泛素特异性蛋白酶4（USP4）在治疗心肌肥厚中的功能及应用

摘要

本发明公开了一种泛素特异性蛋白酶4（USP4）在治疗心肌肥厚中的功能及应用，属于基因的功能与应用领域。本发明确定了USP4的表达与心肌肥厚之间的相互关系，研究结果表明在发生心肌肥厚的模型中，USP4的表达和正常组相比显著降低；抑制USP4表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进USP4过表达则显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此，USP4可作为靶基因，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。

说明书

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种泛素特异性蛋白酶4（ubiquitin specific peptidase 4，USP4）在治疗心肌肥厚中的功能及应用。

背景技术

心力衰竭仍然是全球主要死亡原因，5年和10年生存率仅为50%和10% (1-3)。心力衰竭的预防和治疗是亟待解决的重大问题。在心脏由代偿性功能向心力衰竭发展过程中，病理性心肌肥厚是关键的病理生理事件(4)。病理性心肌肥厚的发生发展涉及一系列胞外分子、细胞膜受体、细胞内信号通路、基因表达、细胞形态、大体形态及心功能的改变(5)。在介导病理性心肌肥厚发展中，最为经典的通路包括calcineurin-NFAT、MAPK、PI3K-AKT、NF-κB等(5)，这些通路的持续激活导致下游靶基因异常表达，促使心肌肥厚的进展和恶化。其实，在心肌细胞中存在不同的调节蛋白，一部分激活上述通路促进心肌肥厚，如TAK1、FGF23、IRF4等(6)；一部分抑制上述通路活性减缓心肌肥厚的发展，如A20、IRF3等(7)。这两类蛋白的功能失衡将影响心肌肥厚的发生发展。其中，TAK1属于MAPKKK家族成员，可以激活多条介导心肌肥厚的信号通路，包括p38、JNK、NF-κB等，在心肌肥厚病理过程中发挥关键作用(8，9)。TAK1活性主要受翻译后修饰调节，其中泛素化修饰对TAK1的活性调控最为关键(9)。K63多聚泛素化修饰激活TAK1，反之，去K63多聚泛素化抑制TAK1以及下游通路的活性，这一动态过程的平衡主要由泛素化酶和去泛素化酶共同调控(9)。

USP家族蛋白是一类去泛素化酶，最早发现于1991年(10)。整个家族共有50个成员，在心脏、肝脏、胰腺、肾脏、脑及骨骼肌等器官中均有表达，在细胞内分布于胞浆和胞核(11,12)。USP蛋白的氨基端含有ZF结构域、DUSP结构域，ZF结构域负责与泛素蛋白结合，羧基端含有催化功能的结构域，催化结构域有保守的半胱氨酸序列，其突变导致去泛素化酶活性的缺失(13)。目前发现，USP家族蛋白主要参与调控精子生成、共济失调、炎症免疫调节以及肿瘤发生(14-18)。USP4属于USP家族的一名成员蛋白，最早于小鼠cDNA基因文库中克隆获得，USP4、USP11、USP15属于USP家族的一个亚家族，这三者的基因序列有高度相似度(25)，与USP家族的其他成员相比，这三者的氨基端有特殊的DUSP和UBL结构域(26)。USP4在脑、肾脏、心脏、肝脏、肺脏、脾脏及胃均有表达(19)。在不同细胞中，USP4蛋白的胞内定位不一致，在胞浆和胞核中均可存在，这与USP4存在核定位序列和出核序列有关，能够在特定条件下穿梭于胞浆和胞核之间(21)。目前的研究表明，USP4主要发挥抑制炎症反应、抗病毒、调节细胞周期以及促进肿瘤发生等作用，在心脏中的作用尚未见报道，USP4上述功能的实现主要通过去泛素化酶活性来调节相关信号通路的活性实现(17,22,23)。在HEK-293T 细胞中，USP4通过去泛素化酶活性抑制IKK复合物上游的RIP蛋白活性，从而抑制NF-κB通路的活性，起到抗炎作用(22)。另外，USP4通过去泛素化酶活性抑制RIG1蛋白的降解，促进干扰素的合成，在抗病毒中发挥重要作用(23)。在细胞增殖过程中，剪接体对前体RNA的正确剪接是细胞得以正常分裂的前提。USP4可以调节剪接体组成亚基的泛素化水平，影响剪接体的正常功能，起到调节细胞周期的作用(24)。

参考文献：

1. MacIntyre K, Capewell S, Stewart S, Chalmers JW, Boyd J, Finlayson A, Redpath A, Pell JP, McMurray JJ. Evidence of improving prognosis in heart failure: trends in case fatality in 66 547 patients hospitalized between 1986 and 1995. Circulation. 2000;102:1126–1131.

