一种提高转基因鸡孵化率的方法及使用的蛋壳开口器

摘要

本发明公开了一种提高转基因鸡孵化率的方法及使用的蛋壳开口器，该方法包括以下步骤：(1)孵化器的消毒及种蛋的预孵化处理；(2)种蛋的开口；(3)外源基因的注射；(4)种蛋的封口。本发明采用专用蛋壳开口器对蛋壳赤道面进行开口时，一边用蛋壳开孔器的磨轮表面轻轻研磨开口部位，一边用酒精棉球擦拭蛋壳碎末，直至蛋壳赤道面上出现开口。同时本发明采用蛋清+蛋壳膜封口处理，将开口与封口相结合，显著提高了鸡胚孵化率，采用本发明的转染方法，转基因鸡的孵化率可达到56.4％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高转基因鸡孵化率的方法，同时还涉及该方法使用的蛋壳开口器，属于生物基因工程技术领域。

背景技术

细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。鸡具有世代周期短、低成本、繁殖力高、卵中天然存在着蛋白酶抑制剂和良好的无菌环境，表达的重组蛋白易提纯、效益高等优点，因此转基因鸡的研究是目前科学研究的热点和生物制药领域的新兴产业之一。胚盘显微注射法是制备转基因鸡的常用手段，其中鸡蛋开窗法是鸡胚盘显微注射法的的关键技术之一，它在很大程度上决定了转基因鸡的孵化率。胚盘显微注射法必须在种蛋上打开一个小窗，这就无可避免的破外了鸡蛋外壳的正常结构，改变了蛋壳内外的压力平衡和鸡胚发育的内环境，从而造成鸡胚的非正常死亡。同时，开窗处理使蛋壳受损，极易造成鸡胚受到污染，大大降低了孵化率。因此，研发出一种行之有效的提高转基因鸡孵化率的方法具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高转基因鸡孵化率的方法及使用的蛋壳开口器，能够有效提高转基因鸡的孵化率。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种提高转基因鸡孵化率的方法，包括以下步骤：

(1)孵化器的消毒及种蛋的预孵化处理

对孵化器进行消毒，种蛋进行预孵化处理，放入孵化箱内开始孵化；1-18d的孵化温度为37.8℃，湿度为60％，19-21d的孵化温度为37℃，湿度为78％；

(2)种蛋的开口

开口前将蛋壳开口器和无菌操作台进行消毒，将孵化12-24h的种蛋从孵化箱内取出，在种蛋的赤道位置先用碘酊后用75％酒精擦拭消毒，用砂轮在蛋壳赤道面处研磨，一边研磨一边用酒精棉球擦拭蛋壳碎末，直至蛋壳赤道面上出现开口，观察鸡胚孵育情况；

(3)外源基因的注射

将开口后的鸡蛋，开口向上，放在操作台内静置2min，使鸡胚盘的位置漂浮在鸡蛋的开口处，将含有外源基因的转染液注射入鸡的胚盘中，用抗生素对开口处进行杀菌；

(4)种蛋的封口

种蛋的封口采用蛋清+蛋壳膜封口的方法，封口后放入孵化箱继续孵化；其中蛋清+蛋壳膜封口的方法为：将蛋壳膜在蛋清中润洗，然后在开口处覆盖第一层蛋壳膜，再在第一层蛋壳膜上交叉覆盖第二层蛋壳膜。

优选的，第一层蛋壳膜和第二层蛋壳膜呈十字形交叉覆盖。

步骤(1)中孵化器的消毒方法为：将孵化器进行清洗，关闭进出气孔和风机，按照每立方米空间高锰酸钾10g，福尔马林15mL的比例依次加入高锰酸钾和福尔马林，混合，当混合溶液冒烟时，关闭孵化器门，消毒1h，消毒温度为15-20℃，湿度≥75％；

步骤(1)中种蛋的预孵化方法为：将新洁尔灭和水按照质量比1:1000的比例配制成新洁尔灭溶液，其中水温为30℃，将种蛋浸入新洁尔灭溶液中5min，洗净，取出，用脱脂棉擦拭干净。

步骤(3)中抗生素的制备方法：将青链霉素加入生理盐水中，使其终浓度为0.1μg/μL。

所述外源基因为表达载体pEGFP-N1-p53/MAR，是将人抑癌基因p53和鸡的核基质附着区MAR基因插入表达载体中构建而成，包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

所述表达载体pEGFP-N1-p53/MAR的构建方法，包括以下步骤：

(1)抽取癌症病人的外周血液，提取外周血液总RNA，设计上下游引物Primera、Primerb，RT-PCR扩增人抑癌基因p53，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并纯化回收；

RT-PCR反应体系为：2×PCRBuffer22μL，上下游引物各1.5μL，RT/TaqMasterMix2μL，总RNA模板3μL；

RT-PCR反应条件为：①cDNA合成和预变性：40℃、30min，94℃、2min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、前5个循环65℃退火30s，后35个循环68℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min，反应结束；

(2)将质粒pMD18-T与人抑癌基因p5316℃连接过夜，得到连接产物pMD18-T-p53；将连接产物pMD18-T-p53转化感受态细胞，培养，根据上下游引物Primera、Primerb，挑取单菌落进行PCR检测，筛选出阳性菌落，提取连接产物pMD18-T-p53，再进行酶切鉴定和测序鉴定，鉴定正确的为重组质粒pMD18-T-p53；

所述连接的反应体系为：人抑癌基因p538μL、质粒pMD18-T2μL、solutionⅠ10μL；

(3)提取鸡肝脏组织中的DNA，设计上下游引物Primerc、Primerd，PCR扩增鸡MAR基因，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并纯化回收；

