直唇卷瓣兰组织培养快繁方法

摘要

本发明公开了一种直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，包括以下步骤：步骤一、取直唇卷瓣兰新萌发的嫩芽作为外植体，置于第一培养基中培养，得无菌试管苗；步骤二、将步骤一得到的无菌试管苗置于第二培养基中培养，得试管苗丛生芽；步骤三、将步骤二得到的试管丛生芽置于第三培养基中培养，得健壮小苗；步骤四、将步骤三得到的健壮小苗置于第四培养基中培养，得生根试管苗。本发明能够快速有效地提高直唇卷瓣兰种苗的繁殖速度和质量，实现直唇卷瓣兰优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。

说明书

技术领域

本发明属于一种组织培养和植物繁殖领域，特别涉及一种直唇卷瓣兰组织培养快繁方法。

背景技术

直唇卷瓣兰(BulbophyllumdelitescensHance)为兰科石豆兰属的一种植物，其根状茎粗壮，匍匐生根，节间被膜质鞘或鞘腐烂后残留的纤维，每间隔3-11cm处生一个假鳞茎。花葶从生有假鳞茎的根状茎节上发出，伞形花序具2-4朵花花瓣镰状披针形，先端截形而凹缺凹口中央具1个短芒，具3条脉，边缘全缘。唇瓣肉质，舌状，向外下弯。其花独特，花期长，极具观赏价值。种子繁殖由于胚发育不完全，自然条件很难萌发。加之人工采挖的压力，生存环境的恶化，野生资源日益减少，直唇卷瓣兰以被列入国家重点保护野生植物。直唇卷瓣兰的组织培养未见相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，能够快速有效地提高直唇卷瓣兰种苗的繁殖速度和质量，实现直唇卷瓣兰优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，包括以下步骤：

步骤一、取直唇卷瓣兰新萌发的嫩芽作为外植体，置于第一培养基中培养，得无菌试管苗；其中，所述第一培养基包括：花宝1号培养基、0.3-0.7mg/L的甲硫达嗪、1.5-2.5mg/L的萘乙酸、1.5-2.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、25-35g/L蔗糖和4.5-5.5g/L的琼脂；

步骤二、将步骤一得到的无菌试管苗置于第二培养基中培养，得试管苗丛生芽；其中，所述第二培养基包括：花宝1号培养基、0.5-1.5mg/L的甲硫达嗪、1.0-2.5mg/L的萘乙酸、0.2-0.5mg/L的激动素、1.5-2.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、25-35g/L蔗糖和4.5-5.5g/L的琼脂；

步骤三、将步骤二得到的试管丛生芽置于第三培养基中培养，得健壮小苗；其中，所述第三培养基包括：MS、0.1-0.3mg/L的萘乙酸、1.2-1.8mg/L的6-苄基腺嘌呤、25-35g/L蔗糖和4.5-5.5g/L的琼脂；

步骤四、将步骤三得到的健壮小苗置于第四培养基中培养，得生根试管苗；其中，所述第四培养基包括：1/2MS、80-120g/L的香蕉汁、25-30g/L蔗糖和4.5-5.5g/L的琼脂。

优选的是，所述的直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，在所述步骤一中，将外植体置入第一培养基中之前，剥去外层包叶，对外植体进行消毒处理，然后剥去茎尖分生组织，所述消毒处理的具体步骤包括：

步骤a、将外植体置入体积分数为1.5-3％的洗洁精水溶液中浸泡3-7min，取出后用线状自来水冲洗15-30min；

步骤b、将步骤a得到的外植体置入特制消毒剂中浸泡8-10min，取出后用无菌水冲洗3-5次；其中，所述特制消毒剂为在质量分数为0.1％的升汞溶液中添加吐温-20得到，每100毫升质量分数为0.1％的升汞溶液添加的吐温-20的量为2-3滴。

优选的是，所述的直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，在所述步骤四之后，还包括：

步骤五、将步骤四得到的生根试管苗连同培养瓶一起放在自然光照下封盖炼苗7-15天，随后打开培养瓶盖放置3-5天，然后将生根试管苗取出，洗净根部，移栽至椰糠与蛭石质量比为1:1的基质中。