2. Mosterd A, Cost B, Hoes AW, de Bruijne MC, Deckers JW, Hofman A, Grobbee DE. The prognosis of heart failure in the general population: The Rotterdam Study. Eur Heart J. 2001;22:1318–1327.

3. Cowie MR, Wood DA, Coats AJ, Thompson SG, Suresh V, Poole-Wilson PA, Sutton GC. Survival of patients with a new diagnosis of heart failure: a population based study. Heart. 2000;83:505–510. 28

4. Stefan Hein, Eyal Arnon, Sawa Kostin, Markus Schönburg, Albrecht Elsässer, Victoria Polyakova, Erwin P. Bauer, Wolf-Peter Klövekorn, Jutta Schaper. Progression From Compensated Hypertrophy to Failure in the Pressure-Overloaded Human Heart Structural Deterioration and Compensatory Mechanisms. Circulation. 2003;107:984-991

5. Heineke, J. and J. D. Molkentin (2006). Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol 7(8): 589-600.

6. Christian Faul, Ansel P. Amaral, Behzad Oskouei, Ming-Chang Hu, Alexis Sloan. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 2011;121(11):4393–4408.

7. Hardt SE1, Sadoshima J. Negative regulators of cardiac hypertrophy. Cardiovasc Res. 2004; 63(3):500-9.

8. Zhang, D., et al. TAK1 is activated in the myocardium after pressure overload and is sufficient to provoke heart failure in transgenic mice. Nat Med. 2000;6(5):556-563.

9. Ajibade, A. A., et al. "Cell type-specific function of TAK1 in innate immune signaling." Trends Immunol. 2013.34(7): 307-316.

10. Tobias JW, Varshavsky A. Cloning and functional analysis of the ubiquitin-specific protease gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 1991; 266(18): 12021-8.

11. Shin JM, Yoo KJ, Kim MS, Kim D, Baek KH. Hyaluronan- and RNA-binding deubiquitinating enzymes of USP17 family members associated with cell viability. BMC Genomics. 2006;7:292.

12. Miles RR, Sluka JP, Halladay DL, Santerre RF, Hale LV, Bloem L, Patanjali SR, Galvin RJ, Ma L, Hock JM, Onyia JE. Parathyroid hormone (hPTH 1-38) stimulates the expression of UBP41, an ubiquitin-specific protease, in bone. J Cell Biochem. 2002;85(2):229-42.

13. Song, E. J., et al. The Prp19 complex and the Usp4Sart3 deubiquitinating enzyme control reversible ubiquitination at the spliceosome. Genes Dev. 2010. 24(13): 1434-1447.

14. Sun, L., and Chen, Z.J. (2004). The novel functions of ubiquitination in signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 119–126.

15. Borodovsky, A., Kessler, B.M., Casagrande, R., Overkleeft, H.S., Wilkinson, K.D., and Ploegh, H.L. (2001). A novel active site-directed probe specific for deubiquitylating enzymes reveals proteasome association of USP14. EMBO J. 20, 5187–5196.

16. Wilson, S.M., Bhattacharyya, B., Rachel, R.A., Coppola, V., Tessarollo, L., Householder, D.B., Fletcher, C.F., Miller, R.J., Copeland, N.G., and Jenkins, N.A. (2002). Synaptic defects in ataxia mice result from a mutation in Usp14, encoding a ubiquitin-specific protease. Nat. Genet. 32, 420–425.

17. Zhang, L., et al. (2012). USP4 is regulated by AKT phosphorylation and directly deubiquitylates TGF-beta type I receptor. Nat Cell Biol 14(7): 717-726.