所述PCR的反应体系为：10×PCRBuffer3μL、dNTPMixture2μL、总DNA模板1.5μL、上下游引物各1μL、TaqDNA聚合酶0.5μL，加灭菌去离子水补充至总体积20μL；

所述PCR的反应条件为：①预变性：94℃、4min；②PCR扩增共40个循环，前5个循环：94℃预变性30s、54℃退火40s、72℃延伸90s；中间五个：94℃预变性30s、56℃退火40s、72℃延伸90s；最后30个循环：94℃预变性30s、60℃退火40s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min，反应结束；

(4)将重组质粒pMD18-T-p53和载体pEGFP-N1分别用HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶双酶切，纯化回收人抑癌基因p53和载体pEGFP-N1酶切产物，20℃连接5h，得到连接产物pEGEP-N1-p53；将连接产物pEGEP-N1-p53转化感受态细胞，培养，根据上下游引物Primera、Primerb，挑取单菌落进行PCR检测，筛选出阳性菌落，提取连接产物pEGEP-N1-p53，再进行酶切鉴定和测序鉴定，鉴定正确的为重组质粒pEGEP-N1-p53；

所述双酶切的反应体系为：重组质粒pMD18-T-p53或载体pEGFP-N120μL、BufferK5μL、灭菌去离子水51μL、HindⅢ和BamHⅠ各2μL；30℃酶切4h；

所述连接的反应体系为：人抑癌基因p535μL、载体pEGFP-N1酶切产物1μL、T4连接酶1μL、10×T4DNALigaseBuffer2.5μL，补加灭菌去离子水至总体积为20μL；

(5)将重组质粒pEGEP-N1-p53与MAR基因分别XbaI和NotI限制性内切酶双酶切，纯化回收后25℃连接3h，得到连接产物pEGEP-N1-p53/MAR；将连接产物pEGEP-N1-p53/MAR转化感受态细胞，培养，根据引物Primera、Primerb、Primerc、Primerd，挑取单菌落进行PCR检测人抑癌基因p53和MAR基因，筛选出阳性菌落，提取连接产物pEGEP-N1-p53/MAR，进行酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并测序，酶切检测及测序正确的即为表达载体pEGFP-N1-p53/MAR；

双酶切的反应体系为：重组质粒pEGEP-N1-p533μL、Buffer01μL、灭菌去离子水13μL、XbaI和NotI各1.5μL；30℃反应4h；

所述连接的体系为：MAR基因3μL、重组质粒pEGEP-N1-p532μL、T4连接酶0.5μL、10×T4DNALigaseBuffer3μL；加灭菌去离子水至总体积20μL。

所述上下游引物Primera、Primerb为：

Primera：5'-CCCAAGCTTATGGAGGAGCCGCAGTC-3'

Primerb：5'-CGCGGATCCCAGTCTGAATCAGGCCCT-3'

所述上下游引物Primerc、Primerd为：

Primerc：5'-TTTAGCGGCCGCCACTGTAGCCCTTA-3'

Primerd：5'-CATCTTCTAGAGCTGGAAATGGCAAAC-3'。

步骤(2)、(4)、(5)中的PCR检测的反应体系为：10×PCRBuffer3μL、dNTPMixture2μL、菌落菌液1.5μL、上下游引物各1μL、TaqDNA聚合酶0.5μL，加灭菌去离子水补充至总体积20μL；

步骤(2)、(4)和(5)中人抑癌基因p53的PCR检测的反应条件为：①94℃预变性5min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min；

步骤(5)中MAR基因PCR检测的反应条件为：①94℃预变性5min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、54℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min。

步骤(2)、(5)中的酶切鉴定的反应体系为：连接产物6μL、10×BufferK3μL、灭菌去离子水8μL、HindⅢ和BamHⅠ各1.5μL，30℃反应4h；

步骤(4)中的酶切鉴定的反应体系为：连接产物8μL、10×BufferK5μL、灭菌去离子水15μL、HindⅢ2μL，30℃反应4h。

步骤(5)中酶切后的重组质粒pEGEP-N1-p53与MAR基因的纯化回收方法为：

(1)取15μL重组质粒pEGFP-N1-p53的溶液，加入3μL4mol/L的NaAc和55μL无水乙醇分析纯沉淀DNA；

取MAR基因的PCR产物30μL，加入6μL4mol/L的NaAc和110μL的无水乙醇分析纯沉淀DNA；

(2)10000r/min离心5min，弃上清，在重组质粒pEGFP-N1-p53和MAR基因中分别加入100μL和150μL质量分数75％的乙醇冲洗一次；

(3)重复步骤(2)一次；

(4)10000r/min离心5min，弃上清，室温下干燥5-10min；

(5)向重组质粒pEGFP-N1-p53和MAR基因的离心管中分别加入10μL和20μL的灭菌去离子水溶解DNA，所得溶液即为重组质粒pEGFP-N1-p53和MAR基因的DNA溶液。

本发明在孵化种蛋过程中采用不同的温度，即1-18d孵化温度为37.8℃，19-21d的孵化温度为37℃，这是由于鸡胚在发育过程中对外界温度的要求不同。在孵化前期，胚胎内的物质代谢比较缓慢，鸡胚本身产热相对较少，胚胎需要的孵化温度较高；鸡胚在不断的发育，其物质代谢越来越快，鸡胚本身产生了较大的热量，这时孵化的温度要相对降低。在孵化过程中湿度也采用了两个不同的湿度，1～18d的湿度为60％，19～21d为78％，这是由于湿度的变化对后期雏鸡的出壳影响很大，湿度过低鸡胚内的水分蒸发过多，易造成鸡胚与蛋壳粘连，使雏鸡脱水死亡；但湿度过高，则影响雏鸡的卵黄吸收，造成腹大、脐部愈合不良。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种提高转基因鸡孵化率的方法中使用的蛋壳开口器，所述蛋壳开口器包括手柄，手柄的一端设置有磨轮，另一端的端面上设置有置物凹槽，置物凹槽内装有酒精棉球。

