一种静态乳液法固定化脂肪酶生产生物柴油的方法

摘要

本发明为一种静态乳液法固定化脂肪酶生产生物柴油的方法，该方法包括以下步骤：（1）向反应器中加入聚二甲基硅氧烷、脂肪酶溶液和铂金催化剂，真空磁力搅拌0.5-2小时后得到乳液，再向乳液中加入分散剂，形成复合乳液，机械搅拌下，固化形成载酶静态乳液硅胶微球，过滤出即得到固定化脂肪酶；（2）将植物油脂与短链醇加入到反应器中，再加入植物油脂体积1-4倍的正己烷、植物油脂质量20%-30%的固定化脂肪酶，恒温20-60

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶生产生物柴油领域，特别是提供了一种静态乳液法固定化脂肪酶， 并将固定化脂肪酶应用于生产生物柴油的方法。

背景技术

生物柴油是利用植物油脂或动物油脂等可再生资源制造出来的可以替代石化柴油的清洁 安全的新型燃料，主要成分是一系列的长链脂肪酸酯类化合物的混合物。生物柴油与石化柴 油具有相近的性能，且具有可再生、易于生物降解、含硫量低燃烧污染物排放低、温室气体 排放低等特点。因此当前对于生物柴油的生产和研究受到了人们的广泛关注。

目前生物柴油的生产主要是有化学法和生物法，化学法是用动植物油脂与甲醇或乙醇等 短链醇在酸性或碱性催化剂和高温(230～250℃)下进行转酯化反应，化学法存在以下缺点： 工艺复杂，需要加入过量的醇，后续工艺必须有相应的醇回收装置，能耗高；酯化产物难于 回收，成本高；生产过程有废碱液排放，污染环境。而生物法反应条件温和，选择性高，副 产物少，具有化学法不可比拟的优势，符合环境友好的绿色化工过程的要求。目前报道的生 物法生产生物柴油一般是利用商品化的脂肪酶或对粗酶进行纯化、固定化后作为生物催化剂， 催化短链醇类和油脂原料进行转酯反应。

