ALDH2基因在制备预防苯乙烯致遗传毒性药物中的应用

摘要

本发明公开了ALDH2基因在制备预防苯乙烯致遗传毒性药物中的应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以Aldh2基因敲除型和野生型小鼠作为模型，小鼠吸入性暴露于苯乙烯后，检测苯乙烯在小鼠中的最终代谢产物苯乙醇酸、苯乙醛酸的浓度，用多个代表遗传毒性的生物学指标DNA基础损伤、氧化损伤和8-羟脱氧鸟苷(8-OH-dG)量化苯乙烯导致的遗传毒性。结果明确表明：ALDH2基因在苯乙烯致遗传毒性中具有调节作用，可能通过ALDH2加强苯乙烯的代谢，从而减轻苯乙烯导致的遗传毒性。因此，针对ALDH2的代谢解毒功能，ALDH2可用于制备预防苯乙烯致遗传毒性的保健品或者药物。

说明书

技术领域

本发明属于基因的功能和应用领域，涉及到ALDH2基因在制备预防苯乙烯致遗传毒性药物中的应用。

背景技术

苯乙烯是一种重要的工业原料，被广泛应用于塑料、玻璃纤维、管道、汽车船体配件以及食品包装盒等生产。不仅生产车间的职业工人可能暴露于高浓度的苯乙烯，平常百姓也可能通过吸烟、汽车尾气、地毯和食品包装盒等暴露于苯乙烯。因此，苯乙烯对人体健康是否有不良的影响，尤其，其致癌性更是受到广泛的关注。

之前研究有证据表明苯乙烯在小鼠实验具有明确的致癌性，但在人群流行病调查结果并不一致。在苯乙烯遗传毒性的研究中，进一步发现苯乙烯确实能够引起机体的DNA损伤，而且这中损伤在不同的人群中有所差异，例如，在欧美白人当中，需要暴露于相对较高浓度的苯乙烯才能引起遗传损伤，而在东亚的黄色人群里，只需暴露于相对较低的苯乙烯浓度，就能够造成显著性的遗传损伤。

然而苯乙烯导致遗传损伤的人种差异性的原因到目前为止，并不清楚。一个最有可能的设想原因是人种遗传背景的差异性，但是还没有明确那些基因能够造成这种苯乙烯引起的遗传损伤人种差异性。结合之前的研究提示，苯乙烯经过体内酶代谢之后，其中间产物的毒性可能更大，如苯乙烯7,8-环氧化物。因此本研究的重点放在与苯乙烯相关的代谢酶上，尤其是乙醛脱氢酶（ALDH2）基因是否对苯乙烯致遗传毒性有影响的研究到目前为止还没有相关的报道。

发明内容

为解决现有职业病防治的技术缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种ALDH2在制备预防苯乙烯致遗传毒性的保健品或者药品中的应用。关于人ALDH2基因序列和相关信息可以参考此链接（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/217）.

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本项发明以Aldh2基因敲除型（knockout,KO）和野生型（wildtype,WT）小鼠作为模型，两种类型的小鼠吸入性暴露于苯乙烯后，检测苯乙烯在小鼠中的最终代谢产物苯乙醇酸(mandelicacid,MA)、苯乙醛酸(phenylglyoxylicacid,PGA)的浓度，为了提高测量遗传毒性的可靠性和准确性，用多个遗传毒性的生物学指标，DNA基础损伤（TailIntensity），氧化损伤（NethOGG1DNAdamage）和8-羟脱氧鸟苷(8-OH-dG)量化苯乙烯导致的遗传毒性，进一步分析ALDH2基因在苯乙烯致遗传毒性中的功能和应用，为研究预防苯乙烯致癌性提供了科学的理论依据和实验基础。

本发明的研究成果表明，相对于WT型，KO型小鼠的尿中代谢产物MA和PGA浓度明显降低，而在遗传损伤方面，苯乙烯在KO型小鼠中引起的遗传毒性也显著高于WT型。这提示ALDH2基因在苯乙烯致遗传毒性中具有调节作用，可能通过ALDH2加强苯乙烯在人体内的代谢，达到人体DNA免受或者少受苯乙烯及其中间代谢产物的攻击，最终实现ALDH2的保护作用。