所述磨轮中心处设置有盲孔，盲孔的内壁上设置有内螺纹，手柄与磨轮相连的一端外侧设置有与盲孔内螺纹匹配的外螺纹，磨轮通过内螺纹、外螺纹与手柄旋接在一起，构成可拆卸的一体结构。

所述磨轮为圆形。

所述磨轮直径为1.25cm。

所述酒精棉球伸出置物凹槽。

所述的手柄未安装磨轮的一端套装有两端开口的中空塑料管，中空塑料管的内腔作为置物凹槽，酒精棉球置于置物凹槽内。

本发明有益效果

本发明采用专用蛋壳开口器对蛋壳赤道面进行开口时，一边用蛋壳开孔器的磨轮表面轻轻研磨开口部位，一边用酒精棉球擦拭蛋壳碎末，直至蛋壳赤道面上出现开口。与直接打孔的开口方法相比，本发明用磨轮对蛋壳开口部位进行研磨，降低了直接打孔对鸡蛋造成的机械伤害，从而降低了鸡胚的应激，提高了鸡胚的孵化率；同时，本发明的开口器开孔是慢慢将蛋壳外面的钙化壳磨掉，解决了直接打孔时蛋壳和蛋壳膜碎片极易进入鸡胚内污染鸡胚，从而导致的鸡胚的死亡或孵化后期鸡胚粘膜黏连，孵化率降低的技术问题，进一步提高了鸡胚的孵化率。

本发明采用蛋清+蛋壳膜封口方法进行种蛋封口，即将蛋壳膜在蛋清中润洗，采用双层蛋壳膜交叉的方式覆盖开口，也对提高鸡胚孵化率有重要影响。这是由于蛋壳膜具有较好的通透性，有利于胚胎发育过程中气体交换，同时，蛋清具有一定的杀菌作用，蛋清内富含的溶菌酶成分，专门作用于微生物细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。此外，本发明双层蛋壳膜交叉的方式覆盖开口的方法也保障了封口处的安全。

本发明采用专用蛋壳开口器进行种蛋的开口并进行蛋清+蛋壳膜封口处理，显著提高了鸡胚孵化率，采用本发明的转染方法，转基因鸡的孵化率可达到56.4％。

附图说明

图1为人抑癌基因p53的RT-PCR扩增产物电泳图；其中，

1为MarkerIII，2为RT-PCR扩增产物。

图2为重组质粒pMD18-T-p53的构建流程示意图。

图3为连接产物pMD18-T-p53菌液的PCR扩增产物电泳图；其中，

1为PCR扩增产物，2为阴性对照，3为MarkerIII。

图4为连接产物pMD18-T-p53双酶切产物电泳图；其中，

1为MarkerⅡ，2为连接产物pMD18-T-p53双酶切产物。

图5为连接产物pMD18-T-p53的部分测序图谱。

图6为鸡MAR基因PCR扩增产物电泳图；其中，

1为MAR基因PCR扩增产物，2为Marker。

图7为重组质粒pEGEP-N1-p53的构建流程示意图。

图8为载体pEGFP-N1的图谱。

图9为连接产物pEGEP-N1-p53菌液的PCR扩增产物电泳图；其中，

1为DLMarker1000，2为没有连接成功的菌落，3和4为连接产物pEGEP-N1-p53菌液的PCR扩增产物。

图10为连接产物pEGEP-N1-p53酶切产物电泳图；其中，

1为DLMarker5000，2为连接产物pEGEP-N1-p53的单酶切产物。

图11为连接产物pEGEP-N1-p53/MAR的MRA基因PCR扩增产物电泳图；其中，

1为MAR基因扩增产物，2为DLMarker1000。

图12为连接产物pEGEP-N1-p53/MAR酶切产物电泳图；其中，

1为连接产物pEGEP-N1-p53/MAR酶切产物，2为DLMarker2000。

图13为连接产物pEGFP-N1-p53/MAR的人抑癌基因p53部分测序图谱。

图14为连接产物pEGFP-N1-p53/MAR的MAR基因部分测序图谱。

图15为蛋壳开口器的结构示意图；其中，

1为手柄，2为磨轮，4为酒精棉球。

图16为图15-1手柄的结构示意图；其中，

1为手柄，3为置物凹槽，4为酒精棉球，7为外螺纹。

图17为图15-2磨轮的结构示意图；其中，

2为磨轮，5为盲孔，6为内螺纹。

图18为死亡鸡胚肺脏荧光蛋白检测图；其中，

a为本发明死亡鸡胚肺脏，b为阴性对照。

图19为死亡鸡胚肾脏荧光蛋白检测图；其中，

a为本发明死亡鸡胚肾脏，b为阴性对照。

图20为成活鸡外观荧光蛋白检测图；其中，

a为本发明成活鸡，b为阴性对照。

图21为成活鸡全血基因组p53的PCR扩增产物电泳图，其中，

1、7为DLMarker1000，2-6和8-12为成活鸡全血基因组PCR检测电泳图。

图22为成活鸡F1代血液的荧光蛋白检测图；其中，

a为本发明成活鸡F1代血液，b为阴性对照。

图23为成活鸡F1代血液基因组电泳图。

图24为成活鸡F1代人抑癌基因p53的PCR扩增产物电泳图；其中，

1为DLMarker2000，2成活鸡F1代人抑癌基因p53的PCR扩增产物电泳图，3为阴性对照。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

