分离式DNA支点介导的链置换反应用于17β-雌二醇的检测方法及检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种分离式DNA支点介导的链置换反应用于17β-雌二醇的检测方法及检测试剂盒。试剂盒包括缓冲体系和核酸序列A、B、C、D、E和F，序列A是17β-雌二醇的核酸适体，能与之特异性结合，把A-B双链的B置换下来；B与C、D形成B-C-D复合物；利用B-C-D中的DNA支点，与E-F反应，启动链置换反应，可把修饰荧光基团的核酸从与修饰淬灭基团的核酸的结合中置换下来，从而发出较强的荧光。本发明操作简单、经济实惠、无需固定洗涤分离过程，适于快速检测，适于在基层推广，具有广泛的应用价值。本发明方法具有较高的灵敏度，可检测到0.3nM的17β-雌二醇，线性范围为1nM到400nM。

说明书

技术领域

本发明属于环境污染物检测领域，涉及一种分离式DNA支点介导的链置换反应用于17β-雌二醇的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

17β-雌二醇是一类典型的环境污染源，广泛存在于河流、土壤、水源、大气以及农产品中，属于环境雌激素，是一种作用最强烈、最具潜在危害的内分泌干扰物，可模拟内源性雌激素行为。17β-雌二醇一般以痕量存在，传统的检测方法主要是液相色谱法、气质联用法、液质联用法等。但这些质谱色谱技术需要麻烦的样品预处理过程，需要昂贵的分析仪器，检测时间较长，难以实现快速分析。

因此，开发一种操作简单、成本低廉、可快速检测在环境的17β-雌二醇的方法以及相关检测试剂盒具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于建立一种分离式DNA支点介导的链置换反应用于17β-雌二醇的检测方法及检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种分子检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系；核酸序列由核酸序列A、B、C、D、E和F组成；其中序列A为待测分子的核酸适体；A中的部分序列与B互补；序列B具有a区和b区；序列C具有a*区和c区；序列D具有d区和b*区；序列E具有c*区和d*区；E的一端修饰有荧光基团或淬灭基团；序列F具有c区；F的一端修饰有与E对应的淬灭基团或荧光基团；其中上述a、b、c、d区分别与a*、b*、c*、d*区序列互补配对。

优选的，a、b、c区序列的长度独立为9～21个碱基。

优选的，序列D的d区域可作为DNA支点，其序列长度为4-10个碱基。

优选的，荧光基团包括FAM、Cy3、Cy5。

优选的，淬灭基团包括BHQ、金纳米颗粒、量子点、石墨烯。

优选的，缓冲体系为含盐离子浓度的缓冲体系。

一种17β-雌二醇检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系，其特征在于：核酸序列由核酸序列A、B、C、D、E和F组成，其中

