一种氨基酸修饰的聚合物纳米水凝胶药物载体的制备方法

摘要

本发明属于医药技术领域，具体为一种氨基酸修饰的聚合物纳米水凝胶及其制备方法。进而应用于抗癌药物负载与治疗。本发明方法包括在溶剂中加入单体、引发剂和交联剂，经回流沉淀聚合制备得到高均匀度的聚合物纳米水凝胶凝胶微球；室温下通过碳二亚胺偶联方法，得到修饰各种氨基酸的聚合物纳米水凝胶；该可聚合物纳米水凝胶作为药物载体，用于抗癌药物负载。本发明制备工艺清晰简洁，反应条件温和；得到的纳米水凝胶药物载体在模拟生理环境的缓冲溶液中分散性好，可通过选择带不同侧基的氨基酸，达到修饰多种官能团的目的，进而改变载体的亲/疏水性和电荷性质；修饰所用的氨基酸属于人体内固有的成分，在增强药物载体的体内循环时间、降低载体生物毒性方面有良好的前景。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种氨基酸修饰的聚合物纳米水凝胶及其制备方法。

背景技术

在各种药物载体中，聚合物纳米水凝胶是一种理想的药物载体。它具有较大的表面积、可控的几何尺寸、丰富的功能基团和良好生物相容性等显著特点，能运载小分子药物、多肽、基因等。作为一种通过物理或者化学交联的三维高亲水性的聚合物网络，水凝胶最接近于人体各种组织细胞的形态，在某种意义上，人体各种组织都是具有不同含水量的凝胶。其中，化学交联的纳米水凝胶的高度亲水性和胶体稳定性使得它是一种理想的药物传输载体。

现代的修饰技术赋予纳米载体更多样的性质，并进一步影响其在人体内的分布和作用效果。由于不同氨基酸携带侧链基团不同，修饰了氨基酸的载体可以具有不同程度的亲/疏水性、不同性质和密度的表面电荷，以及其他功能基团。由于所述氨基酸均为天然氨基酸，修饰后的载体在生物相容性方面有较好的前景。例如通过屏蔽纳米粒子的部分表面电荷、提高它们的亲水性来减少网状内皮系统的清除作用；延长体内循环时间以减少负载药物在正常器官处的非特异性聚集和毒性，增加靶向至肿瘤部位的效率，避免人体内蛋白的吸附作用，以此避免巨噬细胞的摄取。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够改变载体的亲/疏水性和电荷性质的聚合物纳米水凝胶药物载体及其制备方法。

本发明提供的聚合物纳米水凝胶，是经过氨基酸修饰的聚合物纳米水凝胶，可作为药物载体。

上述氨基酸修饰的聚合物纳米水凝胶药物载体的制备方法，具体步骤为：

第一步、用回流沉淀法制备聚合物纳米水凝胶：在乙腈中加入聚合单体、引发剂和交联剂，反应温度为80℃—100℃，回流沉淀聚合，反应时间为1.5—2h；离心除去溶剂和未反应单体，用乙腈洗涤2-3次，即得到聚甲基丙烯酸纳米凝胶微球；若需制备空心纳米水凝胶，将模板粒子同单体一同加入，聚合后溶去模板即可；

第二步：用碳二亚胺偶联法修饰氨基酸：将第一步得到的纳米凝胶微球，加入一定比例的活化试剂（如EDC），室温下先在溶剂中进行活化反应，再和氨基酸（NSH）反应，过夜，即得到氨基酸修饰的聚合物纳米水凝胶。

本发明中，修饰反应所用的各物料按重量份额计为：聚合物单体：溶剂：活化试剂：NSH=1：（25~110）：（0.2~1.6）：（0.12~2.4）；聚合物单体物质的量：氨基酸物质的量=1:（0.5~1.5）。

本发明中，所用聚合单体选自甲基丙烯酸(MAA)，丙烯酸(AA)，丙烯酰胺(AM)，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，N-2-羟丙基-甲基丙烯酰胺(HPMA)，甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)，聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA)，磷酸甲基丙烯酸乙二醇酯(EGMP)，乙烯基咪唑(VIM)，乙烯基苯硼酸(PVPBA)，乙烯基吡咯烷酮(VP)，也可以是两者不同组合共聚。

本发明中，所用的引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)，所用的交联剂为N,N’-双(丙烯酰)胱胺(BACy)，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，或二甲基丙烯酸锌(ZDMA)。

本发明中，所用氨基酸为天然氨基酸，包括：甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，蛋氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，单一或两种及两种以上不同组合。

本发明中，所述活化反应，所用溶剂为水或水溶液，或乙腈；当溶剂为水或水溶液时，活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)；当溶剂为乙腈时，活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。氨基酸参与反应时，体系溶剂为pH>7的磷酸盐缓冲溶液。

上述的氨基酸修饰的聚合物纳米水凝胶，可作为药物载体，用于装载抗癌药物阿霉素。装载阿霉素药物，其包封率和载药率可以方便地用纳米凝胶和阿霉素的不同比例加以控制，阿霉素的载药率的重量百分比最高可为44.8%。

