早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物及其应用

摘要

早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物及其应用，所述分子标志物为APN基因启动子区甲基化或TNF-α基因启动子区甲基化，其中，所述APN的序列如SEQ？ID？NO：1所示；所述TNF-α的序列如SEQ？ID？NO：2所示。本发明还包括分子标志物在制备早期诊断预测2型糖尿病试剂盒中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖尿病分子标志物及其应用，具体涉及一种早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物及其应用。

背景技术

糖尿病已成为危害人类健康的重要原因，其发病受遗传和环境因素相互作用的影响。2002年，Maier等提出糖尿病也是DNA甲基化的候选疾病之一，认为DNA甲基化在糖尿病的发病过程中扮演重要的角色。近期研究表明，当糖尿病患者肌组织暴露于炎性环境、游离脂肪酸或高血糖环境时，其PGC-Ia基因将会发生过度甲基化，研究者在糖尿病前期的患者中也发现了类似现象，提示DNA修饰的变化可能是糖尿病的早期事件之一。因此，探索DNA修饰的变化对于早期干预、控制病情具有一定的参考价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供用于早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物及其应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物，为APN基因启动子区甲基化或TNF-α基因启动子区甲基化，其中，所述APN的序列如SEQIDNO：1所示；所述TNF-α的序列如SEQIDNO：2所示。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，早期诊断预测2型糖尿病的分子标志物在制备早期诊断预测2型糖尿病试剂盒中的应用。

附图说明

图1为DHPLC对TNF-а基因甲基化检测，其中M:甲基化；U:非甲基化；F:肥胖；N:对照；T:糖尿病。

图2为TNF-а基因DNA甲基化与mRNA相对拷贝数相关性。

图3为DHPLC对APN基因甲基化检测，其中M:甲基化；U:非甲基化；F:肥胖；N:对照；T:糖尿病。

图4为APNDNA甲基化与mRNA相对拷贝数相关性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：TNF-α基因启动子区DNA甲基化抑制其mRNA表达

1、试验方法

(1)指标检测：FPG采用葡萄糖氧化酶法检测，血脂采用全自动生化分析仪检测。

(2)DHPLC(Denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)技术检测TNF-α基因启动子区DNA甲基化：取新鲜脂肪组织200mg，抽提基因组DNA，取样本基因组DNA1.8ug进行亚硫酸盐修饰。随后设计通用引物(不含CpG位点)，F:ATTTTTAAATTTATATTTAA，见SEQIDNO：3,R:ATTATTTTTATATATTTTTA，见SEQIDNO：4，以修饰过的DNA为模板进行PCR，取PCR产物运用DHPLC技术检测甲基化。

(3)RT-PCR(Realtime-PCR,RT-PCR)检测TNF-αmRNA：取RNAlater固定的脂肪组织300mg，采用TRIOL一步法提取网膜脂肪组织总RNA，取总RNA3ul逆转录合成cDNA，随后设计引物，F:5’-GTGACAAGCCTGTAGCCCAT-3’，见SEQIDNO：5，R:5’-TATCTCTCAGCTCCACGCCA-3’，见SEQIDNO：6。以cDNA为模板进行PCR，取PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，对电泳带进行光密度扫描，表达量以TNF-α与内参GAPDH比值表示。

(4)统计学方法：采用SPSS13.0进行统计学分析，样本的一般资料用表示，一般资料的组间比较用独立样本t检验；各组样本DNA甲基化阳性率的比较用x²检验；目的基因mRNA相对拷贝数以中位数及四分位间距[M(Q_L.Q_U)]表示，组间比较采用秩和检验；相关性分析采用Pearson法。

2、DNA甲基化阳性率比较

高效液相色谱技术(DHPLC)检测TNF-α基因启动子区甲基化情况，见图1。统计学分析后发现，TNF-α基因启动子区DNA甲基化阳性率在NC(70.0％)、Ob(47.9％)及T2DM组(26.9％)逐渐降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。表明TNF-α基因启动子区的特定区段DNA甲基化与新疆维吾尔族T2DM的发生发展相关。

3、DNA甲基化与mRNA相对拷贝数相关性

根据DNA甲基化情况将样本分为甲基化阳性和阴性组，比较两组mRNA相对拷贝数，结果见图2。由图2可知，NC组(中位数:0.0250)，TNF-αmRNA相对拷贝数显著低于Ob(中位数:0.1096)及T2DM组(中位数:0.0734),差异具有统计学意义(P<0.05)。TNF-α基因启动子区DNA甲基化阳性组mRNA相对拷贝数(0.0542)显著低于阴性组(0.1988)，差异具有统计学意义(P<0.01)。表明TNF-α基因启动子区的特定区段DNA甲基化与其mRNA表达水平呈正相关关系。

综上，腹部脂肪组织细胞因子TNF-α基因启动子区甲基化差异导致其mRNA表达水平差异与新疆维吾尔族T2DM的发生和发展相关。实施例2：APN基因启动子区DNA甲基化抑制其mRNA表达

1、试验方法

(1)样本收集：各组于手术当日开腹后严格无菌操作取大网膜脂肪组织，约3cm×3cm置于5mL冻存管内，标记住院号、姓名、性别，液氮冻存。避免电刀烧焦的脂肪，组织表面血液过多时使用0.9％生理盐水冲洗。