18. Zhou, F., et al. (2012). Ubiquitin-specific protease 4 mitigates Toll-like/interleukin-1 receptor signaling and regulates innate immune activation. J Biol Chem 287(14): 11002-11010.

19. Gupta, K., et al. (1993). Unp, a mouse gene related to the tre oncogene. Oncogene 8(8): 2307-2310.

20. Di Donato F, Chan EK, Askanase AD, Miranda-Carus M, Buyon JP. Interaction between 52 kDa SSA/Ro and deubiquitinating enzyme UnpEL: a clue to function. Int J Biochem Cell Biol. 2001;33(9):924-34.

21. Soboleva, T. A., et al. (2005). Nuclear-cytoplasmic shuttling of the oncogenic mouse UNP/USP4 deubiquitylating enzyme. J Biol Chem 280(1): 745-752.

22. Fan, Y. H., et al. (2011). USP4 targets TAK1 to downregulate TNFalpha-induced NF-kappaB activation. Cell Death Differ 18(10): 1547-1560.

23. Wang, L., et al. (2013). USP4 positively regulates RIG-I-mediated antiviral response through deubiquitination and stabilization of RIG-I. J Virol 87(8): 4507-4515.

24. Song, E. J., et al. (2010). "The Prp19 complex and the Usp4Sart3 deubiquitinating enzyme control reversible ubiquitination at the spliceosome." Genes Dev 24(13): 1434-1447。

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定USP4的表达和心肌肥厚的相互关系，提供一种USP4在制备保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物中的新应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明通过试验确定了USP4表达与心肌肥厚之间的关系：

1、发生心肌肥厚时心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的表达明显上调，USP4的表达明显下调

本发明分别选用正常人和扩张型心肌病患者心脏，正常假手术（Sham）小鼠和通过主动脉弓缩窄手术（AB）造成心肌肥厚的小鼠心脏，分别检测了ANP、Myh7、USP4的蛋白表达情况。结果表明，扩张型心肌病患者和发生心肌肥厚的小鼠心脏中的心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的表达明显上调，USP4的表达明显下调（图1、2）。

2、USP4干扰（Adsh USP4）及过表达（Ad USP4）腺病毒对经Ang II诱导的心肌细胞肥大模型的影响

本发明发现在经血管紧张素II（Ang II）诱导的体外心肌肥厚模型中，USP4过表达心肌细胞的肥大明显被抑制，USP4不表达心肌细胞出现明显肥大（图3）。

3、USP4基因敲除显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能

本发明选用野生型小鼠、USP4基因敲除小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究USP4基因敲除对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除USP4基因所致的USP4缺陷显著恶化心肌肥厚、纤维化及心功能（图4）。

4、USP4基因过表达显著抑制了心肌肥厚及其纤维化，改善心功能

本发明选用心脏特异性USP4转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究USP4基因过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明过表达USP4基因显著抑制心肌肥厚及纤维化，保护心功能（图5）。

5、USP4基因敲除显著激活JNK1/2，P38信号通路；USP4基因过表达显著抑制JNK1/2，P38信号通路

本发明用野生型小鼠、USP4基因敲除小鼠及心脏特异性USP4转基因小鼠和非转基因小鼠分别进行假手术和主动脉弓缩窄手术，然后在术后4周对各组小鼠心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot），结果显示USP4基因敲除显著激活JNK1/2，P38信号通路；USP4基因过表达显著抑制JNK1/2，P38信号通路路（图6）。

由以上结果可知在发生心肌肥厚的模型中，USP4的表达和正常组相比显著降低；抑制USP4表达显著激活JNK1/2，P38信号通路，促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进USP4过表达则显著抑制JNK1/2，P38信号通路路，抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此USP4具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是USP4具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

一种USP4在心肌肥厚中的功能，主要体现在USP4具有保护心功能和抑制心肌肥厚的作用，特别是USP4具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚发生的作用。

针对USP4的上述功能，提供一种USP4的应用，主要体现为USP4在保护心脏、抗心脏纤维化和治疗心肌肥厚中的应用，特别是USP4在筛选或制备保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。所述的应用包括USP4直接作为保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物的有效成分，能够促进USP4表达的化学物质间接作为保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物的有效成分。

