一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y及其编码基因和应用，涉及基因工程和遗传工程领域。本发明以来源于Penicillium？sp.CGMCC？1669的多聚半乳糖醛酸酶PG63作为母本，经理性设计和分子生物学技术而获得的催化效率提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体PG63H95Y。涉及到的氨基酸突变点为His95Tyr。改造后的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y催化效率较原酶提高了47倍。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y及其编码基因和应用。

背景技术

果胶是一类带负电的高分子多糖，广泛存在于高等植物，特别是水果和蔬菜的组织中，是果蔬植物细胞中胶层的主要成分。果胶由不同酯化度的D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接而成的多糖链,常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等组成的侧链,分子量介于25kD～360kD之间。果胶类物质分为4类:原果胶(protopectin)、果胶(pectin)、果胶酸(pecticacid,pectate)和果胶酯酸(pectinicacid,pectinate)。果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称，它能将高分子果胶多糖降解为小分子或单体还原糖形式，能够有效降解果胶，因此果胶酶具有重要的工业应用。按作用机制果胶酶可以分为原果胶酶、解聚酶和果胶酯酶。解聚酶又可分为果胶水解酶和果胶裂解酶。其中水解酶通过水解作用切割D-半乳糖酸的α-1,4糖苷键生成寡聚半乳糖醛酸，而裂解酶则通过反式消去作用切断α-1,4糖苷键生成β-4,5不饱和半乳糖醛酸，果胶酯酶水解果胶中的甲酯,生成果胶酸。

由于果胶酶能够有效降解果胶质，因此成为不同的工业领域中的新兴酶类。国外对果胶酶的研究始于20世纪30年代至50年代已工业化生产。而国内的研究则始于60年代，80年代末才开始工业化生产。目前果胶酶在果蔬加工、饲料、纺织和造纸工业都有广泛应用。随着我国水果种植和水果加工业的发展，食品果胶酶的开发和应用也迅速发展。相比较而言，果胶酶最重要的应用领域还是食品工业中的果蔬汁生产加工。果蔬汁的混浊主要是由果胶质引起的。通过果胶酶处理可提高果蔬汁的出汁率和澄清度，果胶酶的应用是传统果蔬汁加工行业的一次新技术革命，现已成为果蔬汁生产中最重要的酶制剂之一，被大量应用于果蔬汁的提取和澄清、改善果蔬汁的可过滤性以及植物组织的浸渍和提取。目前，大部分原果汁、浓缩果汁的生产过程中，都在使用果胶酶，果胶酶已成为重要的工业酶种。因此，获取具有高催化效率的果胶酶是当前的研发趋势。

发明内容

本发明的目的是提供一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y。

本发明的再一目的是提供编码上述突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y的编码基因。

本发明的另一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y的基因工程方法。

本发明以来源于Penicilliumsp.CGMCC1669的多聚半乳糖醛酸酶PG63作为母本，经理性设计和分子生物学技术而获得的催化效率提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体PG63H95Y。涉及到的氨基酸突变点为His95Tyr。

所述突变体氨基酸序列如SEQIDNO.1所示(对多聚半乳糖醛酸酶PG63的95位氨基酸进行定点突变，His95Tyr)。

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所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

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本发明还是提供一种制备所述多聚半乳糖醛酸酶突变体的方法，其技术方案如下：

1)采用over-lapPCR的方法扩增所述突变体序列片段；

2)将上述突变体序列片段克隆到表达载体pPIC9r上，重组载体命名pPIC9r-PG63H95Y；将本发明的多聚半乳糖醛酸酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将多聚半乳糖醛酸酶基因插入到质粒pPIC9r上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-PG63H95Y。

3)将突变体重组载体转化宿主细胞，诱导表达，获得突变株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌(毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞等)、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选将重组表达质粒转化毕赤酵母细胞，得到重组菌株GS115/PG63H95Y。

本发明还提供了一种制备所述突变体的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；

3)回收并纯化所表达的突变酶。

本发明还提供了上述突变体的应用。

本发明提供一种高催化效率的、适合于在食品、饲料工业等领域中应用的多聚半乳糖醛酸酶。本发明的突变酶最适pH(pH3.5-4.0)与最适温度(40-50℃)均与原酶保持相当的活性范围，催化效率提高47倍，能很好的满足食品、饲料工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主PichiapastorisGS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH7.0

(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖

(3)MD固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin

(4)MM固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇

(5)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(V/V)，1.34％YNB，0.00004％Biotin

(6)BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇(V/V)

4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1本发明中所述突变体所涉及的具体定点突变方法如下：

对多聚半乳糖醛酸酶PG63进行突变，将突变位点设计为第95位组氨酸突变为络氨酸。通过overlapPCR的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得突变基因PG63H95Y。设计所用引物如表1所示：

表1.所述突变体PG63H95Y特异性引物

实施例2所述突变体的制备。

将表达载体pPIC9r进行双酶切(SnaBI+NotI)，同时将编码所述突变体的基因PG63H95Y双酶切(SnaBI+NotI)，切好的编码成熟所述突变体的基因片段(去除信号肽片段)与表达载体pPIC9r连接，获得含有所述突变体基因PG63H95Y的重组质粒pPIC9r-PG63H95Y并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/PG63H95Y。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mLBMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。

实施例3所述突变体和野生型的活性分析

一、DNS法：具体方法如下：在给定的pH、温度条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生成1μmold-(+)-半乳糖醛酸所需的酶量。

二、所述突变体和野生型的性质测定

1、所述突变体和野生型的最适pH测定方法如下:

将实施例2纯化的突变酶和野生型在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物多聚半乳糖醛酸用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50℃下进行多聚半乳糖醛酸酶活力测定。结果表明，所述突变体和野生型的最适反应pH相近，为3.5-4.0，且在pH2.5-7.0范围内有相同的作用趋势。

2、所述突变体和野生型的最适温度测定方法如下:

所述突变体和野生型的最适温度的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果表明,所述突变体与野生型最适温度相近，为40-50℃，且在0-80℃下有相同的作用趋势。

3、重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和野生型的动力学参数测定方法如下:

参照李宁的方法(李宁,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定K_m及V_max的反应时间为5min。用不同浓度的多聚半乳糖醛酸(1.0，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1和0.05％)为底物，在最适条件(温度、pH)下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraFit7软件计算K_m及V_max值。

以多聚半乳糖醛酸为底物时，重组高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体和野生型在40℃、pH4.0下动力学参数为：

改造后突变体PG63H95Y的催化效率(k_cat/K_m)较野生酶提高47倍，能很好的满足食品、饲料工业等领域中应用的需求。