固定化酶生产生物柴油方面的专利有：CN104911222A一种离子液体体系下无载体固定 化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，包括以下两个步骤：(1)制备无载体固定化脂肪酶；(2) 在离子液体体系下，使用步骤(1)制得的无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油。发明制得的 无载体固定化脂肪酶活性高，无需成本高昂的载体；将离子液体介质用于固定化酶制备生物 柴油，可以显著提高酶的稳定性及其对底物的立体选择性，还可防止甲醇、甘油等造成的酶 中毒问题，确保了酶的高效催化，使生物柴油得率大大提高。CN104450668A一种用于餐厨废 油转化生物柴油的生物炭固定化酶及其制备方法，发明提供一种可用于高酸值餐厨废弃油脂 转化生物柴油的壳聚糖修饰生物炭基固定化酶的制备方法。将花生壳等生物质在限氧条件下 高温热裂解成多孔结构的生物炭，采用具有良好生物兼容性的壳聚糖进一步修饰生物炭的孔 隙结构，通过壳聚糖大分子之间互相交联产生立体网状结构的基质材料，促进脂肪酶分子在 基质载体上的固定，改善固定化酶的催化活性与稳定性。采用该方法制备的固定化脂肪酶催 化活性得到充分提高，所制备的固定化酶可用于高酸值餐厨废油转化生物柴油的催化体系。 CN104313010A磁响应性复合脂肪酶的制备方法及生物柴油合成中的应用，发明涉及一种具 有磁响应性复合脂肪酶的制备方法，并将磁响应性复合脂肪酶应用于生物柴油的制备，属于 固定化酶应用于生物柴油制备技术领域。利用磁性纳米Fe₃O₄对具有1，3位置专一性的脂肪 酶A进行修饰，采用固定化技术将具有1，3-位置专一性的脂肪酶A与无位置专一性的脂肪 酶B制备成复合酶双酶体系，利用复合脂肪酶协同催化的方法，克服了单一脂肪酶的底物专 一性，提高了酶法制备生物柴油的转酯效率，可以实现酶的回收和重复使用，减少了反应过 程中酶活力的损失。CN104651345A一种固定化脂肪酶的制备方法，发明公开了一种固定化 脂肪酶的制备方法，其特征是利用海藻酸钠包埋法对LipaseOF进行固定化。固定化脂肪酶 具有较好的热稳定性，在60℃温度下保持7h，其酶活力基本上不变，可以用于生物柴油的制 备。CN103146675A以赤石脂为载体的固定化脂肪酶的制备方法，发明公开了一种以赤石脂 为载体的固定化脂肪酶的制备方法，首先对赤石脂分别进行羟基化和硅烷化处理，然后将处 理好的赤石脂载体加入到脂肪酶溶液中，经摇床振荡吸附固定后，用海藻酸盐凝胶对吸附了 脂肪酶的赤石脂进行包埋，最后冷冻干燥得到赤石脂固定化脂肪酶。本方法采用的赤石脂具 有原料易得，价格低廉的特点，同时也具有很好的物理吸附性和表面化学活性，经过改性以 及包埋处理后，能显著提升载体的稳定性，制得的固定化酶酶活力回收率高，稳定性好，工 艺简单，操作成本低，有望推动酶法制备生物柴油的工业化进程。CN102827825A一种用于 制备生物柴油的固载脂肪酶催化剂及其用途，发明公开了一种固载在海泡石上的脂肪酶催化 剂、其制备方法及利用所述催化剂制备生物柴油的方法，属于生物柴油制备领域。发明提供 的固载脂肪酶催化剂用量少，且可重复利用次数高达10次，且制备生物柴油的反应活性高， 反应速度快，反应条件相对温和，可以在常压及相对低的温度下进行，能够降低反应能耗， 降低成本，同时，生产过程环境友好，操作过程简单，对设备腐蚀小。以上这些专利都是利 用采用吸附、交联、包埋等固定化方法，改善游离脂肪酶的活性差、易受外界环境干扰、操 作稳定性低等缺点。

脂肪酶是一种典型的界面酶，其催化活性容易在油水界面被“激活”，其立体结构中的氨 基酸盖子会打开并使疏水活性位点暴露于油相中参与催化反应，因而脂肪酶在油水界面上具 有比主体相中更强的活性和选择性，但是目前专利中采用的固定化方法都属于单相体系固定 化酶，不利于发挥脂肪酶的界面活性，所以，研究一种新型的固定化酶的方法，既可以长期 保持脂肪酶的天然催化活性，又便于连续性的大规模生产操作，对于生物柴油的工业化生产 具有一定的现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种静态乳液法固定化脂肪酶生产生物柴油的方法， 它是利用聚二甲基硅氧烷、铂金催化剂和脂肪酶液形成乳液，后向乳液中加入分散剂形成稳 定的复合乳液，后进行固化形成载酶静态乳液硅胶微球，即固定化脂肪酶。并将固定化酶用 于催化植物油脂制备生物柴油的方法，该方法制备固定化酶工艺简单，可保持脂肪酶较高的 催化活性，并用于生产生物柴油的大规模连续操作中。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：

一种静态乳液法固定化脂肪酶生产生物柴油的方法，包括以下步骤：

(1)固定化脂肪酶：向反应器中加入聚二甲基硅氧烷、脂肪酶溶液和铂金催化剂，真空 磁力搅拌0.5-2小时后得到乳液，再向乳液中加入分散剂，磁力搅拌0.5-1小时形成复合乳 液，，然后将复合乳液在20-60℃，机械搅拌下，固化1-5小时，形成载酶静态乳液硅胶微球， 过滤出即得到固定化脂肪酶；

