一株桑树拮抗性内生菌特基拉芽孢杆菌

摘要

一株桑树内生拮抗细菌(Bacillus？tequilensis)7PJ-16菌株（菌株的保藏号为CCTCC？NO：M2015319），从果桑川7637的茎中分离纯化而获得。该菌株对桑椹核地杖菌具有较强且稳定的拮抗作用。菌体生长范围为25℃到45℃，最适生长温度为25℃；该菌株最适发酵时间为72h。其无菌活性发酵滤液具有热稳定性，100℃处理30min抑菌效果无明显变化。菌体及发酵液对桑树组培苗无致死作用且有促生作用，具有潜在的商业开发应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株桑树拮抗性内生菌特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)。

背景技术

桑椹菌核病(Sclerotediseaseofmulberryfruit)俗称白果病，染病桑椹常呈灰白色，有臭味，因而失去商品与食用价值。该病来势凶发病快，严重制约果桑产业的健康发展，在江苏、浙江、上海、重庆、四川等地均有发生，发病率高达30%～90%，严重时甚至可导致上千亩桑园绝产。根据病原菌及病症的不同，桑椹菌核病分为桑椹缩小性菌核病、桑椹肥大性菌核病及桑椹小粒性菌核病。其中桑椹缩小性菌核病病原菌桑椹核地仗菌(Scleromitulashiraiana)是子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、蜡钉菌目(Helotiales)真菌。

目前桑椹菌核病主要依靠物理及化学方法进行防治。物理防治方法包括清除病果、桑园深耕以及覆盖地膜等。因人工投入大、成本高，且防效有限，物理防治方法无法在生产中有效运用。菌核病的化学防治是在桑果初花期，利用甲基托布津或多菌灵等化学农药进行喷雾预防。然而化学农药的使用不仅会带来环境污染、农药残留等负面影响，更会使桑椹的食品安全性难以保障。所以开发安全、高效、环境友好的菌核病生物防治方法对果桑产业的健康、可持续发展具有重要意义。

植物内生菌（Endophyte）普遍存在于高等植物体内，在与宿主互作过程中，部分内生菌能通过产生抗菌物质、诱导抗性及促进植物生长等机制增强宿主植物的抗病性。植物内生菌已成为筛选植物病害生防制剂的重要资源库。近年来利用桑树内生菌进行植物病害生物防治已多有报道，桑树内生细菌洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)LU10-1菌株能长期定殖于桑树体内，且可作为桑树生长促进剂和桑炭疽病菌的拮抗菌而用于生物防治；从野生型桑树内生细菌中筛选获得枯草芽孢杆菌ME0717菌株对桑炭疽病菌、桑漆斑病菌具有抑制作用；从健康桑树中分离获得成团泛菌Swg2对丁香假单胞菌桑致病变种具显著抑制作用。基于以上研究，筛选对桑椹核地杖菌具有拮抗作用的桑树内生菌，将为桑椹菌核病的防治提供新的思路和资源。

发明内容

本发明的目的是提供一株对桑椹核地杖菌有很强抑制作用的桑树内生菌。根据形态学特征、生理生化试验和分子生物学手段将其鉴定为特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)。通过试验测定确定了其生长温度、发酵产抑菌活性物质的时间，研究发现其不但对桑树组培苗无致死作用且具有促生作用。

桑树内生菌的分离纯化：从重庆市蚕业科学技术研究院采集桑树茎，经严格表面消毒，利用马铃薯琼脂培养基(PDA)、高氏培养基（GA）、水琼脂培养基（WA）分离桑树内生菌，采用平板划线法对内生细菌进行分离纯化。

内生拮抗菌的筛选：将筛选得到的菌株进行发酵，离心获取发酵上清液，采用抑菌圈法筛选对桑椹核地杖菌具有拮抗作用的菌株。

本发明所述的特基拉芽孢杆菌菌株(7PJ-16)已于2015年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052），保藏编号：CCTCCNO：M2015319。

菌株的形态特征(图1)鉴定：在PDA培养基上37℃培养12h菌落呈乳白色、圆形，边缘整齐且光滑，中央突起，有光泽，不透明(图1A)。革兰氏染色呈阳性，细胞呈杆状，多个菌体细胞相连形成链状(图1B)。37℃培养24h，经芽孢染色观察，其菌体中央有单个椭圆形芽孢(图1C)。

菌株生理生化检测结果表明：内生拮抗细菌7PJ-16菌株兼性厌氧；过氧化氢酶呈现阳性；能够利用甘露糖、水解淀粉、液化明胶；能够在含7%NaCl的培养基中生长(表1)。根据7PJ-16的形态学和生化特征，判断其为芽孢杆菌属菌株。

