一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法

摘要

一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，涉及生物质原料降解通过发酵工艺生产燃料乙醇领域。本发明以可发酵碳水化合物为原料，向乙醇发酵液中添加水溶性表面活性剂、固体酵母粉、发酵抑制剂、在不添加任何营养成分的条件下进行超高浓度乙醇发酵；减少发酵体系中脂肪酸、糠醛、羟甲基糠醛、乙酰丙酸等毒性物质对发酵的抑制作用。本发明的优点在于：采用水溶性非离子表面活性剂加入发酵培养基中，可有效保护了酵母细胞成活率，使其免受发酵抑制剂的影响，可有效提高发酵效率，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物质原料降解通过发酵工艺生产燃料乙醇领域，具体涉及一种表面活性剂 提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法。

背景技术

随着化石能源的日益枯竭和环境污染的日益加剧，可再生清洁能源生物乙醇的开发和利 用受到了人们的广泛关注。木质纤维素是世界上最为丰富的生物质资源，利用木质纤维素生 产燃料乙醇具有重大的经济价值和社会意义。对木质纤维素原料进行预处理是生物乙醇生产 过程中必不可少的步骤，稀酸和蒸汽爆破预处理是目前研究较多的预处理方法，在稀酸和蒸 汽爆破预处理过程中，由于酸和热的作用，原料中部分碳水化合物发生降解和分解作用，产 生甲酸、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛(HMF)、乙酰丙酸等一系列抑制剂，从而影响酵母菌的正 常生长和随后的发酵过程。

为了减少抑制剂所带来的毒害作用，必须对发酵液进行脱毒处理，目前可采用物理法(真 空浓缩气提法、膜分离法)、化学性法(是石灰中和、活性炭吸附、离子交换、溶剂萃取)等 处理策略。例如文献BioprocessBiosystEng(2013)36:659–666采用活性炭吸附法讨论了糠醛、 羟甲基糠醛(HMF)、乙酰丙酸等发酵抑制剂对酵母细胞生长速度的影响；专利CA102226204B 公开了一种木质纤维素乙醇发酵液的脱毒方法，通过在待处理糖液中添加可溶性电解质盐后 加热得到恒温原料液通过膜组件进行膜蒸馏去除糖液中对后续发酵产生抑制作用的物质。

发明内容

本发明的目的是针对现有的生物质预处理过程中产生的毒性物质对后续发酵过程的抑制 作用，提供了一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法。

本发明提出一种对发酵液进行原位抑制毒性的方法，通过在发酵液中直接添加表面活性 剂作为细胞保护剂，以降低直至消除毒性物质对细胞生长的影响，提高发酵效率。

一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，以可发酵碳水化合物为原料，向乙 醇发酵液中添加水溶性表面活性剂、固体酵母粉、发酵抑制剂、在不添加任何营养成分的条 件下进行超高浓度乙醇发酵；减少发酵体系中脂肪酸、糠醛、羟甲基糠醛、乙酰丙酸等毒性 物质对发酵的抑制作用；

具体按照以下步骤进行：

称取酿酒酵母置于容器中，在33℃条件下用超纯水复水活化15～30min后即可做酒母使用； 然后加入可发酵碳水化合物、表面活性剂、pH缓冲溶液、发酵抑制剂；封口，放入摇床中进 行震荡培养，摇床转速为160转/min；进行超高浓度乙醇发酵，发酵温度为25～39℃，发酵 时间1～130小时；

在整个反应体系中，所述酿酒酵母接种量为1～20％，所述发酵碳水化合物的浓度为 200～600g/L、表面活性剂与水的质量比为0-50％、发酵抑制剂的浓度为0～6g/L，溶液的pH 为3.3～5.5。

所述水溶性表面活性剂聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇二甲醚、聚二甲基硅氧烷、 吐温中的至少一种。

水溶性表面活性剂优选为聚乙二醇。

所述水溶性表面活性剂聚乙二醇的分子量为200-8000。

所述水溶性表面活性剂聚乙二醇的分子量优选为200-2000。

所述可发酵碳水化合物为葡萄糖，其浓度为270-500g/L。

所述可发酵碳水化合物为葡萄糖，其浓度优选为400g/L。

所述发酵抑制剂甲酸、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛(HMF)或乙酰丙酸中的一种，发酵抑制 剂浓度为0-20g/L。