其中，脂肪酶溶液的浓度为20-50mg/mL，溶剂为pH7.0的磷酸盐缓冲溶液；物料配比为 质量比为聚二甲基硅氧烷:脂肪酶溶液＝1～10:1，质量比为聚二甲基硅氧烷:铂金催化剂＝ 1:0.5～3，体积比为分散剂:聚二甲基硅氧烷＝50～200:1；

(2)固定化脂肪酶催化反应生产生物柴油：

将植物油脂与短链醇加入到反应器中，再加入植物油脂体积1-4倍的正己烷、植物油脂 质量20％-30％的固定化脂肪酶，恒温20-60℃下反应6-24小时后，即可得到生物柴油；

其中，摩尔比植物油脂:短链醇＝1:3～12。

所述的反应还包括如下步骤：将过滤得到的固定化酶分别用蒸馏水和正己烷洗涤，即可 循环用于后续生物柴油的生产。

所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B、柱状假丝酵母脂肪酶或洋葱伯克霍尔菌脂肪酶。

所述分散剂为聚乙烯醇或聚乙烯吡咯酮。

所述植物油脂为豆油、花生油、麻风树油、葵花籽油、黄连木油等的一种或几种的混合 物。

所述短链醇为甲醇或乙醇。

本发明的有益效果是：

1.本发明是利用静态乳液法固定化脂肪酶生产生物柴油，制备的固定化脂肪酶为载酶静 态乳液硅胶微球，属于多相体系固定化酶。固定化脂肪酶的内部是大量、独立分布的含脂肪 酶的小液滴，这种独特的内部结构既可以使脂肪酶在最适发挥活性的生理环境中实现固定化， 又有利于解决传统固定化方法无法使脂肪酶处于油水界面上的缺点，充分发挥脂肪酶的界面 活性，提高脂肪酶的催化效率。与传统的溶胶凝胶法和反胶束法相比，该固定化方法制备的 载酶静态乳液硅胶微球的优势在于：

(1)脂肪酶固定化后存在于水-油界面上，易于发挥脂肪酶的界面活性，保持较高的催 化活性；

(2)载酶静态乳液硅胶微球可以利用过滤的方法，方便的从反应体系中分离出来便于 回收再利用；

(3)具有良好的机械稳定性，在长期连续机械搅拌操作过程中保持较高的催化活性；

(4)载酶静态乳液硅胶微球具有良好的溶胀性能，提高了反应体系的传质性能。

2.本发明制备的固定化脂肪酶，浸泡在有机溶剂中载酶静态乳液硅胶微球可以溶胀2 倍，溶胀后的载酶静态乳液硅胶微球内部孔道也随之扩张，这样能够提高固定化酶参与反应 时的传质性能。

3.制备的固定化脂肪酶具有一定的弹性，在长期的连续性机械搅拌操作环境下的可以保 持良好的机械稳定性，在反应结束后通过简单的过滤操作就可以分离出反应体系并用蒸馏水 和正己烷清洗可循环应用于生产生物柴油。将固定化酶应用于生产生物柴油，生物柴油的产 率最高可达到95.22％，重复使用20次(参与连续循环操作480小时)后仍保持完整的球形 结构，生物柴油产率仍可达到75％以上。

4.本发明静态乳液法固定化脂肪酶的工艺简单，反应条件温和，无需高温高压条件，无 环境污染，催化剂重复使用率高，有利于在大规模生物柴油生产中的工业化应用。

附图说明

图1为实施例1中的固定化脂肪酶的电镜照片，其中，图1a为固定化脂肪酶整体照片； 图1b为固定化脂肪酶横截面电镜照片；

图2为实施例1中的固定化脂肪酶的激光共聚焦照片。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地阐释，但实施例涉及的具体物料仅为表达具体的 实验，并非仅限于此。