本发明的优点在于：本项研究首次发现了ALDH2基因可以缓解苯乙烯引起的遗传毒性，这对今后开发和制备预防苯乙烯致遗传毒性药物提供了重要的实验基础和科学依据。

附图说明

图1是小鼠暴露于不同浓度的苯乙烯，尿中代谢产物MA+PGA浓度在KO型和WT型的比较。从图中可以明显看出，暴露于100和200ppm的苯乙烯，无论是雄性小鼠还是雌性小鼠，KO型的尿中MA+PGA的浓度都显著低于WT型。

图2是雌雄小鼠，包括KO型和WT型，暴露于不同浓度的苯乙烯后，尿中8-OH-dG浓度。如图所示，在WT型小鼠中，无论是雄性（A图）还是雌性（C图），暴露于≥100ppm，能显著性地提高尿中8-OH-dG浓度；而在KO型小鼠中，包括双性（B图和D图）暴露于20ppm的苯乙烯，就能够引起尿中8-OH-dG的显著提升。

图3-1为不同雄性小鼠暴露于不同浓度的苯乙烯，血中白细胞的DNA基础损伤值和氧化损伤值，图3-2为不同雌性小鼠暴露于不同浓度的苯乙烯，血中白细胞的DNA基础损伤值和氧化损伤值，整体上，暴露浓度≥100ppm，苯乙烯能显著性地导致白细胞DNA基础损伤值和氧化损伤值增加，除了WT型的雄性小鼠（E图）在暴露于100ppm下，与对照组比，DNA氧化损伤有增加，但显著性只能达到边缘界。相对于WT型，KO型小鼠在暴露于20ppm下，2个遗传损伤指标值基本上都能够引起显著性增加，只有雄性小鼠（B图）的DNA基础损伤增加的显著性处于边缘界。

图4-1是不同雄性小鼠暴露于不同浓度的苯乙烯，肝细胞的DNA损伤值。图4-2是不同雌性小鼠暴露于不同浓度的苯乙烯，肝细胞的DNA损伤值。与图3相比，图4的遗传毒性指标，除了肝细胞的DNA基础损伤和氧化损伤之外，多测量了一个肝脏组织的8-OH-dG。总的来说，肝细胞的DNA损伤结果基本和血中白细胞类似。

具体实施方式

下面对本发明的过程作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

动物实验：

实验动物种属，性别，年龄及来源：实验对象为C57BL/6J背景的小鼠，包括雄性和雌性，8周龄，体重在19-24g之间。Aldh2基因敲除型和野生型小鼠均由日本独立行政法人劳动安全卫生综合研究所友好提供。

KO型和WT型的雌雄小鼠按照6只/组划分。吸入性暴露实验在特定的不锈钢笼子中进行，苯乙烯的暴露浓度为0、20、100、200ppm。暴露过程中，苯乙烯浓度用气相色谱监测（ShimadzuGC-7A,Kyoto,Japan）。对照组暴露于经过过滤的空气。小鼠每天暴露时间为6小时，连续暴露5天/周，一共暴露6周。在暴露第5周最后的一天后，小鼠的24小时尿液被收集存放在-80^oC冰箱用于后续的分析。当最后的暴露结束后8小时，小鼠在麻醉的状态下被解剖，肝脏和血样被收集用于后续的分析。

碱性彗星实验法

5微升的新鲜全血与200微升1wt.%的低熔点胶（Sigma）在38℃均匀混合后，立即取30微升的混合液放置到已经打好孔的玻片上。玻片在-4℃冰箱平放15分钟后，立即用冷的溶解液（2.5MNaCl,100mMTrisbuVer,10wt.%DMSO,1wt.%TritonX-100；pH10）在黑暗中处理一个小时。然后玻片在裂解液（1mMEDTA,300mMNaOH;pH>13）中裂解20分钟后，再放置电泳仪(25V,300mA)中电泳20分钟后，用中性缓冲溶液（0.4MTrizmabase；pH=7.5）中和5-10分钟后，再用酒精脱水10分钟。玻片上的每个孔用50微升的SYBRGreen1染色，每个样本通过CometAssayIVcapturesystem(PerceptiveInstruments,Suffolk,UK)计数100至110个细胞。

取新鲜的相同部位的大约1cm²肝脏组织放入到冰冷的缓冲液（无Mg2+和Ca2+的Hanks’BalancedSaltSolution,10%DMSO）后，用剪刀把组织块剪碎。可以立即分析，也可以-80^oC冻存后分析。后续的彗星实验与上述的血细胞过程是一致的。

hOGG1修饰的彗星实验

对于肝细胞和血细胞的hOGG1修饰的彗星实验分析，在上述彗星实验的溶解步骤之后，玻片用hOGG1缓冲液（40mmol/lHEPES,0.1mol/LKCl,0.5mmol/lEDTAand0.2mg/mlbovineserumalbumin,pH8）洗3次，每次5分钟。然后玻片在37℃，用0.08单位的hOGG1酶在高湿度的盒子里处理10分钟。后续步骤如彗星实验中所述。氧化损伤的计算方法为，纯氧化DNA损伤（nethOGG1DNAdamage）=总的DNA损伤（hOOG1-modifiedcometassay）-基础DNA损伤（standardalkalinecometassay）。