本发明所用试剂为本领域的常规试剂，培养基的配制方法如下：

1、LB液体培养基：

Tryptone(胰蛋白胨)1.0g

YeastExtract(酵母浸出物)0.5g

NaCl0.8g

按以上配方分别称量后，先加入纯水约50mL，搅拌使其充分溶解，然后用5mol/LNaOH调pH值至7.0，随后加入去离子水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌15min，4℃保存。

2、Kana⁺/LB固体培养基：

按照1中的方法配制100mLLB液体培养基，然后加入1.2g琼脂粉(Agarpowder)，121℃高压蒸汽灭菌15min。待培养基冷却至50～60℃时，加入Kanamycin贮存液，至终浓度为50μg/mL，充分混匀，避免产生气泡，铺制平板，30～35mL/90mm培养皿。

3、Kana⁺/LB液体培养基：

按照1中的方法配制100mLLB液体培养基，待培养基冷却至50～60℃时，加入Kanamycin贮存液，至终浓度为50μg/mL，充分混匀，避免产生气泡。

实施例1人抑癌基因p53的克隆

实验材料

人外周血液：在河南科技大学第一附属医院抽取早期肺癌病人的外周血液，并在新鲜外周血液中加入ACD抗凝剂液氮中低温保存。

1、人抑癌基因p53基因克隆引物设计和合成

参照GenBank人类抑癌基因p53全序列(登录号：NW_926584.1)设计上下游引物Primera、Primerb，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物Primera：5'-CCCAAGCTTATGGAGGAGCCGCAGTC-3'(SEQIDNO.2)

下游引物Primerb：5'-CGCGGATCCCAGTCTGAATCAGGCCCT-3'(SEQIDNO.3)

2、人外周血液总RNA的提取

人外周血液总RNA的提取使用上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒，具体步骤参考试剂盒说明书。

3、RT-PCR扩增

人抑癌基因p53经过RT-PCR扩增得到，具体步骤如下：

RT-PCR反应体系为：

RT-PCR反应条件为：①cDNA合成和预变性：40℃、30min，94℃、2min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、前5个循环65℃退火30s，后35个循环68℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min，反应结束。

将RT-PCR扩增产物进行质量分数1％琼脂糖凝胶电泳(结果见图1)，然后用上海生工生物工程有限公司的SanPrep柱式DNA回收试剂盒纯化回收，并置于﹣20℃保存备用。图1结果表明，RT-PCR扩增产物的片段大小约为1183bp左右，与预期目的片段大小相符。

实施例2重组质粒pMD18-T-p53的构建

重组质粒pMD18-T-p53的构建流程示意图参见图2。

1、感受态细胞的制备

(1)从-70℃冰箱取出大肠杆菌E.coliJM110菌种，接种于5mLLB液体培养基中，37℃条件下温和过夜培养；

(2)取上述过夜培养的菌体培养液1mL于1.5mL的离心管中，1500r/min4℃离心5min，弃上清(注意尽量弃尽上清)；

(3)重复步骤(2)3～4次；

(4)在每一个离心管中加入100μL冰中预冷的SolutionA，轻轻弹动离心管，使沉淀悬浮，禁止剧烈震荡；

(5)1500r/min4℃离心5min；

(6)在每一个离心管中加入100μL冰中预冷的SolutionB，轻轻弹动离心管，使沉淀悬浮，禁止剧烈震荡。

(7)感受态细胞制作完成，将其放在-70℃冰箱保存。

2、连接产物pMD18-T-p53的构建

将质粒pMD18-T与人抑癌基因p53连接，得到连接产物pMD18-T-p53；

所述连接的反应体系为：人抑癌基因p538μL

质粒pMD18-T2μL

solutionⅠ10μL

共20μL体系，将上述溶液混匀，离心后，16℃连接过夜。

3、连接产物pMD18-T-p53的转化

(1)从-70℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，将其放在冰盒中慢慢解冻；

(2)加入过夜连接好的连接产物pMD18-T-p53，轻轻混匀，冰浴上放置30min；

(3)42℃水浴中热激1min，然后快速将管转移到冰浴中5min，该过程不要晃动离心管；

(4)向管中加入500μLLB液体培养基，然后置于37℃条件下培养1h，使细菌复苏；

(5)将复苏菌液摇匀后4000r/min转离心1min，收集沉淀，弃上清，留取菌液约50μL；

(6)用枪轻轻吹打菌体至菌液浑浊；

(7)将菌液转移至Kana⁺/LB固体培养基(LB平板)上，将菌液均匀涂开；

(8)将LB平板置于37℃培养箱中，正面放置20～40min，至液体全部吸收；

(9)37℃恒温培养箱中倒置过夜培养；

(10)培养结束，LB平板于4℃保存。

4、连接产物pMD18-T-p53的PCR检测

(1)用灭过菌的白色枪头挑取LB平板上的单个菌落于含有1mLLB液体培养基的1.5mL的离心管中；

(2)将离心管放入37℃培养箱中，培养4～5h；

(3)以培养4～5h的菌液为模板做菌液PCR，检测单菌落是否为阳性菌落。

连接产物pMD18-T-p53进行PCR检测，

反应体系如下：

加灭菌去离子水补充至总体积20μL。反应条件为：①94℃预变性5min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min。

PCR结果见图3，图3结果表明，以单菌落菌液为模板进行PCR扩增p53基因，得到的PCR扩增片段大小约为1183bp，与预期的片段大小相符。

5、连接产物pMD18-T-p53的提取

(1)取PCR阳性菌落菌液，放入Kana⁺/LB液体培养基中，在37℃培养箱中过夜培养；

(2)将过夜培养的菌液转移1.5mL离心管中，8000r/min离心2min，弃上清；重复2-3次上述步骤，倒尽或着吸干培养基，收集菌体；

(3)在菌体沉淀中加入250μLBufferP1，吸打或者震荡至彻底悬浮菌体；

(4)加入250μLBufferP2，立即温和颠倒离心管5～10次，室温下静置2-4min；

(5)加入350μLBufferP3，立即温和颠倒离心管5～10次充分混匀；

(6)于离心机最大转速(≥12000r/min)离心5～10min，将上清全部小心转移至吸附柱，9000r/min离心30s；倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