本发明所述的pH7.0的磷酸盐缓冲溶液的配置：

A液：称取71.6g磷酸氢二钠溶于1000ml蒸馏水；

B液：称取31.2g磷酸二氢钠溶于1000ml蒸馏水

取A液与B液体积比61:39,混合然后用pH计标定到pH＝7.0，即为pH7.0的磷酸盐缓冲溶液。

所述的南极假丝酵母脂肪酶B、柱状假丝酵母脂肪酶或洋葱伯克霍尔菌脂肪酶均为公知 市售产品，以下实施例涉及的脂肪酶均为sigma公司购买。

所述的铂金催化剂是铂催化剂与乙烯基有机硅聚合物的混合体，液态，市售产品。本发 明使用的具体商品型号为道康宁syl-off4000。

实例1：

固定化脂肪酶：将南极假丝酵母脂肪酶B溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液，配置成20mg/mL的 脂肪酶液，将聚二甲基硅氧烷(道康宁DC184，以下实施例同此)2g，(体积1.9mL)，脂肪酶 液0.5g，铂金催化剂4g加入到锥形瓶中，抽真空(0.09Mpa)磁力搅拌0.5小时，形成乳液； 向锥形瓶中加入分散剂PVA(聚合度1000，醇解度98％；以下实施例同此)溶液200mL，磁力 搅拌0.5小时使PVA溶液均匀吸附在油滴表面，形成复合乳液。将含有复合乳液的锥形瓶放 置于在恒温水浴器中，30℃机械搅拌，固化3小时，利用水循环式真空泵将固定化酶从体系 中抽滤分离，即得到固定化脂肪酶；

固定化脂肪酶的电镜表征：将过滤得到的固定化脂肪酶和其横截面进行电镜(JSM-6700F) 表征，由图(1a，b)可知固定化脂肪酶呈球形，固定化脂肪酶的内部有大量的、独立分散的 小液滴，固定化酶的外表面较光滑。

固定化脂肪酶的激光共聚焦表征：将固定化脂肪酶进行激光共聚焦表征，利用荧光物质 (FITC)标记南极假丝酵母脂肪酶B，图2中固定化脂肪酶的微球内的黑色阴影部分是南极 假丝酵母脂肪酶B，说明南极假丝酵母脂肪酶B被成功固定在硅胶微球的内部，且分布均匀。

制备生物柴油：将豆油0.60g(豆油体积为0.65mL，摩尔量约为0.7mmol；)，乙醇0.24g (乙醇体积为0.30mL；摩尔量为5.2mmol)；(油醇摩尔比：1:7.5)，固定化酶0.12g，正 己烷1mL，置于具塞三角瓶中混合均匀，在50℃恒温水浴摇床中，反应10小时后，气相色 谱内标法检测生物柴油产率为93.17％。

反应结束后，利用水循环式真空泵抽滤将固定化脂肪酶从反应体系中分离，然后分别用 10mL正己烷、10mL蒸馏水充分洗涤三次，即可用于后续的生物柴油生产。

实例2：

固定化脂肪酶：将洋葱伯克霍尔菌脂肪酶溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液，配置成40mg/mL的 酶液，将聚二甲基硅氧烷2g(体积1.9mL)，脂肪酶液1g，铂金催化剂1g加入到锥形瓶中， 抽真空(0.09Mpa)磁力搅拌搅拌1小时，形成乳液；向锥形瓶中加入分散剂PVP溶液300mL， 磁力搅拌0.5小时使PVP(K值30；以下实施例同此)溶液均匀吸附在油滴表面，形成复合 乳液。将含有复合乳液的锥形瓶放置于在恒温水浴器中，40℃机械搅拌，固化1小时，利用 水循环式真空泵将固定化酶从体系中抽滤分离，即得到固定化脂肪酶；

制备生物柴油：将花生油0.60g(花生油体积为0.63mL，摩尔量为0.67mM)，甲醇0.24g，(甲 醇体积为0.30mL；摩尔量为7.5mmol)(油醇摩尔比：1:11)固定化酶0.12g，正己烷1mL， 置于具塞三角瓶中混合均匀，在50℃恒温水浴摇床中，反应12小时后，气相色谱内标法检 测生物柴油产率为92.17％。

