毒性或明显失重，显示治疗不产生任何明显毒性(图6B及G)。这些结果 显示，pHCT74-LD与pHCT74-sLV组合的医疗效果明显优于其他大肠癌异种植入 模式的制剂。

组合治疗在原位大肠癌模式的医疗潜力

基于皮下注射癌细胞株的模式，可能无法准确再现人类结肠癌生物学。欲研 究医疗对大肠微环境的影响，发明人开发大肠癌原位小鼠模式，以概括大肠癌病 患的肿瘤生长态样。发明人评估组合pHCT74标靶微脂体性多索如比辛及微脂体 性温诺平经由静脉注射投予至人类CRC原位模式的体内抗肿瘤潜力，其是以 HCT116-Luc肿瘤稳定表达萤火虫荧光素酶。以生物发光造影进行非侵入性原位肿 瘤生长的监控。在首次医疗注射前(肿瘤细胞植入后5天)，以生物发光造影检测生 长的原位肿瘤，发现其主要定位在结肠及直肠(图7A)。

小鼠隔日以单独的载具(PBS)、FD(1mg/kg)+FV(2mg/kg)、LD(1mg/kg)+ sLV(2mg/kg)、或pHCT74-LD(1mg/kg)+pHCT74-sLV(2mg/kg)处理，共16天。每 周进行二次生物发光，以监控肿瘤负荷。生物发光影像显示，相比于载具对照组 或FD(1mg/kg)+FV(2mg/kg)组，LD(1mg/kg)+sLV(2mg/kg)处理组及 pHCT74-LD(1mg/kg)+pHCT74-sLV(2mg/kg)处理组有明显肿瘤生长抑制(图6A及 B)。此外，pHCT74-LD与pHCT74-sLV组合治疗显示提升抗肿瘤功效及延长原位 人类结肠癌小鼠存活率(图7D及E)。图7D显示所有组别的卡本-麦尔存活曲线 (Kaplan–Meiersurvivalcurves)。在研究结束时，PBS、FD+FV、LD+sLV、及 pHCT74-LD+pHCT74-sLV处理组的中位数存活时间分别为32、37、53.5、及64.5 天(图7D及E)。对数秩(log-rank)(曼特尔-考克斯(Mantel-Cox))检定的存活分析显示， 相比于PBS、FD+FV、及LD+sLV，pHCT74-LD+pHCT74-sLV治疗明显延长 动物存活率(图7F)。

总之，发明人成功辨别结合至hCRC细胞的特异性肽，其是经由体外生物淘 选且使用人类大肠癌(hCRC)细胞株。辨别出三个标靶大肠癌的高亲和性噬菌体克 隆，且以细胞ELISA及流动式细胞测量术确认其结合活性。经证实，hCRC标靶 噬菌体识别5个大肠癌细胞株及大肠癌病患的手术标本。以体内异种植入模式确 认hCRC标靶噬菌体的肿瘤归巢能力。欲评估是否hCRC标靶肽可用在提升抗癌 药物的医疗效果，发明人合成包膜多索如比辛及温诺平的肽介导微脂体。以含肿 瘤小鼠进行的生物分布研究显示，在投予后，共轭结合至微脂体性多索如比辛的 hCRC标靶肽是定位在肿瘤组织。hCRC标靶肽共轭结合的微脂体性药物明显抑制 小鼠异种植入模式的hCRC肿瘤生长，其与生物分布研究一致。发明人测定多索 如比辛及温诺平组合对HCT116细胞的医疗效果。由pHCT74肽介导的标靶微脂 体明显增加医疗效果，其是通过提升药物输送至肿瘤位点，且同时降低毒性药物 至正常细胞的相对可用率。

以pHCT74肽改进的微脂体具有与非标靶微脂体相同的血浆药物动力学，显 示标靶微脂体制剂的血中安定性如同非标靶微脂体。此外，pHCT74介导的标靶微 脂体提升肿瘤组织的药物累积，而不影响药物输送至非癌性宿主组织或提升宿主 毒性(图6B、6G、及7C)。

过去十年中，标靶药物输送系统是经开发，并在临床前体外及体内模式中广 泛研究，但仅少数令人信服的结果有效用在临床环境。近年来，抗体-药物共轭体 (ADC)的临床上成功经验提供令人信服的策略，以发展高度有效的抗癌药物。ADC 包含强效细胞毒性药物，其是经由化学连接符连接至抗体。多数ADC所面临的主 要挑战之一为其相对低的药物容量。除了ADC以外，迫切需要以不同概念达到相 同结果的更有效的负载策略。最令人信服的药物载体之一为配体标靶纳米颗粒。