(7)在吸附柱中加入500μL的去蛋白液BufferDW1，9000r/min离心30s；倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

(8)向吸附柱中加入500μLWashSolution，9000r/min离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

(9)重复上述步骤(8)一次；

(10)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000r/min离心1min；

(11)在吸附膜中加入50μLElutionbuffer室温下静置1～2min，9000r/min离心1min，所得溶液即为连接产物pMD18-T-p53的DNA。

6、连接产物pMD18-T-p53的酶切鉴定

取3-5μL提取的连接产物pMD18-T-p53，进行HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶消化鉴定。

酶切消化体系为：

总体积20μL，30℃消化4h，进行质量分数1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果(结果见图4)。图4结果表明，连接产物pMD18-T-p53酶切产物的片段大小分别约为2692bp和1183bp，与预期片段大小相符。

7、连接产物pMD18-T-p53的酶切鉴定

将菌液PCR为阳性，酶切消化鉴定正确的连接产物pMD18-T-p53送上海生工生物工程有限公司测序(结果见图5)。测序完成后运用GenBank中进行碱基序列比对及同源性分析，测序结果与Genebank上的公布的序列(登录号：NW_926584.1)进行了同源性比对，结果：序列的同源性为98％，证明成功构建了重组质粒pMD18-T-p53。

实施例3鸡MAR基因的克隆

1、鸡MAR基因的克隆引物的设计与合成

参照GenBank鸡MAR序列的全序列(登录号：M58748.1GI:211883)，设计要扩增的上下游引物，由江苏金唯智工程技术服务有限公司合成。

上游引物序列(Primerc)：5'-TTTAGCGGCCGCCACTGTAGCCCTTA-3'(SEQIDNO.4)

下游引物序列(Primerd)：5'-CATCTTCTAGAGCTGGAAATGGCAAAC-3'(SEQIDNO.5)

2、鸡肝脏组织中MAR基因的提取

鸡肝脏组织中MAR序列的提取采用上海生动物基因组DNA提取试剂盒，具体步骤如下：

(1)取50mg鸡肝脏组织放入匀浆器中，加入100μL的BufferDigestion，用力快速将其研磨碎，把研磨好的组织液转入1.5ml的离心管中，接着向匀浆器中连续两次加入200μL的BufferDigestion进行冲洗，接着将离心管放入65℃恒温水浴锅中1h直至细胞完全裂解；

(2)加入200μLBufferPA，充分颠倒混匀，至于-20℃冰箱内放置5min；

(3)室温下10000rpm离心5min，将上清液500μL转移到新的离心管中；

(4)加入等体积的氯仿混匀，12000rpm离心取上清；

(5)加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温下放置2～3min；室温下10000rpm离心5min，弃上清；

(6)加入1mL质量分数75﹪乙醇，颠倒漂洗1-3min，10000rpm离心2min，弃上清；

(7)重复步骤6；

(8)开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发；

(9)得到的DNA用100μLTEBuffer溶解，提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

3、鸡核机制结合区序列MAR基因的克隆

鸡MAR基因经过PCR扩增得到，具体步骤如下：

PCR反应体系为：

再加入灭菌去离子水至20μL。

PCR反应条件为：①预变性：94℃、4min；②PCR扩增共40个循环，前5个循环：94℃预变性30s、54℃退火40s、72℃延伸90s；中间五个：94℃预变性30s、56℃退火40s、72℃延伸90s；最后30个循环：94℃预变性30s、60℃退火40s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min，反应结束。

将PCR扩增产物进行质量分数1％琼脂糖凝胶电泳(结果见图6)，然后用上海生工生物工程有限公司的SanPrep柱式DNA回收试剂盒纯化回收，并置于﹣20℃保存备用。图6结果表明，PCR扩增产物的片段大小约为1044bp，与预期目的片段大小相符。

实施例4重组质粒pEGEP-N1-p53的构建

重组质粒pEGEP-N1-p53的构建流程示意图参见图7。

1、重组质粒pMD18-T-p53和载体pEGFP-N1的提取、酶切及纯化回收

重组质粒pMD18-T-p53和载体pEGFP-N1的提取，参照上海生工生物工程有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒。其中载体pEGFP-N1的图谱见图8。

将重组质粒pMD18-T-p53和载体pEGFP-N1同时进行双酶切，参照Takara公司内切酶的使用说明书。

酶切的消化体系为：

酶切体系总体积均为80μL，30℃酶切4h；酶切产物质量分数1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物并纯化回收。

质量分数1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在凝胶成像系统中观察电泳条带，电泳条带与目的片段的大小基本一致，对目的条带p53和载体pEGFP-N1酶切产物进行纯化回收。具体操作步骤严格参照上海生工生物工程有限公司的SanPrep柱式DNA回收试剂盒说明书操作。

2、连接产物pEGEP-N1-p53的构建

将纯化回收的人抑癌基因p53和载体pEGFP-N1酶切产物进行连接。

连接的反应体系为：

补加灭菌去离子水至总体积为20μL，将上述溶液混匀，20℃连接5h。

3、连接产物pEGEP-N1-p53的转化

连接产物pEGEP-N1-p53的转化方法参照实施例2中的连接产物pMD18-T-p53的转化方法。

4、连接产物pEGEP-N1-p53的鉴定

(1)用灭过菌的白色枪头挑取LB平板上的单个菌落于含有1mLLB液体培养基的1.5mL的离心管中；

(2)将离心管放入37℃培养箱中，培养4～5h；

(3)以培养4～5h的菌液为模板做菌液PCR，检测单菌落是否为阳性菌落(结果见图9)。

连接产物pEGEP-N1-p53进行PCR检测，

反应体系如下：

加灭菌去离子水补充至总体积20μL。反应条件为：①94℃预变性5min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min。