序列A：5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3'（SEQIDNO：1）；

序列B:5'-TGCGCAGAGCCGCTA(b)CCCTCTGCGTGTAAT(a)-3'（SEQIDNO：2）；

序列C:5'-ATTACACGCAGAGGG(a*)AACTGCTAGCTTCAG(c)-3'（SEQIDNO：3）；

序列D:5'-AGCTAC(d)TAGCGGCTCTGCGCA(b*)-3'（SEQIDNO：4）；

序列E:5'-FAM-CTGAAGCTAGCAGTT（c*）GTAGCT（d*）-3'（SEQIDNO：5）；

序列F:5'-AACTGCTAGCTTCAG（c）-BHQ-3'（SEQIDNO：6）。

优选的，缓冲体系是10mMTris-HCl缓冲液，pH=8。

一种分子的检测方法，包括如下步骤：

1)将核酸序列A和B溶于缓冲体系中，充分反应，形成A-B双链核酸；

2)将核酸序列E和F溶于另一份缓冲体系中，充分反应，形成E-F双链核酸；

3)在步骤1）的缓冲体系中继续加入待测样品、核酸序列C、D，充分反应后，再次加入步骤2）获得的产物，继续反应；

4)根据反应体系的荧光值变化情况确定待测分子的浓度；

其中，核酸序列A～F的结构如上所述。

一种17β-雌二醇的检测方法，包括如下步骤：

1)将核酸序列A和B溶于缓冲体系中，充分反应，形成A-B双链核酸；

2)将核酸序列E和F溶于另一份缓冲体系中，充分反应，形成E-F双链核酸；

3)在步骤1）的缓冲体系中继续加入待测样品、核酸序列C、D，充分反应后，再次加入步骤2）获得的产物，继续反应；

4)根据反应体系的荧光值变化情况确定待测样品中17β-雌二醇的浓度；

其中，核酸序列A～F的结构如上所述。

本发明的有益效果是：

（1）反应过程可在溶液体系中一次完成，无需涉及核酸固定、洗涤、分离过程，操作简单，检测快速，方便用于快速检测。

（2）设计的分离式DNA支点无需茎环结构DNA，设计简单，该模式可用于检测多种物质，针对不同的核酸适体，修改对应核酸序列，即可套用分离式DNA支点完成检测。

（3）本发明方法具有较高的灵敏度，可检测到0.3nM的17β-雌二醇，线性范围为1nM到400nM。

附图说明

图1为本发明所述的检测方法的原理图；

图2为对不同浓度17β-雌二醇检测的结果图；

图3为特异性实验结果图。

具体实施方式

一种分子检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系；核酸序列由核酸序列A、B、C、D、E和F组成；其中序列A为待测分子的核酸适体；A中的部分序列与B互补；序列B具有a区和b区；序列C具有a*区和c区；序列D具有d区和b*区；序列E具有c*区和d*区；E的一端修饰有荧光基团或淬灭基团；序列F具有c区；F的一端修饰有与E对应的淬灭基团或荧光基团；其中上述a、b、c、d区分别与a*、b*、c*、d*区序列互补配对。