反应结束后，利用水循环式真空泵抽滤将固定化脂肪酶从反应体系中分离，然后分别用10mL 正己烷、10mL蒸馏水充分洗涤三次，即可用于后续的生物柴油生产。

实例3：

固定化脂肪酶：将柱状假丝酵母脂肪酶溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液，配置成50mg/mL的酶 液，将聚二甲基硅氧烷2g(体积1.9mL)，脂肪酶液0.2g，铂金催化剂5g加入到锥形瓶中， 抽真空(0.09Mpa)磁力搅拌0.5小时，形成乳液；向锥形瓶中加入分散剂PVA溶液300mL， 磁力搅拌1小时使PVA溶液均匀吸附在油滴表面，形成复合乳液。将含有复合乳液的锥形瓶 放置于在恒温水浴器中，60℃机械搅拌，固化1小时，利用水循环式真空泵将固定化酶从体 系中抽滤分离，即得到固定化脂肪酶；

制备生物柴油：将麻风树油0.60g(麻风树油体积为0.6mL，摩尔量为0.66mmol)，甲醇0.24g， (甲醇体积为0.30mL；摩尔量为7.5mmol)(油醇摩尔比：1:11)固定化酶0.12g，正己烷 1mL，置于具塞三角瓶中混合均匀，在50℃恒温水浴摇床中，反应10小时后，气相色谱内标 法检测生物柴油产率为90.25％。

反应结束后，利用水循环式真空泵抽滤将固定化脂肪酶从反应体系中分离，然后分别用10mL 正己烷、10mL蒸馏水充分洗涤三次，即可用于后续的生物柴油生产。

实例4：

固定化脂肪酶：将柱状假丝酵母脂肪酶溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液，配置成50mg/mL的酶 液，将聚二甲基硅氧烷2g(体积1.9mL)，脂肪酶液0.2g，铂金催化剂2g加入到锥形瓶中， 抽真空(0.09Mpa)磁力搅拌1小时，形成乳液；向锥形瓶中加入分散剂PVP溶液150mL，磁 力搅拌搅拌1小时使PVP溶液均匀吸附在油滴表面，形成复合乳液。将含有复合乳液的锥形 瓶放置于在恒温水浴器中，60℃机械搅拌，固化1小时，利用水循环式真空泵将固定化酶从 体系中抽滤分离，即得到固定化脂肪酶；

制备生物柴油：将葵花籽油0.60g，(葵花籽油体积为0.63mL，摩尔量为0.6mmol)甲醇0.2g， (甲醇体积为0.25mL；摩尔量为6.25mmol)(油醇摩尔比：1:10)固定化酶0.12g，正己 烷1mL，置于具塞三角瓶中混合均匀，在60℃恒温水浴摇床中，反应12小时后，气相色谱 内标法检测生物柴油产率为90.63％。

反应结束后，利用水循环式真空泵抽滤将固定化脂肪酶从反应体系中分离，然后分别用10mL 正己烷、10mL蒸馏水充分洗涤三次，即可用于后续的生物柴油生产。

实例5：

固定化脂肪酶：将柱状假丝酵母脂肪酶溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液，配置成50mg/mL的酶 液，将聚二甲基硅氧烷2g(体积1.9mL)，脂肪酶液0.2g，铂金催化剂2g加入到锥形瓶中， 抽真空(0.09Mpa)磁力搅拌1h小时形成乳液；向锥形瓶中加入分散剂PVA溶液150mL，磁 力搅拌1小时使PVA溶液均匀吸附在油滴表面，形成复合乳液。将含有复合乳液的锥形瓶放 置于在恒温水浴器中，60℃机械搅拌，固化1小时，利用水循环式真空泵将固定化酶从体系 中抽滤分离，即得到固定化脂肪酶；