肝脏组织的8-OH-dG检测

肝脏组织的DNA用Qiagen公司提供的组织DNA提取试剂盒提取。纯化后的DNA用20mMsodiumacetatecontaining0.1mMdeferoxamine,pH4.8，anddigestedwithnucleaseP1(37℃,60min)溶解，之后再用碱性磷酸酶在37℃处理60分钟。消化后的DNA样本转到Ultrafree-Probind过滤试管(Millipore)，在转速10000rpm下离心5分钟。滤液用液相色谱仪配有SB-C18柱子分析，流动相（10mMNaH₂PO4containing8%volume/volumemethanol）速度设置为1.0ml/min。电化学检测器（CoulochemII;ESA,USA）设置为：model5020guardcell(0.35V),和model5011analyticalcell(electrode1,0.15V;electrode2,0.3V)，UV检测器的波长设置为290nm。0.5mg/mldG和2.5ng/ml,5.0ng/ml,10.0ng/ml8-OH-dG被用来做标样。8-OH-dG数量用10⁶dG值来标准化。

尿液8-OH-dG分析

尿液水浴解冻后，取100微升尿液与含有8-OH-G的溶液混合。混合液在4℃下放置2小时，然后在13000rpm离心5分钟，取20微升的上清液注入HPLC。首先，溶液中8-OH-dG部分通过离子交换柱(MCIGELCA08F,7μm,1.5×150mm)分离，收集时间基于8-OH-G的出峰时间。接着，收集到的含有8-OH-dG的溶液进一步用反相柱(Shiseido,CapcellPakC18,5μm,4.6×250mm)分离后，8-OH-dG的量用电化学检测器（CoulochemII;ESA,USA）连接guardcell(5020)和analyticalcell(5011)检测，其参数设置为400mV（guardcell），190mV和350mV（analyticalcell）。尿中8-OH-dG浓度用肌酐来修正，单位为mg/g。

尿中MA和PGA的检测

100微升的尿液用1毫升的纯水稀释，经离心，再用syringe-drivenfilterunit(Millipore,Billerica,MA)过滤。然后取20微升注入HPLC系统，配备的柱子（ODS,150mm，4.6mm，and5μm）

是GLSciences公司生产，流动相（25mMKH₂PO₄,7.3mMPO₄buffer,pH=2.9）的速度设置为1ml/min。UV检测器的波长设置为202nm。MA和PGA最终浓度用肌酐修正，单位为mg/g。

统计学方法

实验数据用SPSS软件包17.0版本(SPSS,Chicago,USA)进行统计分析。Student'sttest用于WT和KO小鼠之间的尿中代谢产物MA+PGA浓度的比较；方差分析用于检验苯乙烯暴露对遗传毒性的影响；苯乙烯的不同暴露浓度组与对照组之间的遗传毒性比较用Dunnett’sposthoctest来分析。P<0.05被认为具有统计学意义。

上述的结果表明了KO型和WT型小鼠在暴露于苯乙烯，无论尿中苯乙烯的最终代谢产物MA+PGA，还是白细胞，肝细胞的遗传损伤都存在的明显差异。由于ALDH2是一个II相解毒酶，参与了苯乙烯的代谢。因此，ALDH2的缺乏，可以导致ALHD2代谢对象及其上游的苯乙烯中间代谢产物，如，苯乙烯乙醇醛，苯乙烯7,8-环氧化物的堆积。这些化学物质都具有较强的生物活性，有的已经被证明比苯乙烯母体的毒性更强烈，所以通过ALDH2加强苯乙烯在人体内的代谢，可以减少人体DNA受苯乙烯及其中间代谢产物的攻击，最终实现ALDH2的保护作用。这种保护机理可以使制备预防苯乙烯致遗传毒性的保健品或者药物成为可能。值得一提的是，在东亚人群当中，大约有30-40%人的ALDH2酶活性低下或者失活，因此，本项发明对包括我国在内的东亚人群更具有实际上的意义。

上述为本发明的较佳实施例，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。