所述pH缓冲溶液为：醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸-磷酸钠缓冲液或硫酸溶液。

一种表面活性剂提高酵母细胞耐毒发酵性能的方法，在发酵体系中，所述发酵条件优选 为：发酵温度为33℃，发酵时间为4-100h，酿酒酵母接种量为7％，发酵碳水化合物的浓度 为400g/L、表面活性剂与水的质量比为25％、发酵抑制剂的浓度为0～5g/L、发酵体系pH值 为4.3，搅拌速度为160rpm。

相对现有技术，本发明的优点在于：采用水溶性非离子表面活性剂加入发酵培养基中， 可有效保护了酵母细胞成活率，使其免受发酵抑制剂的影响，可有效提高发酵效率，具有良 好的应用前景。

附图说明

图1不同浓度糠醛对葡萄糖转化率的影响；

图2不同浓度糠醛对乙醇收率的影响；

图3不同浓度糠醛对乙醇浓度的影响；

图45g.L^-1糠醛在不同发酵时间对葡萄糖转化率的影响；

图55g.L^-1糠醛在不同发酵时间对乙醇收率的影响；

图65g.L^-1糠醛在不同发酵时间对乙醇浓度的影响；

图7不同浓度HMF对葡萄糖转化率的影响；

图8不同浓度HMF对乙醇收率的影响；

图9不同浓度HMF对乙醇浓度的影响；

图105g.L^-1HMF在不同发酵时间对葡萄糖转化率的影响；

图115g.L^-1HMF在不同发酵时间对乙醇收率的影响；

图125g.L^-1HMF在不同发酵时间对乙醇浓度的影响；

图13不同浓度乙酰丙酸对葡萄糖转化率的影响；

图14不同浓度乙酰丙酸对乙醇收率的影响；

图15不同浓度乙酰丙酸对乙醇浓度的影响；

图16不同浓度糠醛对葡萄糖转化率的影响；

图17不同浓度糠醛对乙醇收率的影响；

图18不同浓度糠醛对乙醇浓度的影响；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围不受实施例的限制， 下述实施例和说明书中描述的内容只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前 提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

另外，值得说明的是，以下各实施例中发酵液中各组分物的含量测定采用高效液相色谱 仪(Agilent1260)，依据葡萄糖投料量计算其转化率、乙醇收率，依据发酵液中乙醇质量、活 化水与pH液体积计算乙醇浓度：

色谱条件为：离子交换柱，柱温为65℃，视差折光检测器，检测器为50℃；流动相：5Mm H₂SO₄，流速0.6ml/min，进样量25uL。

实施例1

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、糠 醛(0-5g.L^-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件 下发酵72小时。

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、糠 醛(0-5g.L^-1)、PEG-400(2.0g)，预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震 荡，在33℃条件下发酵72小时。

葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度分别如图1、图2、图3所示。从图中数据可以看出，向 发酵体系中加入糠醛对发酵效率有较强的抑制作用，而且随着糠醛浓度的增加发酵效率逐渐 下降；而当将PEG-400加入含糠醛的发酵体系中，发酵效率有所提高。

实施例2

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、糠 醛(5g.L^-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下 发酵100小时。

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、糠 醛(5g.L^-1)、PEG-400(2.0g)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震 荡，在33℃条件下发酵100小时。

葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度分别如图4、图5、图6所示。从图中数据可以看出，向 发酵体系中加入糠醛(5g.L^-1)对发酵效率有较强的抑制作用；而当将PEG-400加入含糠醛的 发酵体系中，发酵时间超过60小时后可将发酵效率明显提高。

实施例3

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、5- 羟甲基糠醛(0-5g.L^-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在 33℃条件下发酵72小时。

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、5- 羟甲基糠醛(0-5g.L^-1)、PEG-400(2.0g)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床 中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。

葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度分别如图7、图8、图9所示。从图中数据可以看出，向 发酵体系中加入5-羟甲基糠醛对发酵效率没有明显抑制作用；而当将PEG-400加入含5-羟甲 基糠醛的发酵体系中，发酵效率有所提高。

实施例4

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、5- 羟甲基糠醛(5g.L^-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33 ℃条件下发酵0-100小时。

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、5- 羟甲基糠醛(5g.L^-1)、PEG-400(2.0g)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床 中进行震荡，在33℃条件下发酵0-100小时。

葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度分别如图10、图11、图12所示。从图中数据可以看出， 向发酵体系中加入5-羟甲基糠醛(5g.L^-1)时，发酵72小时之前有明显抑制作用，超过72小 时抑制作用完全消失；而当将PEG-400加入含5-羟甲基糠醛的发酵体系中，发酵时间超过72 小时时终点乙醇浓度有所提高。