表1：7PJ-16菌株的生理生化试验结果

注：+：阳性；-：表示阴性

5.7PJ-16菌株分子生物学鉴定：提取菌株的基因组DNA，采用细菌通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行16SrDNA序列的PCR扩增，获得长度为1468bp，获得Genbank登录号为KR708875。将所得序列登陆到www.ncbi.nlm.nih.gov网站，进行BLAST比对，根据在NCBI上进行Blast序列比对结果选取相关序列构建系统发育树，系统发育分析结果表明7PJ-16菌株与特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)(KF150708)处于同一最小分枝，且与多株特基拉芽孢杆菌16SrDNA的同源性达到98%以上。根据7PJ-16菌株的菌体形态、培养特征及生理生化特征测定结果，并结合基于16SrDNA的系统发育分析，将该拮抗菌鉴定为特基拉芽孢杆菌，命名为B.tequilensis7PJ-16。

6.7PJ-16菌株的培养温度：该菌株在PDB培养基摇床培养，生长范围为25℃~45℃，其最适生长温度为25℃，在此条件下有最短的代时68.6min和最高的生物量OD₆₀₀可达到6.11。

菌株发酵时间对产抑菌活性物质的影响：菌株在PDB培养基发酵48h的无菌发酵滤液对核地杖菌的抑菌率为38.5%(图2D)，发酵72h~120h时其抑菌率可达100%（图2E-G），当发酵时间延长至144h时其发酵滤液的活性降低，抑菌率仅为32.8%（图2H）。

菌株无菌发酵滤液的热稳定性：取菌株7PJ-16无菌发酵液分别于40℃、60℃、80℃、100℃处理30min其抑菌活性与未处理对照相比无明显差异(图3)。

菌株对桑树组培苗的促生作用：菌株7PJ-16菌体和在PDB培养基发酵96h的无菌发酵滤液分别与桑树组培苗共培养，菌体及发酵液对桑树组培苗无致死作用，且加入发酵液的组培苗在培养两周时植株平均增高0.63cm，与对照组相比增高133.3%（图4）。

本发明的优点是：从桑树中分离获得的特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)，对桑椹缩小性菌核病病原菌桑椹核地杖菌有很强的拮抗作用；该菌株在25℃~45℃范围内均可生长，且无菌发酵滤液有较强的热稳定性，能够适应田间的温度；其发酵滤液对桑树组培苗无致死作用且有促生作用；经鉴定与枯草芽孢杆菌具有很近的遗传距离，并且该菌种未有对人畜致病性报道，因此具有潜在的商业开发和应用价值，在桑椹菌核病的生物防治实践中具有重要的应用前景。

附图说明

图1为7PJ-16菌株的形态特征：A.菌株7PJ-16在PDA培养基上菌落形态；B.革兰氏染色；C.芽孢染色

图2为7PJ-16菌株发酵时间对产抑菌活性物质的影响：CK.灭菌水+PDA；A-H.PDA+菌株7PJ-1628℃发酵6h、12h、48h–144h的无菌发酵滤液

图3为7PJ-16菌株无菌发酵滤液的热稳定性：A：灭菌水+PDA；B：未处理发酵活性滤液+PDA；C-FPDA+经40℃,60℃,80℃,100℃处理30min的7PJ-16菌株无菌发酵滤液

图4为7PJ-16菌株对桑树组培苗的促生作用：A：CK；B：PDB；C：7PJ-16发酵液。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述

实施例1：桑树内生拮抗菌的分离纯化与筛选

1.桑树内生菌的分离、纯化

1.1.内生菌的分离：

样品的采集与保存：从桑园采集桑树茎，用自来水冲洗干净、晾干、编号保存于4℃，并及时分离内生菌。

内生菌分离：将桑树的茎剪成小段(长度约5.0cm)，置于75.0%酒精中完全浸湿，取出后于酒精灯上引燃茎表面的酒精，待酒精燃尽。以此表面消毒的桑枝在空白培养基上滚动，使桑枝每个表面都接触培养基，作为空白对照，验证表面消毒是否彻底。随后将其置于无菌培养皿内用无菌手术刀片分3层剖开，并将所得碎片分别置于PDA培养基、GA培养基及WA培养基表面。

将上述平板置于22℃培养4周，逐日观察。待组织边缘或涂布平板上长出新菌落后，细菌采用平板划线法、真菌采用顶端菌丝纯化法进行纯化培养。获得纯培养的细菌接种于PDB培养基180r/min培养18h，加入30%甘油保存于-80℃冰箱；真菌接种于PDA培养基，培养至菌落长满平板，加入灭菌小麦种子，待菌丝将麦子完全包裹，用无菌镊子将小麦放入灭菌冻存管，保存于-80℃冰箱。