本发明制备工艺清晰简洁，反应条件温和。得到的纳米水凝胶药物载体在模拟生理环境的缓冲溶液中分散性好，可通过选择带不同侧基的氨基酸，达到修饰多种官能团的目的，进而改变载体的亲/疏水性和电荷性质；修饰的氨基酸属于人体内固有的成分，在增强药物载体的体内循环时间、降低载体生物毒性方面有较好的前景。

本发明解决了药物传递领域所关心的生物相容性和可降解代谢问题，因此产品具有良好的针对性。

附图说明

图1：PMAA空心纳米水凝胶各步产物的透射电镜照片。其中，（a）为非交联PMAA纳米凝胶微球，（b）为非交联PMAAPMAA,（c）为PMAA空心纳米水凝胶。

图2：PMAA空心纳米水凝胶粒子与苯丙氨酸(Phe)修饰后的纳米凝胶微球的透射电镜照片，修饰不影响微球的结构和形态。其中，（a）为PMAA空心纳米水凝胶，b）为PMAA/Phe空心纳米水凝胶。

图3：修饰苯丙氨酸前后纳米水凝胶的紫外吸收曲线变化。

具体实施方式

下面将通过实例对于本发明做进一步的详细说明。

实施例1：PMAA(聚甲基丙烯酸)纳米水凝胶的制备

MAA单体500mg，BACy交联剂150mg，AIBN引发剂13mg，乙腈40mL，加热到95^oC，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水洗涤3次，冷冻干燥24h。

实施例2：PAA(聚丙烯酸)纳米水凝胶的制备

AA单体550mg，BACy交联剂100mg，AIBN引发剂13mg，乙腈40mL，加热到95℃，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用乙醇和去离子水洗涤3次，冷冻干燥24h。

实施例3：PMAA空心纳米水凝胶的制备

步骤1：非交联P(MAA-co-NIPAM)纳米水凝胶的制备

MAA单体200mg，NIPAM单体300mg，AIBN引发剂10mg，乙腈50mL，加热到95℃，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用乙腈洗涤3次，测定凝胶微球在乙腈中的固含量。

步骤2：PMAAP(MAA-co-NIPAM)纳米水凝胶的制备

取含有100mg步骤1所得凝胶微球的乙腈溶液，加入MAA单体300mg，BACy交联剂90mg，AIBN交联剂7.8mg，添加乙腈使体系达40mL，加热到95℃，回流溶剂反应2小时，离心除去溶剂和未反应单体，用乙腈洗涤3次。

步骤3：PMAA空心纳米水凝胶的制备

将步骤2所得纳米水凝胶分散在50mL乙醇中，加热到50℃，搅拌反应6小时，离心除去溶剂和低聚物链，用乙腈和去离子水洗涤3次，冷冻干燥24h。产物形态与尺寸如图2(a)所示；在磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中的流体力学粒径与Zeta电位如表1所示。

在步骤1中调整MAA与NIPAM比例和用量可调控非交联凝胶微球的尺寸，进而调控PMAA空心纳米水凝胶的尺寸。将MAA单体1000mg，AIBN引发剂20mg，乙腈50mL，回流溶剂反应，并按照以上步骤2、3进行后续反应，可得到粒径较大的PMAA空心纳米水凝胶，各步产物的形态与尺寸如图1所示。

实施例4：苯丙氨酸(Phe)修饰的PMAA纳米水凝胶的制备

PMAA纳米凝胶微球30mg分散在20mL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)48mg，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)28.8mg，室温下反应1小时，加入溶解在5mL磷酸盐缓冲溶液中的苯丙氨酸80.6mg，继续搅拌过夜，离心除去溶剂和未反应的小分子反应物及副产物，产物用磷酸盐缓冲液洗涤3次，冷冻干燥24小时。产物的形态与尺寸如图2(a)所示，在磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中的流体力学粒径与Zeta电位如表1所示；修饰前后PMAA纳米水凝胶的紫外吸收光谱如图3所示。

实施例5：丝氨酸(Ser)修饰的PMAA纳米水凝胶的制备

PMAA纳米凝胶微球30mg分散在20mL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)48mg，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)28.8mg，室温下反应1小时，加入溶解在5mL磷酸盐缓冲溶液中的苯丙氨酸51.2mg，继续搅拌过夜，离心除去溶剂和未反应的小分子反应物及副产物，产物用磷酸盐缓冲液洗涤3次，冷冻干燥24小时。产物在磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中的流体力学粒径与Zeta电位如表1所示。

表1PMAA纳米水凝胶分别修饰苯丙氨酸(Phe)和丝氨酸(Ser)前后的流体力学粒径和Zeta电位

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通过酰胺化反应修饰了两种氨基酸后，PMAA纳米水凝胶带电基团仍为羧基，故Zeta电位基本不变，但因侧基电子云排斥作用，流体力学粒径增大，苯丙氨酸侧基苯环上的π电子的作用尤为明显。测试均在磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中进行。

应用例：取实施例中制得的纳米水凝胶10mg，加入9mg的阿霉素，配成20mL的磷酸盐缓冲溶液，常温下搅拌24h，产物用离心分离，冷冻干燥，制成负载有抗癌阿霉素的纳米水凝胶药物载体，载药率的重量比为44.8%。