优选的是，所述的直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，

在第一培养基中培养的培养条件：培养温度为22-26℃，光照强度为1200-1800lux，光照时间为8-10小时/天；

在第二培养基中培养的培养条件：培养温度为22-26℃，光照强度为1200-1800lux，光照时间为8-10小时/天；

在第三培养基中培养的培养条件：培养温度为22-26℃，光照强度为1200-1800lux，光照时间为8-10小时/天；

在第四培养基中培养的培养条件：培养温度为22-26℃，光照强度为1200-1800lux，光照时间为8-10小时/天。

优选的是，所述的直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，在所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基中的培养时间分别为25-35天、35-45天、25-35天和25-35天。

优选的是，所述的直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基的初始pH值均为5.5-6.0。

优选的是，所述的直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，在所述步骤一中，在对外植体进行消毒处理之前，还包括：

将外植体用海绵包裹，然后将海绵用质量分数为0.06％的GA3溶液润湿，并放入反应釜中，在8MPa、-6℃条件下保持20分钟，随后在5MPa、20℃条件下保持8分钟，最后在1MPa、30℃条件下保持20分钟。

本发明至少包括以下有益效果：

(1)本发明采用特制的第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基对直唇卷瓣兰进行组织培养，然后进行快速繁殖，能够在短时间内培育出大量适合栽培种植的硬叶兰幼苗，保障直唇卷瓣兰种苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。

(2)本发明首先用第一培养基进行外植体初代诱导获得无菌试管苗，然后用第二培养基进行无菌试管苗丛生芽快速繁殖培养分化出大量丛生芽获得试管丛生芽，随后用第三培养基进行丛生芽壮苗培养获得健壮的植株，最后用第四培养基进行生根培养获得完整带根苗，四种培养基环环相扣，配合紧密，极大提高了直唇卷瓣兰的成苗率。

(3)本发明的步骤七中将外植体用海绵包裹，然后将海绵用质量分数为0.06％的GA3溶液润湿，并放入反应釜中，在8MPa、-6℃条件下保持20分钟，随后在5MPa、20℃条件下保持8分钟，最后在1MPa、30℃条件下保持20分钟。这样依次降低压力而依次升高温度，能够良性刺激外植体进行新陈代谢，诱导外植体分化、生根和成苗，极大提高了直唇卷瓣兰的繁殖系数和成苗率。压力不宜超过8MPa，温度不易低于-6℃，超过8MPa和低于-5℃易对外植体造成不良的影响。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实例1

一种直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，包括以下步骤：

步骤一、取直唇卷瓣兰新萌发的嫩芽作为外植体，置于第一培养基中培养，得无菌试管苗；其中，所述第一培养基包括：花宝1号培养基、0.3mg/L的甲硫达嗪、1.5mg/L的萘乙酸、1.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、25g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂；

步骤二、将步骤一得到的无菌试管苗置于第二培养基中培养，得试管苗丛生芽；其中，所述第二培养基包括：花宝1号培养基、0.5mg/L的甲硫达嗪、1.0mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的激动素、1.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、25g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂；

步骤三、将步骤二得到的试管丛生芽置于第三培养基中培养，得健壮小苗；其中，所述第三培养基包括：MS、0.1mg/L的萘乙酸、1.2mg/L的6-苄基腺嘌呤、25g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂；

步骤四、将步骤三得到的健壮小苗置于第四培养基中培养，得生根试管苗；其中，所述第四培养基包括：1/2MS、80g/L的香蕉汁、25g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂。

在所述步骤一中，将外植体置入第一培养基中之前，剥去外层包叶，对外植体进行消毒处理，然后剥去茎尖分生组织，所述消毒处理的具体步骤包括：

步骤a、将外植体置入体积分数为1.5％的洗洁精水溶液中浸泡3min，取出后用线状自来水冲洗15min；

步骤b、将步骤a得到的外植体置入特制消毒剂中浸泡8min，取出后用无菌水冲洗3次；其中，所述特制消毒剂为在质量分数为0.1％的升汞溶液中添加吐温-20得到，每100毫升质量分数为0.1％的升汞溶液添加的吐温-20的量为2滴。