制备生物柴油：将黄连木油0.60g(黄连木油体积为0.65mL，摩尔量约为0.69mmol)，乙醇 0.24g，(乙醇体积为0.30mL；摩尔量为5.2mmol)(油醇摩尔比：1:7.5)固定化酶0.18g， 正己烷1mL，置于具塞三角瓶中混合均匀，在60℃恒温水浴摇床中，反应8小时后，气相色 谱内标法检测生物柴油产率为91.42％。

反应结束后，利用水循环式真空泵抽滤将固定化脂肪酶从反应体系中分离，然后分别用10mL 正己烷、10mL蒸馏水充分洗涤三次，即可用于后续的生物柴油生产。

实例6：

固定化脂肪酶：将洋葱伯克霍尔菌脂肪酶溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液，配置成50mg/mL的 酶液，将聚二甲基硅氧烷2g(体积1.9mL)，脂肪酶液0.2g，铂金催化剂2g加入到锥形瓶中， 抽真空(0.09Mpa)磁力搅拌1小时，形成乳液；向锥形瓶中加入分散剂PVA溶液150mL，磁 力搅拌1小时使PVA溶液均匀吸附在油滴表面，形成复合乳液。将含有复合乳液的锥形瓶放 置于在恒温水浴器中，60℃机械搅拌，固化3小时，利用水循环式真空泵将固定化酶从体系 中抽滤分离，即得到固定化脂肪酶；

制备生物柴油：将豆油0.60g(豆油体积为0.65mL，摩尔量约为0.7mmol)，甲醇0.24g(甲 醇体积为0.30mL；摩尔量为7.5mmol)(油醇摩尔比：1:10.7)固定化酶0.18g，正己烷3mL， 置于具塞三角瓶中混合均匀，在60℃恒温水浴摇床中，反应15小时后，气相色谱内标法检 测生物柴油产率为95.22％。

反应结束后，利用水循环式真空泵抽滤将固定化脂肪酶从反应体系中分离，然后分别用10mL 正己烷、10mL蒸馏水充分洗涤三次，即可用于后续的生物柴油生产。

实例7：

固定化脂肪酶：将洋葱伯克霍尔菌脂肪酶溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液，配置成50mg/mL的 酶液，将聚二甲基硅氧烷2g(体积1.9mL)，脂肪酶液0.2g，铂金催化剂2g加入到锥形瓶中， 抽真空(0.09Mpa)磁力搅拌1小时，向锥形瓶中加入PVA溶液150mL，磁力搅拌0.5小时， 使PVA溶液均匀吸附在油滴表面，形成复合乳液。在45℃下机械搅拌固化1小时，整个反应 体系抽滤得到固定化脂肪酶；

制备生物柴油：将豆油0.60g(豆油体积为0.65mL，摩尔量约为0.7mmol)，甲醇0.24g，甲 醇体积为0.30mL；摩尔量为7.5mmol)(油醇摩尔比：1:10.7)固定化酶0.18g，正己烷3mL， 置于具塞三角瓶中混合均匀，在60℃恒温水浴摇床中，反应24小时后，气相色谱内标法检 测生物柴油产率为95.22％。

反应结束后，利用水循环式真空泵抽滤将固定化脂肪酶从反应体系中分离，然后分别用10mL 正己烷、10mL蒸馏水充分洗涤三次，即可用于后续的生物柴油生产。

实施例8：

固定化脂肪酶的重复使用：利用水循环式真空泵抽滤将固定化脂肪酶从反应体系中分离，过 滤出的固定化脂肪酶分别用10mL正己烷、10mL蒸馏水充分洗涤三次，用于下一循环生产生 物柴油的反应中，每一循环生产生物柴油的步骤均同实施例1中的“制备生物柴油”步骤， 重复循环生产20次，生物柴油产率如下表1。

表1

本发明未尽事宜为公知技术。