图9结果表明，PCR扩增产物片段大小约为1183bp，与预期目的片段大小相符。

5、连接产物pEGEP-N1-p53的提取

连接产物pEGEP-N1-p53的提取方法参照实施例2中的连接产物pMD18-T-p53的提取方法。

6、连接产物pEGEP-N1-p53的酶切鉴定

将所提取的连接产物pEGEP-N1-p53进行HindⅢ限制性内切酶消化鉴定。参照大连宝生物公司内切酶使用说明书。

酶切消化体系为：

总体积30μL，30℃消化4h，进行质量分数1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果(结果见图10)。质量分数1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在凝胶成像系统中观察电泳条带，电泳条带与目的片段的大小基本一致，则构建重组质粒pMD18-T-p53成功。

实施例5表达载体pEGFP-N1-p53/MAR的构建

1、重组质粒pEGEP-N1-p53的提取

(1)取重组质粒pEGEP-N1-p53菌液，放入Kana⁺/LB液体培养基中，在37℃培养箱中过夜培养；

(2)将过夜培养的菌液转移1.5mL离心管中，8000r/min离心2min，弃上清；重复2-3次上述步骤，倒尽或着吸干培养基，收集菌体；

(3)在菌体沉淀中加入250μLBufferP1，吸打或者震荡至彻底悬浮菌体；

(4)加入250μLBufferP2，立即温和颠倒离心管5～10次，室温下静置2-4min；

(5)加入350μLBufferP3，立即温和颠倒离心管5～10次充分混匀；

(6)于离心机最大转速(≥12000r/min)离心5～10min，将上清全部小心转移至吸附柱，9000r/min离心30s；倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

(7)在吸附柱中加入500μL的去蛋白液BufferDW1，9000r/min离心30s；倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

(8)向吸附柱中加入500μLWashSolution，9000r/min离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

(9)重复上述步骤(8)一次；

(10)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000r/min离心1min；

(11)在吸附膜中加入50μLElutionBuffer室温下静置1～2min，9000r/min离心1min，所得溶液即为重组质粒pEGEP-N1-p53的DNA。

2、重组质粒pEGEP-N1-p53的酶切

将所提取的重组质粒pEGEP-N1-p53进行XbaI和NotI限制性内切酶消化鉴定。参照大连宝生物公司内切酶使用说明书。

酶切消化体系为：

总体积20μL。30℃消化4h，进行质量分数1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。

3、重组质粒pEGEP-N1-p53与MAR基因的纯化回收

(1)取15μL重组质粒pEGFP-N1-p53的溶液，加入3μL4mol/L的NaAc和55μL无水乙醇分析纯沉淀DNA；

取MAR基因的PCR产物30μL，加入6μL4mol/L的NaAc和110μL的无水乙醇分析纯沉淀DNA；

(2)10000r/min离心5min，弃上清，在重组质粒pEGFP-N1-p53和MAR基因中分别加入100μL和150μL质量分数75％的乙醇冲洗一次；

(3)重复步骤(2)一次；

(4)10000r/min离心5min，弃上清，室温下干燥5-10min；

(5)向重组质粒pEGFP-N1-p53和MAR基因的离心管中分别加入10μL和20μL的灭菌去离子水溶解DNA，所得溶液即为重组质粒pEGFP-N1-p53和MAR基因的DNA溶液。

4、重组质粒pEGEP-N1-p53与MAR基因的连接

纯化回收的重组质粒pEGEP-N1-p53与MAR基因进行连接，得到连接产物pEGEP-N1-p53/MAR。

所述连接的体系为：

加灭菌去离子水至总体积20μL；25℃连接3h。

5、连接产物pEGEP-N1-p53/MAR的转化

连接产物pEGEP-N1-p53/MAR的转化方法参照实施例2中的连接产物pMD18-T-p53的转化方法。

6、连接产物pEGEP-N1-p53/MAR的鉴定

(1)用灭过菌的白色枪头挑取LB平板上的单个菌落于含有1mLLB液体培养基的1.5mL的离心管中；

(2)将离心管放入37℃培养箱中，培养4～5h；

(3)以培养4～5h的菌液为模板做菌液PCR，检测单菌落是否为阳性菌落。

连接产物pEGEP-N1-p53进行PCR检测，

反应体系如下：

加灭菌去离子水补充至总体积20μL。

人抑癌基因p53的PCR反应条件为：①94℃预变性5min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min。

MAR基因PCR的反应条件为：①94℃预变性5min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、54℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min，电泳检测(结果见图11)。图11结果表明扩增片段与预期目的条带大小相符。

7、连接产物pEGEP-N1-p53/MAR的提取

连接产物pEGEP-N1-p53/MAR的提取方法参照实施例2中的连接产物pMD18-T-p53的提取方法。

8、连接产物pEGEP-N1-p53/MAR的酶切鉴定

将所提取的连接产物pEGEP-N1-p53/MAR，进行HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶消化鉴定，参照大连宝生物公司内切酶使用说明书。

酶切鉴定的体系为：

总体积20μL，30℃消化4h，进行质量分数1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果(结果见图12)。

9、目的片段的测序鉴定

经过菌液PCR、提取质粒酶切消化鉴定正确的连接产物pEGFP-N1-p53/MAR送北京擎科有限公司测序。测序完成后运用GenBank中进行碱基序列比对及同源性分析(结果见图13、14)。将图13、14的测序所得序列与Genebank上的公布的序列进行了同源性比对，结果：人抑癌基因p53序列的同源性为98％，MAR序列的同源性为99％，证明表达载体pEGFP-N1-p53/MAR构建成功。