在所述步骤四之后，还包括：

步骤五、将步骤四得到的生根试管苗连同培养瓶一起放在自然光照下封盖炼苗7天，随后打开培养瓶盖放置3天，然后将生根试管苗取出，洗净根部，移栽至椰糠与蛭石质量比为1:1的基质中。

在第一培养基中培养的培养条件：培养温度为22℃，光照强度为1200lux，光照时间为8小时/天；

在第二培养基中培养的培养条件：培养温度为22℃，光照强度为1200lux，光照时间为8小时/天；

在第三培养基中培养的培养条件：培养温度为22℃，光照强度为1200lux，光照时间为8小时/天；

在第四培养基中培养的培养条件：培养温度为22℃，光照强度为1200lux，光照时间为8小时/天。

在所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基中的培养时间分别为25天、35天、25天和25天。

所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基的初始pH值均为5.5。

实例2

一种直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，包括以下步骤：

步骤一、取直唇卷瓣兰新萌发的嫩芽作为外植体，置于第一培养基中培养，得无菌试管苗；其中，所述第一培养基包括：花宝1号培养基、0.7mg/L的甲硫达嗪、2.5mg/L的萘乙酸、2.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、35g/L蔗糖和5.5g/L的琼脂；

步骤二、将步骤一得到的无菌试管苗置于第二培养基中培养，得试管苗丛生芽；其中，所述第二培养基包括：花宝1号培养基、1.5mg/L的甲硫达嗪、2.5mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的激动素、2.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、35g/L蔗糖和5.5g/L的琼脂；

步骤三、将步骤二得到的试管丛生芽置于第三培养基中培养，得健壮小苗；其中，所述第三培养基包括：MS、0.3mg/L的萘乙酸、1.8mg/L的6-苄基腺嘌呤、35g/L蔗糖和5.5g/L的琼脂；

步骤四、将步骤三得到的健壮小苗置于第四培养基中培养，得生根试管苗；其中，所述第四培养基包括：1/2MS、120g/L的香蕉汁、30g/L蔗糖和5.5g/L的琼脂。

在所述步骤一中，将外植体置入第一培养基中之前，剥去外层包叶，对外植体进行消毒处理，然后剥去茎尖分生组织，所述消毒处理的具体步骤包括：

步骤a、将外植体置入体积分数为3％的洗洁精水溶液中浸泡7min，取出后用线状自来水冲洗30min；

步骤b、将步骤a得到的外植体置入特制消毒剂中浸泡10min，取出后用无菌水冲洗5次；其中，所述特制消毒剂为在质量分数为0.1％的升汞溶液中添加吐温-20得到，每100毫升质量分数为0.1％的升汞溶液添加的吐温-20的量为3滴。

在所述步骤四之后，还包括：

步骤五、将步骤四得到的生根试管苗连同培养瓶一起放在自然光照下封盖炼苗15天，随后打开培养瓶盖放置5天，然后将生根试管苗取出，洗净根部，移栽至椰糠与蛭石质量比为1:1的基质中。

在第一培养基中培养的培养条件：培养温度为26℃，光照强度为1800lux，光照时间为10小时/天；

在第二培养基中培养的培养条件：培养温度为26℃，光照强度为1800lux，光照时间为10小时/天；

在第三培养基中培养的培养条件：培养温度为26℃，光照强度为1800lux，光照时间为10小时/天；

在第四培养基中培养的培养条件：培养温度为26℃，光照强度为1800lux，光照时间为10小时/天。

在所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基中的培养时间分别为35天、45天、35天和35天。

所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基的初始pH值均为6.0。

实例3

一种直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，包括以下步骤：

步骤一、取直唇卷瓣兰新萌发的嫩芽作为外植体，置于第一培养基中培养，得无菌试管苗；其中，所述第一培养基包括：花宝1号培养基、0.5mg/L的甲硫达嗪、2mg/L的萘乙酸、2mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂；

步骤二、将步骤一得到的无菌试管苗置于第二培养基中培养，得试管苗丛生芽；其中，所述第二培养基包括：花宝1号培养基、0.5-1.5mg/L的甲硫达嗪、1.0-2.5mg/L的萘乙酸、0.2-0.5mg/L的激动素、1.5-2.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、25-35g/L蔗糖和4.5-5.5g/L的琼脂；