一种保护心脏功能的药物，包含USP4。

一种抗心脏纤维化的药物，包含USP4。

一种预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物，包含USP4。

本发明具有如下有益效果：

本发明发现了USP4基因的新功能，即USP4基因具有能够保护心脏功能、抗心脏纤维化和抑制心肌肥厚的作用。因此，USP4可作为靶基因，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。

附图说明

图1是正常人（Donor）和扩张性心肌病患者（DCM）心脏中ANP、Myh7、USP4的蛋白表达情况及统计柱状图，扩张性心肌病患者心脏USP4的表达下调（*：p＜0.05 vs正常人组）。

图2是野生型小鼠在假手术（Sham）和主动脉弓缩窄手术（AB）后心脏中ANP、Myh7、USP4的表达情况及统计柱状图，GAPDH作为内参；其中4W表示4周，8W表示8周；发生心肌肥厚的心脏USP4的表达下调（*：p＜0.05 vs野生型小鼠sham组）。

图3是SD乳鼠原代心肌细胞用腺病毒AdshRNA、Adsh USP4、AdGFP 和AdUSP4感染，经PBS或Ang II刺激后的免疫荧光及细胞表面面积统计柱状图，USP4的干扰腺病毒促进心肌细胞肥大，USP4的过表达腺病毒抑制心肌细胞肥大（*：p＜0.05 vs PBS组，#：p＜0.05 vs Ang II组）。

图4是WT和USP4-KO小鼠AB术4周后的结果图。A、B及C是HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图；D是WT和USP4-KO小鼠AB术4周后心室横截面以及心脏组织HE染色、WGA染色和PSR染色结果图；E是心肌细胞横截面积统计柱状图；F是左室胶原面积统计柱状图；G、H及I是WT和USP4-KO小鼠AB术4周后心功能检测结果，其中，LVEDd为左室舒张末期内径，LVESd为左室收缩末期内径，FS为短轴缩短率（*：p＜0.05 vs野生型Sham组，#：p＜0.05 vs野生型AB组）。

图5是NTG和TG小鼠AB模型4周后的结果图。A、B及C是HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图；D是NTG和TG小鼠AB术4周后心室横截面以及心脏组织HE染色、WGA染色和PSR染色结果图；E是心肌细胞横截面积统计柱状图；F是左室胶原面积统计柱状图；G、H及I是NTG和TG小鼠AB术4周后心功能检测结果，其中，LVEDd为左室舒张末期内径，LVESd为左室收缩末期内径，FS为短轴缩短率（*：p＜0.05 vs NTG Sham组，#：p＜0.05 vs NTG AB组）。

图6是野生型（WT）和USP4-KO小鼠Sham及AB术、NTG和TG小鼠Sham及AB术4周时JNK1/2，P38信号通路Western blot 检测图。结果显示，USP4敲除会增加JNK1/2和P38的磷酸化激活；其中“p-”代表磷酸化的激酶，“T-”代表总的激酶（*：p＜0.05 vs野生型Sham组，#：p＜0.05 vs野生型AB组）；然而，USP4过表达会抑制JNK1/2和P38的磷酸化激活；其中“p-”代表磷酸化的激酶，“ T-”代表总的激酶（*：p＜0.05 vs NTG Sham组， #：p＜0.05 vs NTG AB组）。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验用动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g，背景为雄性C57BL/6的野生型小鼠（WT）、全身性USP4基因敲除小鼠（USP4-KO）、心脏特异性USP4转基因小鼠（USP4-TG）及非转基因小鼠（NTG，同窝对照非转基因小鼠）为实验对象。

（1）全身性USP4基因敲除小鼠的构建：

利用CRISPR-Cas9技术构建全身性USP4基因敲除小鼠。首先，通过在线CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu）预测小鼠USP4的引导序列，设计2条单链oligo：