实施例6表达载体pEGFP-N1-p53/MAR在鸡胚盘内的转染及检测

1、孵化器的消毒及种蛋的预孵化处理

将孵化器进行清洗，关闭进出气孔和风机，按照每立方米空间高锰酸钾10g，福尔马林15mL的比例依次加入高锰酸钾和福尔马林，混合，当混合溶液冒烟时，关闭孵化器门，消毒1h，消毒温度为15-20℃，湿度≥75％；

将新洁尔灭和水按照质量比1:1000的比例配制成新洁尔灭溶液，其中水温为30℃，将94个外壳无破损的新鲜种蛋浸入新洁尔灭溶液中5min，洗净，取出，用脱脂棉擦拭干净，放入孵化箱内开始孵化；1-18d的孵化温度为37.8℃，湿度为60％，19-21d的孵化温度为37℃，湿度为78％。

2、种蛋的开口

开口前将蛋壳开口器和无菌操作台进行消毒，将孵化12-24h的种蛋从孵化箱内取出，在种蛋的赤道位置先用碘酊后用75％酒精擦拭消毒，用砂轮在蛋壳赤道面处研磨，一边研磨一边用酒精棉球擦拭蛋壳碎末，直至蛋壳赤道面上出现开口，观察鸡胚孵育情况。

其中，蛋壳开口器的结构，参照图15-17，包括手柄，手柄的一端设置有磨轮，所述磨轮为圆形，直径为1.25cm，磨轮中心处设置有盲孔，盲孔的内壁上设置有内螺纹，手柄与磨轮相连的一端外侧设置有与盲孔内螺纹匹配的外螺纹，磨轮通过内螺纹、外螺纹与手柄旋接在一起，构成可拆卸的一体结构；手柄另一端的端面上设置有置物凹槽，置物凹槽内装有酒精棉球，酒精棉球伸出置物凹槽。

3、转染液及抗生素的制备

转染液的制备：将100μL表达载体pEGFP-N1-p53/MAR与100μLLipofectamine^TM2000混均，室温条件下共同孵育25min，备用；

抗生素的制备：将青链霉素加入生理盐水中，使其终浓度为0.1μg/μL。

4、表达载体pEGFP-N1-p53/MAR的注射

将开口后的鸡蛋，开口处向上，放在操作台内静置2min，使鸡胚盘的位置漂浮在鸡蛋的开口部位，将转染液2μL注射入鸡的胚盘中，然后用抗生素对开口部位进行杀菌。

5、种蛋的封口

种蛋的封口采用蛋清+蛋壳膜封口的方法，即将蛋壳膜在蛋清中润洗，然后在开口处覆盖第一层蛋壳膜，再在第一层蛋壳膜上交叉覆盖第二层蛋壳膜，封口后放入孵化箱继续孵化。

6、转染效果的检测

(1)转基因鸡孵化率的统计

统计从孵化到出雏过程中鸡胚的死亡率，结果见下表。

表注射表达载体pEGFP-N1-p53/MAR后鸡胚的发育情况

结果显示，注射表达载体pEGFP-N1-p53/MAR鸡胚孵化率可达56.4％。

(2)荧光蛋白的检测

在孵化过程中，固定时间照蛋，对7d和15d以及出壳时死亡的鸡胚，取其心肝脾肺肾等组织器官，制作组织涂片，在荧光倒置显微镜下(目镜10倍、物镜10倍)检测，看其是否有绿色荧光蛋白的表达(结果见图18、19)。同时将整个3-7d的活体鸡不同的部位分别固定在荧光显微镜下进行荧光蛋白检测，看是否有绿色荧光的出现(结果见图20)。孵化到出雏共死亡50枚鸡胚，其中30枚鸡胚中检测到荧光蛋白存在，检测阳性率为60％。成活鸡共53只，30只检测到荧光蛋白存在，检测阳性率为56.6％。

(3)成活鸡的PCR检测

对转基因的成活鸡，在3～5d的时候进行鸡翅膀下静脉采血，取1.5mL的灭菌后的离心管，在无菌操作台内加入适当的抗凝剂(ACD)，每20μL加入3.5μL的ACD，将抽取的血液放入含有ACD的离心管中，用枪轻轻吹打混匀。血液基因组的提取，参照血液基因组DNA抽提试剂盒进行抽提。

以提取的基因组为模板进行全血基因组的PCR检测，反应体系如下：

加灭菌去离子水补充至总体积20μL。反应条件为：①94℃预变性5min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s；72℃充分延伸10min，电泳检测(结果见图21)。从成活鸡的血液全基因组做PCR发现，检测到有14只鸡在1183bp有特异性条带，通过NCBI上的blast分析发现，所设计的p53引物与鸡的p53条带没有特异性，说明PCR的扩增产物，即表达载体pEGFP-N1-p53/MAR导入的目的片段极可能是人的抑癌基因p53，将条带纯化回收测序分析发现PCR条带即为p53条带，证明该研究中转基因鸡的阳性整合率为26.4％。

实施例7表达载体pEGFP-N1-p53/MAR在F1代的表达

实验动物：实施例6中检测到目的基因p53的转基因成活鸡

1、种公鸡的采精

公鸡采精前，须先对公鸡进行采精训练。具体操作如下：将公鸡单笼饲养，将其泄殖腔周围的羽毛全部剪掉，以防污染精液。同一只公鸡每天训练一次。采精训练时间一般为每天下午的15～16点。

