一种家独行菜的组织培养方法

摘要

本发明公开了一种家独行菜的组织培养方法，其首先获取无菌萌发苗，然后在无菌操作台上，将家独行菜无菌萌发苗茎剪切备用，将剪切好的外植体取下胚轴接入加入愈伤组织诱导培养基获得愈伤组织，将生长良好的愈伤组织接种到琼脂固化的不定芽诱导培养基上培养获得丛生的不定芽，取不定芽转入生根培养基中进行生根培养获得生根小植株。本发明优化了家独行菜丛生芽快繁体系，为进一步扩大生产提供可能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种家独行菜的组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

家独行菜(LepidiumsativumL.)是十字花科独行菜属植物家独行菜的全草，生长在非洲东北部及亚洲西南部地区，为一年生草本植物，具有祛痰止咳、温中、利尿等功效并且可做菜食用，我国维吾尔族利用该植物治疗胃病。

家独行菜子有扩张冠状动脉、解毒、理肺杀虫、广谱抗菌等活性。现代药理学研究表明家独行菜具有利尿、抗坏血病、降血糖、降血压、治疗胃肠病和骨折等活性，对心血管、高血脂、糖尿病、癌症等疾病具有显著功效，含有的芥子油等能有效起到防癌抗癌的作用，而苦味质勒皮啶可用于抗疟疾病。家独行菜内含有生物碱、萜烯、黄酮类、芥子油苷等化合物，家独行菜子水提物具有显著的镇咳、抗炎作用，水、醇提物均具有明显的抑菌作用；家独行菜子水浸液具有抗实验性胃溃疡的作用，能促进溃疡愈合、抑制小肠运动，并具有显著的止痛作用。

家独行菜的药用价值很高，成为许多地区和国家食疗用品，但国内的种植很少，相关的种植技术不成熟，产量低下，无法满足庞大的市场需求。

发明内容

本发明目的是通过现代植物组织培养技术，利用茎段作为外植体，利用不同植物激素配比将外植体进行诱导，产生愈伤组织，并利用细胞分裂素和植物生长素的不同配比诱导分化并优化丛生芽的生长，进而诱导根的分化和生长，建立起家独行菜的高频离体再生体系，提供一种家独行菜的高效快速组织培养方法。

本发明的具体操作步骤如下：

一种家独行菜的组织培养方法，包括以下步骤：

（1）获取无菌萌发苗

将家独行菜种子进行振荡灭菌，去除家独行菜种子外部包裹的多糖类物质，进而接入MS₀固体培养基中获取无菌萌发苗；

（2）选择外植体

在无菌操作台上，将家独行菜无菌萌发苗茎剪切备用；

（3）愈伤组织的诱导

将剪切好的外植体取下胚轴接入加入2,4-D和6-BA的琼脂固化MS愈伤组织诱导培养基，固体培养的条件是：25±1℃下培养，湿度保持65±5%，15-25天后，获得愈伤组织；

（4）丛生芽的诱导

将生长良好的愈伤组织接种到琼脂固化的MS+2,4-D，6-BA,TDZ的不定芽诱导培养基上，培养条件为：25±1℃下培养，湿度保持65±5%，14-21天后，获得丛生的不定芽；

（5）生根培养

取分化的不定芽转入琼脂固化MS+NAA0.4-0.6mg/L的生根培养基中，置于培养室进行生根培养，固体培养条件是2000-25001x日光灯照射，光照10-15h/d，25±1℃下培养，湿度保持65±5%，15-25天后，获得生根小植株。

家独行菜种子外部包裹一种多糖类物质，常规灭菌方法很难除去且易染菌，难以实现种子的出芽生长，因此，步骤（1）中在无菌条件下，利用体积比水：5%NaClO：70%乙醇=1:2:7比例的混合溶液对种子进行振荡灭菌20-30min，再用乙醇灭菌30-50s。所选的家独行菜具有10-15天苗龄的幼嫩茎部，将茎切成5mm左右茎段进行接种。

上述步骤（3）中，愈伤组织诱导培养基的激素配比是2,4-D1-2mg/L+6-BA0.5-1.0mg/L，光照条件：1600-2000lx，16h/8h（光照/黑暗）。

上述步骤（4）中，不定芽诱导培养基的激素配比是2,4-D0.2-1mg/L+6-BA1-2mg/L+TDZ0.2-0.6mg/L，光照条件：2000-2500lx，16h/8h（光照/黑暗）。

上述步骤（5）中，选择用于生根培养的丛生苗长于2cm。

本发明提供了一种家独行菜的高效快速组织培养方法，进一步优化了家独行菜丛生芽快繁体系，为进一步扩大生产提供可能。

附图说明

图1为本发明去除家独行菜种子外部包裹的多糖类物质进而接入MS₀固体培养基中获取的无菌萌发苗；

图2为本发明外植体在MS愈伤组织诱导培养基上分化得到的愈伤组织；

图3为本发明外植体诱导分化得到的愈伤组织在显微镜下的观察结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地说明。本发明的特点和优点将随着描述而更清楚，但这示例性的实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围作任何限制。

（1）获取无菌萌发苗

将家独行菜种子取出，在无菌条件下，利用水、NaClO、乙醇以一定比例（1︰2︰7，1︰7︰2和1︰1︰1，乙醇浓度为70%，NaClO浓度为5%）混合的溶液对种子进行振荡灭菌20-30min，将容器中的溶液倒出，再向容器中倒入乙醇振荡，灭菌30-50s，去除家独行菜种子外部包裹的多糖类物质，进而接入MS₀固体培养基中获取无菌萌发苗。

表1可见，水：5%NaClO：70%乙醇=1:2:7的比例混合溶液对种子进行振荡灭菌可有效去除种子外部包裹的多糖类物质。

（2）选择外植体

取家独行菜无菌萌发苗于无菌操作台上，切取茎段作为外植体，将消毒好的外植体接入MS愈伤组织诱导培养基上培养。

（3）愈伤组织的诱导

将处理好的外植体分别接入琼脂固化的添加不同浓度梯度激素的MS愈伤组织诱导培养基中，筛选出最适激素浓度配比。固体培养的条件是1600-20001x日光灯照射，光照16h/d，25±1℃下培养，湿度保持65±5%，15-25天后，获得愈伤组织。

表2可得到MS+2,4D1.5mg/L+6-BA0.5mg/l的培养基最适合茎段诱导为愈伤组织。

（4）愈伤组织诱导丛生芽

表3可得到MS+2,4D0.5mg/L+6-BA1.5mg/L+TDZ0.5mg/L的培养基最适合分化丛生芽，诱导率可得85%。

（5）生根培养

选择分化比较好的新长出的不定芽2cm左右转入加入不同浓度NAA的琼脂固化MS生根培养基中置于培养室进行生根培养，筛选出适合不定芽诱导生根的最适激素浓度配比。固体培养条件是2000-25001x日光灯照射，光照10-15h/d，25±1℃下培养，湿度保持65±5%，15-25天后，获得生根小植株。

表4可得，浓度为MS+NAA0.6mg/L的培养基最适合不定芽的再分化。