oligo1：TAGGTATCTTATTGACAGCCGG，

oligo2：AAACCCGGCTGTCAATAAGATA。

oligo1和oligo2退火形成双链DNA，将双链DNA连入经BsaI酶切的pUC57-sgRNA（Addgene 51132）构建sgRNA表达载体。

以上述构建的sgRNA表达载体为模板，使用如下引物通过PCR扩增含有T7启动子及引导序列的DNA片段：

Forward primer：GATCCCTAATACGACTCACTATAG，

Reverse primer：AAAAAAAGCACCGACTCGGT。

以所扩增的PCR产物为模板使用MEGAshortscript Kit（Ambion，AM1354）进行体外转录；Cas9质粒（Addgene 44758）通过T7 Ultra kit（Ambion，Am1345）进行转录。将转录得到的Cas9和引导序列RNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit（Qiaen，217084）纯化后，通过FemtoJet 5247显微注射系统注射入野生型C57BL/6小鼠的单细胞受精卵内。选取经显微注射后存活的受精卵，将其移植到健康雌鼠输卵管中，经过21天妊娠之后得到F0代小鼠。

F1代及F2代小鼠通过PCR鉴定，野生型小鼠包含一段长149bp的DNA序列，而突变小鼠（USP4基因敲除小鼠）含有126bp的DNA序列，最终蛋白产物通过western blot 进行检测鉴定。其中，PCR鉴定引物如下：

USP4-F：5’-GGAGAGCTGCAAAACATAATGC-3’，

USP4-R：5’-CAGCTGTCAAAGCCCACATA-3’。

实验所用小鼠为突变体纯合子。

（2）心脏特异性USP4转基因小鼠的构建：

以野生型C57BL/6小鼠USP4基因cDNA为模板，用如下引物PCR扩增小鼠USP4全长基因（NCBI，USP4， GENE ID：22258）：

上游引物：TCCCCCCGGGGCCACCATGGCGGAAGGCCGGG，

下游引物：GGAAGATCTTCAGTTGGTGTCCATGTTGTAAGC。

扩增的USP4全长基因及pCAG-loxP-CAT-loxP质粒（pCAG-loxP-CAT-loxP质粒由北京协和医学院基础学院杨青林老师提供，制备过程参见文献：Kim T, Zhelyabovska O, Liu J, et al. Generation of an Inducible, Cardiomyocyte-Specific Transgenic Mouse Model with PPAR b/d Overexpression[J]. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs), 57.）经XmaI（NEB，# R0180L）和BglII（NEB，# R0144L）双酶切后连接，形成pCAG-loxP-CAT-loxP-USP4-hGHpA载体（CAG(chicken beta-actin)-CAT(chloramphenicol acetyltransferase)-USP4-hGHpA），将构建的质粒通过显微注射系统注射入野生型C57BL/6小鼠的单细胞受精卵内，该受精卵移植入健康雌鼠中，发育得到F0代小鼠。将得到的F0代小鼠与α-MHC-Cre小鼠杂交，并通过他莫昔芬诱导（他莫昔芬80mg/kg/天，腹腔注射，连续刺激5天）得到心脏特异性USP4转基因老鼠（上述的转基因小鼠参照下述文献制备：Jiang DS, Bian ZY, Zhang Y, Zhang SM, Liu Y, Zhang R et al. Role of interferon regulatory factor 4 in the regulation of pathological cardiac hypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202.）。

饲养环境：所有实验小鼠均饲养在SPF级实验动物中心。SPF级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

实施例1USP4在正常人和心肌病患者心脏中的表达

选用正常人心脏（非心脏原因的死亡捐献的个体，Donor）、扩张型心肌病患者心脏（做心脏移植手术病人置换的受体，DCM），对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot），结合特异性识USP4蛋白和心肌细胞肥大标志物ANP（Millipore，AB2232）、Myh7（santa cruz，sc53090）的抗体进行检测，测定其USP4（CST，2651）的表达，GAPDH （santa cruz，sc25778）作为内参。检测结果如图1所示，扩张型心肌病患者心脏中的心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的表达明显上调，USP4的表达明显下调。

实施例2USP4在野生型小鼠假手术组和心肌肥厚模型组心脏中的表达

1. 采用主动脉弓缩窄手术（AB）建立小鼠心肌肥厚模型，模型操作流程：

1.1 术前准备

（1）麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊巴比妥钠）量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准（一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间）。

（2）术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。

（3）气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上（加热垫需提前预热），然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。

1.2 主动脉弓缩窄术

AB术心肌肥厚模型组：取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75%酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G（25.0-27.5g小鼠）或者27G（23.5-25.0g）注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。