在本研究中，发明人以脂质系纳米颗粒作为载体，以包膜化学治疗剂，达到 高药物负载效果。包膜在纳米颗粒的药物经测定每摩尔磷脂质含有至多100g(多索 如比辛)或350g(温诺平)药物。发明人生产平均粒径100nm的纳米颗粒。各纳米颗 粒含有约14,700个多索如比辛或36,000个温诺平分子。此代表容量的改进，是大 于ADCs3,600至18,000倍。开发配体标靶纳米颗粒似乎为合乎逻辑的方法，以克 服不仅是药物负载容量，还有肿瘤细胞特异性，因此导致更有效的标靶药物，其 具有更高效果及更低毒性(图5-7)。

发明人成功鉴定α-烯醇酶作为pHCT74肽的靶蛋白。α-烯醇酶是一多功能蛋 白，其涉及多种过程，如代谢、生长控制、缺氧耐受性、细胞外基质降解、肿瘤 转移、及过敏反应。其是细胞质的关键糖解酶，其是催化2-磷甘油酸转换为磷烯 醇丙酮酸。癌细胞是与糖解及葡萄糖运输的速率增加有关，且与缺氧条件下无氧 糖解(称作瓦堡效应(Warburgeffect))的增加有关。数个报告显示，癌症变异型的α- 烯醇酶在mRNA及/或蛋白质层次是向上调节，该癌症包括结肠癌、乳癌、神经胶 质瘤、肺癌、白血病、肝细胞癌、食道癌、头颈癌、胰脏癌、前列腺癌、睾丸癌、 及卵巢癌。

除了糖解酶以外，α-烯醇酶亦表达在多数肿瘤细胞表面，并作为胞浆素原结合 受体。目前未知的是，不具N端信息序列或跨膜结构域的胞质液α-烯醇酶如何运 输至细胞膜及呈现在细胞表面。当α-烯醇酶定位在细胞表面时，其是与职司黏着、 迁移、及增生的uPA受体(uPAR)、整合素(integrins)、及特定细胞骨架蛋白形成多 重蛋白质复合体。在肿瘤，其可调节血管内及细胞周围的纤维溶解性活性，并促 进细胞迁移及癌症转移。此外，α-烯醇酶的表达常与癌症诊断、存活、及预后有关。 具有高度α-烯醇酶表达的病患是与较大的肿瘤尺寸、较差的结性状态、及较短的 无病间隔有关，且具有比低表达量者明显更差的临床预后。

因此，α-烯醇酶可视为人类癌症的理想医疗标靶。累积的证据显示，除了其先 天的糖解功能以外，α-烯醇酶是与癌细胞的多重抗药性有关。在5-氟尿嘧啶抗性 细胞株，α-烯醇酶在分泌体(secretome)中向上调节。亦显示，当相比于药物敏感性 细胞，其在人类乳腺阿德力霉素(adriamycin)抗性细胞有较高的表达。此外，具有 超侵入型(superinvasivephenotype)的乳癌细胞株紫衫醇(paclitaxel)抗性克隆群显示 α-烯醇酶的表达量明显增加。RNAi介导的肿瘤细胞株α-烯醇酶表达减量致使明显 增加细胞对于抗微管蛋白(tubulin)化学治疗剂(如长春新碱(vincristine)及紫衫醇)的 敏感性，但未发生在多索如比辛、依托泊苷(etoposide)、或顺铂(cisplatinum)。其显 示，α-烯醇酶涉及调节微管网络，且抗微管蛋白化学治疗剂可能具有破坏α-烯醇 酶-微管蛋白交互作用的能力。于此，发明人开发的α-烯醇酶标靶脂质纳米颗粒可 能具有克服在肿瘤细胞过度表达的α-烯醇酶的化疗抗性的潜力。

相比于对照组的非特异性处理，pHCT74改进的微脂体性药物在含有人类大肠 癌细胞的NOD.CB17-Prkdc^scid/J小鼠显示明显改进的医疗效果，且明显抑制肿瘤细 胞存活率、减少肿瘤体积与最终的平均肿瘤重量。pHCT74标靶微脂体特定地在肿 瘤细胞的快速及大量累积，导致显着的肿瘤生长消退。这些医疗结果确认 pHCT74-LD及pHCT74-sLV在肿瘤特异性结合及内化的关键角色，达到提升化学 治疗剂在肿瘤内部的局部浓度。这些结果显示，pHCT74介导的标靶癌症治疗具有 优于常规化学治疗剂或非标靶微脂体性药物的优势。发明人的结果亦鼓舞进一步 的研究，以延伸此标靶配体的应用至各种其他药物输送纳米颗粒。

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