1.2.拮抗内生菌筛选：将分离获得的内生菌接种于PDB培养基，内生细菌28℃，180r/min震荡培养96h；内生真菌22℃，180r/min震荡培养14d，发酵液12000r/min离心30min，取上清过微孔滤膜获得无菌发酵液。

以桑椹缩小性菌核病病原菌核地杖菌(Scleromitrulashiraiana)SXSG-5菌株为靶标，灭菌PDB培养液作对照，采用抑菌圈法检测发酵上清液对核地杖菌的拮抗活性，筛选对核地杖菌具有拮抗作用的菌株，病原菌于22℃培养1周后观察测试结果。

拮抗内生菌7PJ-16菌株分类鉴定

2.1.7PJ-16菌株形态学鉴定:菌落形态观察：将7PJ-16菌株接种于PDA培养基上，37℃培养18h-24h，观察菌落大小、边缘、透明度、色泽、光滑度等。同时，将培养24h的拮抗细菌7PJ-16进行革兰氏及芽孢染色后，在光学显微镜下观察染色结果。

2.2.7PJ-16生理生化指标测定:参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》所描述的生理生化分类方法，采用广东环凯生物科技有限公司生产的生化鉴定管对7PJ-16菌株进行运动性测定、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解、V.P.和葡萄糖产气等试验。

2.3.7PJ-16菌株分子鉴定：使用试剂盒提取7PJ-16菌株基因组DNA，并以其为模板，用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′扩增细菌16SrDNA。所得16SrDNA序列在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比对，下载同源性较高序列，利用MEGA4.0软件，使用N-J法进行1000次步长计算，构建系统发育树，进而确定菌株的分类地位。

实施例2：7PJ-16菌株的生物学特性

1.温度对拮抗细菌7PJ-16菌体生长的影响

将拮抗细菌7PJ-16菌株接种于PDB液体培养基(1%接种量，25%装瓶量)，分别在5℃、15℃、25℃、35℃、45℃和55℃，180r/min震荡培养，定时取菌液测定其OD₆₀₀值（PDB培养基调零），相同处理重复3次取平均值。以培养时间为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标作生长曲线，并计算不同温度下内生拮抗菌7PJ-16菌株的代时。

发酵时间对拮抗细菌7PJ-16菌株产抑菌活性物质的影响

将拮抗细菌7PJ-16菌株接种于PDB培养基(1%接种量，30%装瓶量)，28℃，180r/min摇床培养6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h和144h。以核地仗菌SXSG-5为指示菌，采用菌丝生长速率法测定不同发酵时间的无菌发酵滤液对核地仗菌SXSG-5菌株生长的影响。具体为：将菌株7PJ-16不同发酵时间的无菌发酵滤液以1:4(v/v)的比例与冷却至50℃~60℃的灭菌PDA培养基混匀制备平板，然后将直径5mm的病原菌菌饼接种于平板中央。用灭菌水与PDA培养基1:4(v/v)混匀制备的培养基为空白对照，22℃培养数日，十字交叉法测量菌落直径，每组3个重复，观察记录抑菌活性。

实施例3：7PJ-16发酵液的热稳定性及促生作用

1.拮抗细菌7PJ-16菌株活性发酵液热稳定性检测

将拮抗细菌7PJ-16无菌发酵滤液分别置于40℃、60℃、80℃、100℃处理30min，冷却至室温后，采用菌丝生长速率法检测其对核地杖菌SXSG-5菌株的抑菌活性。以灭菌水为空白对照，以未经热处理的无菌发酵滤液为阳性对照，每组3次重复，判断其对病原菌生长的影响。

拮抗细菌7PJ-16对桑树组培苗的促生作用

取长势一致的组培苗，将7PJ-16菌株菌体及无菌发酵液分别与桑树组培苗共培养，检测其对组培苗生长的影响。接种前测量每株组培苗的高度。拮抗菌菌体制备：将拮抗细菌接种于PDB培养基28℃，180r/min培养12h，稀释菌液至浓度约5×10⁸cfu/m，备用；7PJ-16菌株在PDB培养基28℃，180r/min震荡培养96h，发酵液12000r/min离心30min，取上清过0.22μm微孔滤膜获得无菌发酵液。实验中设计2个对照组：①不做任何处理(CK)；②接入无菌PDB培养基。测试组：①接种菌体：用无菌注射器取50μl菌液注入每株组培苗根部；②接入无菌发酵上清液：用无菌注射器取500μl注入每株组培苗根部。每个处理3株，重复3次。处理后，将组培苗置于25℃人工气候箱中培养，光9h/暗15h，逐日观察组培苗的生长状况，每隔7天测量组培苗高度。