步骤三、将步骤二得到的试管丛生芽置于第三培养基中培养，得健壮小苗；其中，所述第三培养基包括：MS、0.2mg/L的萘乙酸、1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂；

步骤四、将步骤三得到的健壮小苗置于第四培养基中培养，得生根试管苗；其中，所述第四培养基包括：1/2MS、100g/L的香蕉汁、28g/L蔗糖和5g/L的琼脂。

在所述步骤一中，将外植体置入第一培养基中之前，剥去外层包叶，对外植体进行消毒处理，然后剥去茎尖分生组织，所述消毒处理的具体步骤包括：

步骤a、将外植体置入体积分数为2％的洗洁精水溶液中浸泡5min，取出后用线状自来水冲洗20min；

步骤b、将步骤a得到的外植体置入特制消毒剂中浸泡9min，取出后用无菌水冲洗4次；其中，所述特制消毒剂为在质量分数为0.1％的升汞溶液中添加吐温-20得到，每100毫升质量分数为0.1％的升汞溶液添加的吐温-20的量为3滴。

在所述步骤四之后，还包括：

步骤五、将步骤四得到的生根试管苗连同培养瓶一起放在自然光照下封盖炼苗10天，随后打开培养瓶盖放置4天，然后将生根试管苗取出，洗净根部，移栽至椰糠与蛭石质量比为1:1的基质中。

在第一培养基中培养的培养条件：培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为9小时/天；

在第二培养基中培养的培养条件：培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为9小时/天；

在第三培养基中培养的培养条件：培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为9小时/天；

在第四培养基中培养的培养条件：培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为9小时/天。

在所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基中的培养时间分别为30天、40天、30天和30天。

所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基的初始pH值均为5.8。

实例4

一种直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，包括以下步骤：

步骤一、取直唇卷瓣兰新萌发的嫩芽作为外植体，置于第一培养基中培养，得无菌试管苗；其中，所述第一培养基包括：花宝1号培养基、0.3mg/L的甲硫达嗪、1.5mg/L的萘乙酸、1.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、25g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂；

步骤二、将步骤一得到的无菌试管苗置于第二培养基中培养，得试管苗丛生芽；其中，所述第二培养基包括：花宝1号培养基、0.5mg/L的甲硫达嗪、1.0mg/L的萘乙酸、0.2mg/L的激动素、1.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、25g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂；

步骤三、将步骤二得到的试管丛生芽置于第三培养基中培养，得健壮小苗；其中，所述第三培养基包括：MS、0.1mg/L的萘乙酸、1.2mg/L的6-苄基腺嘌呤、25g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂；

步骤四、将步骤三得到的健壮小苗置于第四培养基中培养，得生根试管苗；其中，所述第四培养基包括：1/2MS、80g/L的香蕉汁、25g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂。

在所述步骤一中，将外植体置入第一培养基中之前，剥去外层包叶，对外植体进行消毒处理，然后剥去茎尖分生组织，所述消毒处理的具体步骤包括：

步骤a、将外植体置入体积分数为1.5％的洗洁精水溶液中浸泡3min，取出后用线状自来水冲洗15min；

步骤b、将步骤a得到的外植体置入特制消毒剂中浸泡8min，取出后用无菌水冲洗3次；其中，所述特制消毒剂为在质量分数为0.1％的升汞溶液中添加吐温-20得到，每100毫升质量分数为0.1％的升汞溶液添加的吐温-20的量为2滴。

在所述步骤四之后，还包括：

步骤五、将步骤四得到的生根试管苗连同培养瓶一起放在自然光照下封盖炼苗7天，随后打开培养瓶盖放置3天，然后将生根试管苗取出，洗净根部，移栽至椰糠与蛭石质量比为1:1的基质中。