(2)基因组DNA提取：严格按照说明书进行，所有样本的A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.7～2.0之间，DNA样本置于-20℃保存备用。

(3)DNA的亚硫酸氢盐修饰：取DNA样本1.8μg，严格按照DNA甲基化修饰试剂盒(EZ-DNAMethylationMkit，购自美国ZymoResearch公司)说明书步骤操作，对样本基因组DNA进行亚硫酸盐修饰，每组挑取2个标本测序验证，-20℃保存DNA溶液。

(4)阳性对照DNA的获得：抽取健康志愿者外周血3mL，用DNA提取试剂盒(上海生工公司)提取基因组DNA，取8μLDNA，加2.5μLCpG甲基化酶(M.SssI)和S-腺苷甲硫氨酸，再加缓冲液于50μL体系，37℃孵育4h；采用EZ-DNAMethylationTMkit试剂盒(购自美国ZymoResearch公司)进行甲基化修饰，-20℃保存DNA溶液。

(5)生化指标测定：空腹血糖(Fastingplasmaglucose,FPG)采用葡萄糖氧化酶法，总胆固醇(Totalcholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(Highdensitylipoprotein,HDL-C)、低密度脂蛋白(Lowdensitylipoprotein,LDL-C)均采用全自动生化分析仪检测；糖化血红蛋白(Glycosylatedhemoglobin,HbA1c)采用化学发光法进行检测。

(6)DHPLC技术检测甲基化及结果判定：利用通用引物PCR扩增APN基因，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。目的片段长度为525bp，PCR扩增体系25μL，其中10×PCR缓冲液(Mg²⁺plus)2.5μL，dNTPMixture(各2.5mmol/L)2μL，上下游引物(10pmol/L)各1μL，热启动Taq酶(5U/L)0.5μL(TaKaRaTaql～HOtStartVersion，日本)，修饰后的DNA模板4μL，灭菌双蒸水加至总体积25μL。PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，58.0℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后再72℃继续延续10min。同时扩增甲基化酶(M.Sss1)修饰的正常人外周血DNA为甲基化阳性对照，灭菌双蒸水取代处理后的DNA模板作为阴性对照。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳验证。取PCR产物5μL，变性温度56.4℃，运用变性高效液相色谱技术(Denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)对甲基化情况进行检测。

检测过程中设甲基化阳性(Methylation,M)及阴性(Unmethylation,U)标准品，以待测样品检测峰所处的位置判断其甲基化状态。若出现既有甲基化峰又有非甲基化峰的混合状态，只要出现甲基化峰，就判定其为甲基化阳性，若没有出现甲基化峰则判定为甲基化阴性。

(7)Rela-timePCR检测APNmRNA相对拷贝数

取RNAlater固定的脂肪组织300mg，采用TRIZOL一步法(RNA提取试剂盒TRIzolreagent,Invitrogen,美国)提取网膜脂肪组织总RNA。取总RNA3μL逆转录合成cDNA(逆转录试剂盒ImProm-II^TMPromega,美国)。合成APNRela-timePCR及内参GAPDH引物序列，见表1。

表1-各种实时定量PCR引物序列表

基因名称实验名称引物名称引物序列(5’→3’)片段大小TNF-αRT-PCRTNF-α-F-GTGACAAGCCTGTAGCCCAT111bpTNF-α-R-TATCTCTCAGCTCCACGCCAAPNRT-PCRAPN-F-ATGGCCCCTGCACTACTCTA104bpAPN-R-CAGGGATGAGTTCGGCACTTGAPDHRT-PCRGAPDH-F-TGTTGCCATCAATGACCCCTT202bpGAPDH-R-CTCCACGACGTACTCAGCG

选择非特异性嵌合荧光染料SYBRGreenⅠ用7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)对APN基因mRNA表达情况进行检测，2^-ΔΔCT计算mRNA相对拷贝数。

2、DNA甲基化阳性率比较

高效液相色谱技术(DHPLC)检测APN基因启动子区甲基化情况，见图3。统计学分析后发现，APN基因启动子区DNA甲基化阳性率在正常对照(34％)、肥胖(47.9％)及T2DM组(65.4％)逐渐增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明APN基因启动子区的特定区段DNA甲基化与新疆维吾尔族T2DM的发生发展相关。

3、DNA甲基化与mRNA相对拷贝数相关性

结果见图4，Real-timePCR结果显示，正常对照组APNmRNA相对拷贝数(0.7162)显著高于肥胖(0.4244)及T2DM组(0.4093)，差异具有统计学意义(P<0.05)。非T2DM个体相关性分析提示，APNmRNA相对拷贝数与空腹血清葡萄糖(Fastingplasmaglucose,FPG)、糖化血红蛋白(Glycosylatedhemoglobin,HbA₁c)、甘油三酯(Triglyceride,TG)水平显著负相关(P<0.05)。APN基因启动子区DNA甲基化与其mRNA表达负相关，甲基化阳性组相对拷贝数(0.2700)显著低于阴性组(0.7870)，差异具有统计学意义(P<0.01)。

综上，APN基因启动子区DNA甲基化通过抑制其mRNA表达导致糖脂代谢紊乱，参与了新疆维吾尔族肥胖及T2DM的发生、发展过程。