采用按摩采精法。采精员坐下后，用两腿膝盖将公鸡的两条腿交叉夹住，呈卧伏姿势。采精时，用左手轻轻地由鸡的背部向后至尾根按摩数次，右手中指和无名指夹着集精杯，集精杯的杯口朝外，以防污染集精杯，右手的拇指与其他四指放入耻骨下方的腹部，左手按摩开始时，右手也做辅助性的按摩。时刻观察泄殖腔的反应，看其有无外翻的情况。如果有泄殖腔充分外翻的表现，就用左手掌心迅速压住尾羽，拇指和食指分开放在泄殖腔上方，作好挤压的准备，此时的拇指和食指在泄殖腔两侧稍施压力，公鸡便开始射精。同时右手立即将集精杯的杯口放在泄殖腔下方，将精液收集入杯。

2、输精方法

本发明采用泄殖腔外翻输精法。授精过程由2人配合完成，具体操作为：翻肛员用左手抓住母鸡两腿，将其胸部靠于笼门处，轻轻拖至笼门口，使其头部朝下，尾部向上对着输精人员。翻肛员一只手握紧母鸡的两脚根部，使其腹部靠紧。另一只手拉下泄殖腔旁的表皮，使母鸡的阴道翻出。输精人员将吸好精液的输精管插入输卵管内，此时翻肛人员轻轻放开左右手，输精人员挤出精液，拔出输精管，到此，输精过程即完成，翻肛员将鸡轻轻放回笼。

3、输精要求

(1)输精的部位和深度一般采用输精管插入阴道口2～2.5cm的浅阴道输精方式进行。

(2)输精量与输精次数本发明采用原精液输精，每次给母鸡输入的精子量不低于胶头滴管的1cm处(约0.05ml)，一次输入精子数不低于8000万个。每隔5d采精、输精1次。

(3)输精注意事项为了避免母鸡之间的交叉污染，吸取精液时，滴管应该尽量在精液水平表面吸取，避免胶头滴管污染精液；每输完1只母鸡，应更换一个输精管。每次采集的精液，应以最快的速度输给母鸡(一般为30min),尽量减少精液在外界暴露的时间。

4、F1代种蛋的孵化

具体方法参照实施例6。

5、F1代转基因鸡的检测

(1)荧光蛋白的检测

F1代的雏鸡出壳后，于3～5d时采用翅膀静脉采血做血液抹片，在荧光倒置显微镜下(目镜10倍、物镜10倍)检测，看其是否有绿色荧光蛋白的表达(结果见图22)。出壳雏鸡共有8只，其中有4只的血液中有绿色荧光出现，荧光检测的阳性率为50％。

(2)F1代转基因鸡的PCR检测

F1代的雏鸡出壳后，在3～5d的时候进行鸡翅膀下静脉采血，取1.5mL的灭菌后的离心管，在无菌操作台内加入适当的抗凝剂(ACD)，每20μL加入3.5μL的ACD，将抽取的血液放入含有ACD的离心管中，用枪轻轻吹打混匀。血液基因组的提取，参照血液基因组DNA抽提试剂盒进行抽提，鸡血液基因组电泳结果见图23。

以提取的基因组为模板进行全血基因组的PCR检测，反应体系如下：

加灭菌去离子水补充至总体积20μL。反应条件为：①94℃预变性5min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min，电泳检测(结果见图24)。图24可见，PCR扩增片段大小约为1183bp，与预期的目的片段大小相符，经测序分析为人抑癌基因p53的条带。在孵化出雏的F1代中，共有8只鸡，其中2只鸡检测出了目的基因p53条带的存在，阳性检测率为25％。

本发明利用RT-PCR和PCR法分别从早期肺癌病人的外周血和鸡的肝脏组织中获取人抑癌基因p53和鸡的调控序列MAR，通过一系列的酶切、连接、转化等操作将p53基因和MAR基因插入表达载体，经过PCR扩增检测、酶切、测序分析，结果表明，本发明成功构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核重组表达载体pEGFP-N1-p53/MAR。

转基因鸡的研究重难点在于外源基因不能够在机体中稳定整合并高效遗传。目前报道成功的转基因鸡多以病毒为载体，排除其安全性问题，其成功率都不足以达到工业化生产的标准，外源基因的整合率较低，同时由于外源基因在导入的机体内其插入位点多是随机的，具有很大的不确定性，转入的外源基因也多以游离的形式存在于染色体外，很难稳定遗传给子代。本发明利用构建的表达载体pEGFP-N1-p53/MAR转染鸡胚盘，获得转基因鸡，PCR检测到转基因鸡F1代的阳性率为25％，这是由于本发明利用了MAR序列的生物学特性，使外源基因在转入外源基因鸡的机体中成功表达，并在转基因成功的活鸡子一代中也发现了外源基因的表达，这表明：外源基因已成功遗传给了子一代。

本发明以脂质体为介导，将表达载体pEGFP-N1-p53/MAR对鸡胚盘进行转染，统计分析发现，转基因成活鸡共有53只，其中14只检测出了目的基因p53条带的存在，阳性检测率为26.4％。同时，本发明对检测到目的基因p53条带的转基因成活鸡进行配种，对其F1代种蛋进行孵化，共有8只鸡出壳，其中2只检测出目的基因p53条带的存在，阳性检测率为25％。

本发明将表达载体pEGFP-N1-p53/MAR转染鸡胚盘，在成活的转基因鸡中检测到目的条带，证明MAR具有一定的调控作用，该方法解决了转基因的瞬时表达问题，为转基因鸡的稳定遗传开辟了一条有效的途径。

本发明根据p53的抑癌特性和MAR序列的调控机理，采用EGFP基因为报告基因，在以脂质体作为介导的前提下，开展了转基因鸡的制备研究，为医用蛋白禽类表达系统的建立和完善进行了有益的探索，进一步为转基因动物模型的建立、探索基因治疗和药用蛋白动物生物反应器的建立奠定了一定基础。