优选的，a、b、c区序列的长度独立为9～21个碱基。

更有选的，a、b、c区序列的长度独立为15个碱基。

优选的，序列D的d区域可作为DNA支点，其序列长度为4-10个碱基。

更优选的，序列D的d区域的长度为6个碱基。

优选的，荧光基团包括FAM、Cy3、Cy5。

优选的，淬灭基团包括BHQ、金纳米颗粒、量子点、石墨烯。

优选的，缓冲体系为含盐离子浓度的缓冲体系。

一种17β-雌二醇检测试剂盒，包括核酸序列、缓冲体系，其特征在于：核酸序列由核酸序列A、B、C、D、E和F组成，其中

序列A：5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3'（SEQIDNO：1）；

序列B:5'-TGCGCAGAGCCGCTA(b)CCCTCTGCGTGTAAT(a)-3'（SEQIDNO：2）；

序列C:5'-ATTACACGCAGAGGG(a*)AACTGCTAGCTTCAG(c)-3'（SEQIDNO：3）；

序列D:5'-AGCTAC(d)TAGCGGCTCTGCGCA(b*)-3'（SEQIDNO：4）；

序列E:5'-FAM-CTGAAGCTAGCAGTT（c*）GTAGCT（d*）-3'（SEQIDNO：5）；

序列F:5'-AACTGCTAGCTTCAG（c）-BHQ-3'（SEQIDNO：6）。

优选的，缓冲体系是10mMTris-HCl缓冲液，pH=8。

一种分子的检测方法，包括如下步骤：

1)将核酸序列A和B溶于缓冲体系中，充分反应，形成A-B双链核酸；

2)将核酸序列E和F溶于另一份缓冲体系中，充分反应，形成E-F双链核酸；

3)在步骤1）的缓冲体系中继续加入待测样品、核酸序列C、D，充分反应后，再次加入步骤2）获得的产物，继续反应；

4)根据反应体系的荧光值变化情况确定待测分子的浓度；

其中，核酸序列A～F的结构如上所述。

一种17β-雌二醇的检测方法，包括如下步骤：

1)将核酸序列A和B溶于缓冲体系中，充分反应，形成A-B双链核酸；

2)将核酸序列E和F溶于另一份缓冲体系中，充分反应，形成E-F双链核酸；

3)在步骤1）的缓冲体系中继续加入待测样品、核酸序列C、D，充分反应后，再次加入步骤2）获得的产物，继续反应；

4)根据反应体系的荧光值变化情况确定待测样品中17β-雌二醇的浓度；

其中，核酸序列A～F的结构如上所述。

以17β-雌二醇的检测为例，进一步阐述本发明的检测原理（如图1所示）：

（1）核酸序列A是17β-雌二醇的核酸适体，能与17β-雌二醇特异性结合。B能与A部分序列互补。A和B先杂交，形成A-B双链核酸。

（2）加入17β-雌二醇，A能与17β-雌二醇相互作用，从而把B置换下来。

（3）置换下来的B能与C的一部分以及D的一部分互补，形成B-C-D复合物。

（4）E的一端修饰荧光基团，F的一端修饰淬灭基团，E和F互补，使荧光基团和淬灭基团靠近，发生荧光淬灭。也可以更换为E的一端修饰淬灭基团，F的一端修饰荧光基团。

（5）B-C-D复合物中，D的d区域可以作为DNA支点，能与E-F复合物中的d*区域互补，从而启动链置换反应，C的c区域与E-F复合物中的c*区域互补，链置换反应启动后，可以把E-F复合物中的F置换下来，形成B-C-D-E复合物，此时荧光基团和淬灭基团分离，体系发出较强的荧光，并且荧光强度与17β-雌二醇浓度呈正相关，从而可以达到检测17β-雌二醇的目的。

下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案，但不限于此。

实施例1

DNA支点介导的链置换反应用于17β-雌二醇的检测试剂盒，包括以下成分：

（1）核酸序列A、B、C、D、E、F；具体序列如下：

序列A：5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3'（SEQIDNO：1）；

序列B:5'-TGCGCAGAGCCGCTA(b)CCCTCTGCGTGTAAT(a)-3'（SEQIDNO：2）；

序列C:5'-ATTACACGCAGAGGG(a*)AACTGCTAGCTTCAG(c)-3'（SEQIDNO：3）；

序列D:5'-AGCTAC(d)TAGCGGCTCTGCGCA(b*)-3'（SEQIDNO：4）；

序列E:5'-FAM-CTGAAGCTAGCAGTT（c*）GTAGCT（d*）-3'（SEQIDNO：5）；

序列F:5'-AACTGCTAGCTTCAG（c）-BHQ-3'（SEQIDNO：6）。

（2）17β-雌二醇标准溶液。

（3）10mMTris-HCl缓冲液（pH=8，含有100mMNaCl，20mMKCl，5mMMgCl₂）。

DNA支点介导的链置换反应用于17β-雌二醇的检测方法，按照如下步骤进行：

(1)200nM的A和200nM的B用10mMTris-HCl缓冲液（pH=8，含有100mMNaCl，20mMKCl，5mMMgCl₂）溶解，充分混匀，室温反应30分钟。

(2)加入17β-雌二醇，室温反应45分钟。

(3)加入200nM的C和D，室温反应30分钟。

(4)200nM的E和F先溶解在10mMTris-HCl缓冲液（pH=8，含有100mMNaCl，20mMKCl，5mMMgCl₂）中，充分混匀，室温反应30分钟，形成E-F。

(5)把E-F加入到步骤（3）的反应产物中，充分混匀，室温反应60分钟。反应液在495nm激发光激发下，记录525nm发射光强度。

实施例2：对不同浓度17β-雌二醇的检测：

配制17β-雌二醇标准溶液，浓度分别为1nM、10nM、100nM、200nM、400nM和800nM室温保存。

将不同浓度的17β-雌二醇溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图2所示，随着17β-雌二醇浓度的增加，对应的荧光强度逐渐增加，当17β-雌二醇浓度超过400nM时，逐渐达到饱和。以17β-雌二醇的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，二者具有很好的线性关系，线性范围是从1nM到400nM，线性方程是：F=138.75+1.1C（R²=0.952）（F为荧光强度，C为17β-雌二醇浓度），按照3倍信噪比标准（3S/N），检测限为0.3nM。

实施例3：特异性实验：

配制浓度为500nM的不同干扰物标准溶液，分别是双酚A、孕酮、西维因、洁霉素、丝裂霉素、雌三醇。

将500nM的不同干扰物标准溶液和100nM17β-雌二醇标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后记录荧光强度变化，如图3所示，500nM的双酚A、孕酮、西维因、洁霉素、丝裂霉素、雌三醇没有产生明显的荧光强度变化，对检测不产生影响。只有当加入17β-雌二醇后荧光强度明显增加，表明该方法对17β-雌二醇的检测具有很好的特异性。

<110>分离式DNA支点介导的链置换反应用于17β

-雌二醇的检测方法及检测试剂盒

<120>广东省生态环境与土壤研究所

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