实施例5

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、乙 酰丙酸(0-5g.L^-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃ 条件下发酵72小时。

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、乙 酰丙酸(0-5g.L^-1)、PEG-400(2.0g)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进 行震荡，在33℃条件下发酵72小时。

葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度分别如图13、图14、图15所示。从图中数据可以看出， 向发酵体系中加入乙酰丙酸对发酵效率有明显的抑制作用，当乙酰丙酸浓度超过4g.L^-1，抑 制作用明显增强；而当将PEG-400加入含乙酰丙酸的发酵体系中，发酵效率有所提高。

实施例6

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、糠 醛(0-5g.L^-1)、预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件 下发酵72小时。

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、糠 醛(0-5g.L^-1)、PEG-1000(2.0g)预先配置好的pH值为4.3硫酸溶液6mL，放入摇床中进行震 荡，在33℃条件下发酵72小时。

葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度分别如图16、图17、图18所示。从图中数据可以看出， 向发酵体系中加入糠醛对发酵效率有较强的抑制作用，而且随着糠醛浓度的增加发酵效率逐 渐下降；而当将PEG-1000加入含糠醛的发酵体系中，发酵效率有很大程度提高。

实施例7

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入1.5-3.5g葡萄糖、 糠醛(5g.L^-1)、表面活性剂PEG-400(2.0g)，预先配置好pH为4.3的硫酸溶液6mL，放入摇 床中进行震荡，在28℃条件下发酵72小时。葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表1.

实施例8

实验步骤和实施例7相同，不同点在发酵温度为36℃，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度 数据见表1.

实施例9

实验步骤和实施例7相同，不同点在发酵温度为39℃，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度 数据见表1.

实施例10

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、糠 醛(5g.L^-1)、表面活性剂PEG-400(0.5g)，预先配置好pH为4.3的硫酸溶液6mL，放入摇床 中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表1.

实施例11

实验步骤和实施例10相同，不同点在于加入表面活性剂PEG-400(1.0g)，葡萄糖转化率、 乙醇收率及浓度数据见表1.

实施例12

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入2.5g葡萄糖、糠 醛(5g.L^-1)、表面活性剂PEG-400(2.0g)，预先配置好pH为4.3的硫酸溶液6mL，放入摇床 中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表1.

实施例13

将0.25g酵母粉在33℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入1.5g葡萄糖、糠 醛(5g.L^-1)、表面活性剂PEG-400(2.0g)，预先配置好pH为4.3的硫酸溶液6mL，放入摇床 中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表1.

表1葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据

实施例14

将0.25g酵母粉在33-37℃条件下用2mL超纯水复水15-30分钟，然后加入3.5g葡萄糖、 糠醛(5g.L^-1)、表面活性剂PEG-400(2.0g)，预先配置好pH为4.1的缓冲液溶液柠檬酸-柠檬 酸钠6mL，放入摇床中进行震荡，在33℃条件下发酵72小时。葡萄糖转化率、乙醇收率及 浓度数据见表2.

实施例15

实验步骤和实施例14相同，不同点在于加入预先配置好pH为3.6的缓冲液溶液柠檬酸- 柠檬酸钠6mL，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表2。

实施例16

实验步骤和实施例14相同，不同点在于加入预先配置好pH为5.5的缓冲液溶液柠檬酸- 柠檬酸钠6mL，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表2。

实施例17

实验步骤和实施例14相同，不同点在于加入预先配置好pH为4.0的缓冲液溶液磷酸-磷 酸钠6mL，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表2。

实施例18

实验步骤和实施例14相同，不同点在于加入预先配置好pH为4.1的缓冲液溶液醋酸-醋 酸钠6mL，葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据见表2。

实施例19

实验步骤和实施例14相同，不同点在于加入表面活性剂PEG-600(2.0g)，葡萄糖转化率、 乙醇收率及浓度数据见表2。

实施例20

实验步骤和实施例14相同，不同点在于加入表面活性剂PEG-4000(2.0g)克，葡萄糖转 化率、乙醇收率及浓度数据见表2。

实施例21

实验步骤和实施例14相同，不同点在于加入表面活性剂聚乙二醇单甲醚(2.0g)，葡萄糖 转化率、乙醇收率及浓度数据见表2。

实施例22

实验步骤和实施例14相同，不同点在于加入表面活性剂聚乙二醇二甲醚(2.0g)，葡萄糖 转化率、乙醇收率及浓度数据见表2。

表2葡萄糖转化率、乙醇收率及浓度数据