假手术组（Sham）在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同AB术心肌肥厚模型组。

1.3 术后护理

手术中主动脉弓降支结扎后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。

2. 取材

打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的冻存管中，迅速置于液氮罐中，于-80℃冰箱保存后用于分子生物学检测。

3. USP4在Sham小鼠和心肌肥厚模型组小鼠心脏中的表达

分别选野生型小鼠Sham组和心肌肥厚模型组AB手术后4周及8周的心脏，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot），结合特异性识别USP4蛋白及心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的抗体进行检测，测定其USP4的表达，GAPDH作为内参。检测结果如图2所示，心肌细胞肥大标志物在AB术后ANP、Myh7的表达明显上调，USP4的表达在AB术后明显下调。表明发生心肌肥厚的心脏USP4的表达下调。

实施例3USP4干扰（Adsh USP4）及过表达（Ad USP4）腺病毒对Ang II刺激的原代心肌细胞肥大的影响

1. 原代新生SD大鼠心肌细胞培养

（1）新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，颈部以下75%酒精消毒，用眼科剪和显微镊取下心脏，放入盛有10mL DMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。

（2）用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成1-2mm³的碎片。转入到放有转子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟，弃去上清液。

（3）加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用20%小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4℃冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。

（4）将收集好的心肌细胞悬液，以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40μm过滤网过滤。

（5）将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu（终浓度0.1mM），混匀之后，加入到用0.1%明胶包被的器皿中。

（6）轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37℃、5% CO₂孵育48小时用PBS清洗1次，更换培养基。

2. USP4干扰（Adsh USP4）及过表达（Ad USP4）腺病毒对经Ang II诱导的心肌细胞肥大模型的影响

AdshRNA（含shRNA（沉默RNA）的腺病毒，用作对照）、Adsh USP4（含shRNA-USP4 （沉默RNA-USP4融合蛋白）的腺病毒）、AdGFP（含GFP（绿色荧光蛋白）的腺病毒，用作对照）及Ad USP4（含GFP-USP4（绿色荧光蛋白-USP4融合蛋白）的腺病毒）（这些腺病毒的构建过程参见文献：Chen K, Gao L, Liu Y, et al. Vinexin-β protects against cardiac hypertrophy by blocking the Akt-dependent signalling pathway[J]. Basic>,>

实施例4心肌肥厚模型小鼠心肌肥厚及纤维化检测和心功能检测

1. 采用主动脉弓缩窄手术（AB）建立小鼠心肌肥厚模型

选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g的野生型小鼠（WT）、USP4基因敲除小鼠（USP4-KO）、心脏特异性USP4转基因小鼠（USP4-TG）及非转基因小鼠（NTG）各分成假手术组（Sham）和AB术心肌肥厚模型组，即WT Sham组（WT-s）、WT AB组（WT-AB），USP4-KO Sham组（KO-s）、USP4-KO AB组（KO-AB），USP4-TG Sham组（TG-s）、USP4-TG AB组（TG-AB），NTG Sham组（NTG-s）、NTG AB组（NTG-AB），每组10只小鼠。造模方法同实施例2。AB术后4周分别进行心肌肥厚及纤维化的检测和心功能的检测。

2. 取材

（1）前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签（小鼠编号、组别、手术类型及取材日期）。将倒满质量分数10% KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。

（2）取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10% KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。

（3）相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW），肺重与体重的比值（LW/BW）以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL）。

3. 病理学检测

3.1 制备石蜡标本切片

主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

3.2 苏木精-伊红（HE）染色

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液（珠海贝索，BA-4021）5min→水洗1min→1%盐酸酒精（取3mL浓盐酸与297mL 70%酒精充分混合均匀）1-3s→水洗1min→Scott液（碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水）1min→水洗1min→伊红溶液（珠海贝索，BA-4024）3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-Pro Plus 6.0软件圈细胞面积。