在第一培养基中培养的培养条件：培养温度为22℃，光照强度为1200lux，光照时间为8小时/天；

在第二培养基中培养的培养条件：培养温度为22℃，光照强度为1200lux，光照时间为8小时/天；

在第三培养基中培养的培养条件：培养温度为22℃，光照强度为1200lux，光照时间为8小时/天；

在第四培养基中培养的培养条件：培养温度为22℃，光照强度为1200lux，光照时间为8小时/天。

在所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基中的培养时间分别为25天、35天、25天和25天。

所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基的初始pH值均为5.5。

在所述步骤一中，在对外植体进行消毒处理之前，还包括：

将外植体用海绵包裹，然后将海绵用质量分数为0.06％的GA3溶液润湿，并放入反应釜中，在8MPa、-6℃条件下保持20分钟，随后在5MPa、20℃条件下保持8分钟，最后在1MPa、30℃条件下保持20分钟。

实例5

一种直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，包括以下步骤：

步骤一、取直唇卷瓣兰新萌发的嫩芽作为外植体，置于第一培养基中培养，得无菌试管苗；其中，所述第一培养基包括：花宝1号培养基、0.7mg/L的甲硫达嗪、2.5mg/L的萘乙酸、2.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、35g/L蔗糖和5.5g/L的琼脂；

步骤二、将步骤一得到的无菌试管苗置于第二培养基中培养，得试管苗丛生芽；其中，所述第二培养基包括：花宝1号培养基、1.5mg/L的甲硫达嗪、2.5mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的激动素、2.5mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、35g/L蔗糖和5.5g/L的琼脂；

步骤三、将步骤二得到的试管丛生芽置于第三培养基中培养，得健壮小苗；其中，所述第三培养基包括：MS、0.3mg/L的萘乙酸、1.8mg/L的6-苄基腺嘌呤、35g/L蔗糖和5.5g/L的琼脂；

步骤四、将步骤三得到的健壮小苗置于第四培养基中培养，得生根试管苗；其中，所述第四培养基包括：1/2MS、120g/L的香蕉汁、30g/L蔗糖和5.5g/L的琼脂。

在所述步骤一中，将外植体置入第一培养基中之前，剥去外层包叶，对外植体进行消毒处理，然后剥去茎尖分生组织，所述消毒处理的具体步骤包括：

步骤a、将外植体置入体积分数为3％的洗洁精水溶液中浸泡7min，取出后用线状自来水冲洗30min；

步骤b、将步骤a得到的外植体置入特制消毒剂中浸泡10min，取出后用无菌水冲洗5次；其中，所述特制消毒剂为在质量分数为0.1％的升汞溶液中添加吐温-20得到，每100毫升质量分数为0.1％的升汞溶液添加的吐温-20的量为3滴。

在所述步骤四之后，还包括：

步骤五、将步骤四得到的生根试管苗连同培养瓶一起放在自然光照下封盖炼苗15天，随后打开培养瓶盖放置5天，然后将生根试管苗取出，洗净根部，移栽至椰糠与蛭石质量比为1:1的基质中。

在第一培养基中培养的培养条件：培养温度为26℃，光照强度为1800lux，光照时间为10小时/天；

在第二培养基中培养的培养条件：培养温度为26℃，光照强度为1800lux，光照时间为10小时/天；

在第三培养基中培养的培养条件：培养温度为26℃，光照强度为1800lux，光照时间为10小时/天；

在第四培养基中培养的培养条件：培养温度为26℃，光照强度为1800lux，光照时间为10小时/天。

在所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基中的培养时间分别为35天、45天、35天和35天。

所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基的初始pH值均为6.0。

在所述步骤一中，在对外植体进行消毒处理之前，还包括：

将外植体用海绵包裹，然后将海绵用质量分数为0.06％的GA3溶液润湿，并放入反应釜中，在8MPa、-6℃条件下保持20分钟，随后在5MPa、20℃条件下保持8分钟，最后在1MPa、30℃条件下保持20分钟。

实例6

一种直唇卷瓣兰组织培养快繁方法，包括以下步骤：

步骤一、取直唇卷瓣兰新萌发的嫩芽作为外植体，置于第一培养基中培养，得无菌试管苗；其中，所述第一培养基包括：花宝1号培养基、0.5mg/L的甲硫达嗪、2mg/L的萘乙酸、2mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂；