3.3 麦胚凝聚素（WGA）染色

主要步骤：将经60℃烘烤30min的石蜡标本切片置于二甲苯 5min×3次→100%乙醇 5min×2次→95%乙醇5min→70%乙醇5min→蒸馏水漂洗5min×2次→PBS漂洗5min→PBS漂洗10min→弃去 PBS，滴加胰酶工作液（DIG-3008，福州迈新）37℃避光孵育20min→PBS漂洗5min×3次→取出切片，用滤纸擦干组织周围的液体（组织切勿干燥），用组化笔划圈平放于湿盒中→滴加 WGA-Alexa Flour 488工作液（10μg/mL）37℃避光孵育2h→弃去染液，PBS漂洗5min×3次→SlowFade Gold antifade reagent with DAPI 封片→荧光镜下观察，显微镜拍照。

3.4天狼星红（PSR）染色

主要步骤为：取石蜡标本切片55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2%磷钼酸2min→0.1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70%酒精1次→90%酒精1次→100%酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。

PSR染色图片统计（Image-Pro Plus 6.0软件）：胶原比例=胶原面积/（总面积-空白面积）×100%。

心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。

WT和USP4-KO小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果见图4。Sham（假手术）组中WT和USP4-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；WT小鼠AB术后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，USP4-KO小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较WT小鼠进一步增加（图4：A、B、C）。HE染色及WGA染色切片可观察到：Sham组心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，USP4-KO小鼠的心脏明显大于WT组小鼠；Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，USP4-KO组则较WT组细胞肥大明显，差异有统计学意义（图4：D、E）。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状；USP4-KO小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量则比WT小鼠AB术后增加更多（图4：D、F）。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，USP4-KO小鼠的心肌肥厚及纤维化程度大于WT小鼠。

图5是NTG和USP4-TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果。AB术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显小于NTG小鼠（图5：A、B、C）。HE染色及WGA 染色切片可观察到：AB组较Sham组的心脏均增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远小于NTG小鼠；TG小鼠AB术后心肌细胞横截面积大于Sham组，显著小于NTG小鼠AB组（图5：D、E）。PSR染色可见，TG小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量小于NTG小鼠AB组（图5：D、F）。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，USP4-TG小鼠的心肌肥厚及纤维化程度小于NTG小鼠。

4. 超声检测心功能

4.1 前期准备

（1）麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

（2）待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

4.2 心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂（天津成信公司）。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径（LVEDd）、左室收缩末期内径（LVESd）及短轴缩短率（FS）。

图4：G、H、I是WT和USP4-KO小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的心功能检测结果。与WT Sham组相比，WT小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥厚的指标LVEDd、LVESd均不同程度的增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，USP4-KO小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度大于WT小鼠（图4：G、H、I）。

图5：G、H、I是NTG和USP4-TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的心功能检测结果。与NTG Sham组相比，NTG小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标LVEDd、LVESd增大，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度则小于NTG组（图5：G、H、I）。

实施例6USP4基因敲除促进JNK1/2、P38信号通路的激活；USP4基因过表达抑制JNK1/2、P38信号通路的激活

用野生型小鼠、USP4基因敲除小鼠、心脏特异性USP4转基因小鼠和非转基因小鼠分别进行假手术（Sham）和主动脉弓缩窄手术（AB），造模方法同实施例2。然后在术后4周对各组小鼠心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot），检测JNK1/2、P38等信号通路蛋白的表达情况，GAPDH（Cell Signaling Technology，2118）作为内参。结果显示AB手术后JNK1/2和P38信号通路被激活，敲除USP4基因后磷酸化的蛋白p-JNK1/2（Cell Signaling Technology，4668）和p-P38（Cell Signaling Technology，4511）的蛋白表达水平要高于其对照野生型小鼠组，总的蛋白T-JNK1/2（Cell Signaling Technology，9258）和T-P38（Cell Signaling Technology，9212）在Sham及AB的各组小鼠间均无明显差异，而p-MEK1/2（Cell Signaling Technology，9154）和p-ERK（Cell Signaling Technology，4370）的蛋白和总的蛋白T-MEK1/2（Cell Signaling Technology，9122）、T-ERK（Cell Signaling Technology，4695）均无显著差异（图6A）；USP4基因过表达后（TG小鼠）p-JNK1/2和p-P38的蛋白表达水平要低于其对照NTG小鼠（图6B）。

由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，USP4基因缺陷显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，USP4基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此USP4基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是USP4基因具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

去获取专利，查看全文>