步骤二、将步骤一得到的无菌试管苗置于第二培养基中培养，得试管苗丛生芽；其中，所述第二培养基包括：花宝1号培养基、1mg/L的甲硫达嗪、2mg/L的萘乙酸、0.3mg/L的激动素、2mg/L的聚乙烯吡咯烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂；

步骤三、将步骤二得到的试管丛生芽置于第三培养基中培养，得健壮小苗；其中，所述第三培养基包括：MS、0.2mg/L的萘乙酸、1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂；

步骤四、将步骤三得到的健壮小苗置于第四培养基中培养，得生根试管苗；其中，所述第四培养基包括：1/2MS、100g/L的香蕉汁、28g/L蔗糖和5g/L的琼脂。

在所述步骤一中，将外植体置入第一培养基中之前，剥去外层包叶，对外植体进行消毒处理，然后剥去茎尖分生组织，所述消毒处理的具体步骤包括：

步骤a、将外植体置入体积分数为2％的洗洁精水溶液中浸泡5min，取出后用线状自来水冲洗20min；

步骤b、将步骤a得到的外植体置入特制消毒剂中浸泡9min，取出后用无菌水冲洗4次；其中，所述特制消毒剂为在质量分数为0.1％的升汞溶液中添加吐温-20得到，每100毫升质量分数为0.1％的升汞溶液添加的吐温-20的量为3滴。

在所述步骤四之后，还包括：

步骤五、将步骤四得到的生根试管苗连同培养瓶一起放在自然光照下封盖炼苗10天，随后打开培养瓶盖放置4天，然后将生根试管苗取出，洗净根部，移栽至椰糠与蛭石质量比为1:1的基质中。

在第一培养基中培养的培养条件：培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为9小时/天；

在第二培养基中培养的培养条件：培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为9小时/天；

在第三培养基中培养的培养条件：培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为9小时/天；

在第四培养基中培养的培养条件：培养温度为25℃，光照强度为1500lux，光照时间为9小时/天。

在所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基中的培养时间分别为30天、40天、30天和30天。

所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基和所述第四培养基的初始pH值均为5.8。

在所述步骤一中，在对外植体进行消毒处理之前，还包括：

将外植体用海绵包裹，然后将海绵用质量分数为0.06％的GA3溶液润湿，并放入反应釜中，在8MPa、-6℃条件下保持20分钟，随后在5MPa、20℃条件下保持8分钟，最后在1MPa、30℃条件下保持20分钟。

为了说明本发明的效果，发明人提供比较实验如下：

<比较例1>

在对外植体进行消毒处理之前，将外植体用海绵包裹，然后在5MPa、20℃条件下保持48分钟，其余参数与实例6中的完全相同，工艺过程也完全相同。

<比较例2>

在配制第二培养基时，控制甲硫达嗪的含量为0.1mg/L，其余参数与实例6中的完全相同，工艺过程也完全相同。

实验：

按照实例1、实例2、实例3、实例4、实例5、实例6、比较例1和比较例2中的方案分别对直唇卷瓣兰进行组织培养，统计丛生芽增殖系数。然后，将一块大田分为8块区域，将实例1、实例2、实例3、实例4、实例5、实例6、比较例1和比较例2的基质中的生根试管苗分别移栽到8块区域中，并统计成苗率。结果如表1所示。

表1丛生芽增殖系数和成苗率

丛生芽增殖系数成苗率(％)实例115.187％实例217.585％实例322.085％实例430.595％

实例529.596％实例631.098％比较例128.083％比较例225.386％

从上表1能够看出，按照实例1、实例2、实例3、实例4、实例5、实例6、比较例1和比较例2中的技术方案进行组织培养，其丛生芽增殖系数和成苗率均有较大的提高。而且，实例6中由于对外植体进行变温变压处理，其丛生芽增殖系数和成苗率均高于比较例1，实例6在配制第二培养基时，由于控制甲硫达嗪的含量为1mg/L，其丛生芽增殖系数和成苗率均高于比较例2。因此，进行变温变压处理与第二培养基中合适的甲硫达嗪的浓度均能明显提高丛生芽增殖系数和成苗率。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。