乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒及检测方法

摘要

本发明提供一种乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒及检测方法，属于生物检验技术领域。采用的技术方案是：设计合成特异性针对乙型肝炎病毒八种基因亚型的引物和探针，并分别对探针进行荧光标记，运用荧光PCR方法进行特异性检测。本发明的有益效果为：（1）本品采用聚合酶链式反应(PCR)结合荧光探针技术，检测样品中A-H型乙型肝炎病毒分型，所设计的探针和引物特异性型及灵敏度高，准确性好。（2）成本经济，操作方法快速简便，适宜广泛推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物检验技术领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

乙型病毒性肝炎是长期困扰全球医学界的难题，是急慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重要致病因子之一，也是全世界最严重的公共卫生问题之一。据WTO报告，全球60多亿人口中，有大约30亿人口生活在乙型肝炎病毒（HBV）高流行地区，超过20亿人感染过HBV，其中慢性感染者超过3.5亿。我国每年的乙肝发病率在6000万人次以上，是一个乙型病毒性肝炎发病大国。在中国、东南亚和非洲等国家和地区，有约50％的肝硬化和70－90％的肝癌，是由慢性HBV感染引起，而感染了HBV变异体的HBV携带者有7－30%。

目前根据基因序列的核苷酸差异将HBV分为A～H8种基因型别，按照全基因序列核苷酸差异≥8%或其S基因序列核苷酸差异≥4%的差异度判定为不同型别，同一基因型满足序列差异≤5.6%。HBV基因型别存在较明显的地域性分布特点，A型在欧洲和中部非洲多见；B型、C型主要分布于亚洲；D型分布区域最广，流行于地中海、中东等地区；E型以非洲为主；G型仅见于美国和欧洲；F、H型分布在美国。我国以B型和C型分布为主，为优势型，且存在南北差异，北方以C型为优势型，南方以B型为优势型；D型多分布于如新疆、西藏、宁夏等少数民族地区，偶有A、E、F型报道，尚未见G、H型。有研究表明，HBV存在不同基因型别的混合感染。

目前乙型肝炎病毒基因分型的检测方法包括基因序列测定、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）、基因型特异性多引物对PCR分型(即巢式PCR法)、特异性线性探针检测法(INNO-LiPA)INNO-LiPA、PCR微板核酸分子杂交ELISA法、单克隆抗体ELISA法以及基因芯片。但这些方法或多或少存在一些缺陷：如基因测序分型方法结果准确可靠，但过程繁琐、费时、成本高、难以推广，不适合大样本的检测，且缺乏敏感性，不能发现同一个体中两种或两种以上的HBV基因型的混合感染。PCR-RFLP对于单个核苷酸位点的多态性所导致的限制性内切酶酶切位点改变有碍内切酶消化，酶切不完全会出现复杂的条带，酶切图谱识别复杂，因而影响基因分型的可信度，且该法同样不能发现几种基因型的混合感染。巢式PCR法方法需要合成多条引物，需经两轮PCR过程，较RFLP法历时长，污染机会较大，且无法完全避免出现非特异性扩增条带而妨碍观察分型结果。INNO-LiPA存在价格昂贵、特异性稍低的不足。单克隆抗体ELISA法不能对血清HBsAg阴性的HBV感染进行基因分型，以及少数HBsAg无法分型。基因芯片存在成本较高、假阳性率高、不同芯片的集成度不足等缺点，PCR微板核酸分子杂交ELISA法适用于自动化程度高较高的实验室。

对于分子实验室中大量样本的常规检测，急需准确度高、特异性好、价格经济、快速的检测方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒及检测方法，通过设计合成特异性针对乙型肝炎病毒八种基因亚型的引物和探针，并结合PCR检测方法的技术方案，实现了快速、准确测定乙型肝炎病毒分型，测定成本降低。

本发明采用的技术方案是：乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如下至⑧中的至少一个PCR反应液体系：

①针对乙型肝炎病毒A型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-A-FACCTGGGTGGGTAATAATTTGGA

HBV-A-RGAAACCACAATAGTTGCCTGATCTT

HBV-A-PAATTGACTACTAGATCCCTG

②针对乙型肝炎病毒B型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-B-FCTCGTGGTGGACTTCTCTCAATT

HBV-B-RATCCAGCGATAACCAGGACAAAT

HBV-B-PCAAATCTCCAGTCACTCAC

③针对乙型肝炎病毒C型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-C-FGAGCCAACTCAAACAATCCAGAT

HBV-C-RGAATGCTCCCGCTCCTACCT

HBV-C-PCCCCAACAAGGATC

④针对乙型肝炎病毒D型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-D-FGGGAACTTTACTGGGCTTTATTCTT

HBV-D-RGGGCCTACAAACTGTTCACATTT

HBV-D-PCTCATTGGAAAACACC

⑤针对乙型肝炎病毒E型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-E-FAGTGAACCCTGTTCCGACTACTG

HBV-E-RGGTCCCCAATCCTCGAGAA

HBV-E-PCTCACTCATCTCGTCAAT

⑥针对乙型肝炎病毒F型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-F-FGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACC

HBV-F-RGTAATGATCCCCAACTGCCAAT

HBV-F-PATGGATACCCACAGATAA

⑦针对乙型肝炎病毒G型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-G-FTGGAAAGTCTGTCAACGAATAACTG

HBV-G-RAAGGCAGGGTAACCACATTGG

HBV-G-PTTTCGCTGCTCCTTTT

⑧针对乙型肝炎病毒H型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-H-FCCCGTGTGTCCTCTACTTCCA

HBV-H-RAAGAGTGGTGCAGGTTTTGCA

HBV-H-PATCTACAACCACCAGCACG。

优选的，所述每种探针一端标记有荧光报告基团FAM、TET、HEX、ROX、JOE、CY3、CY5、TAMRA或TexasRed，另一端标记有荧光淬灭基团MGB、BHQ-1、BHQ-2、LowaBlackRQ、LowaBlack^TMFQ或Dabcyl。

更优选的，所述针对乙型肝炎病毒A-D型基因型的PCR反应液体系组成第一反应体系，其中HBV-A-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，HBV-B-P的5'端标记HEX，3'端标记MGB，HBV-C-P的5'端标记ROX，3'端标记MGB，HBV-D-P的5'端标记CY5，3'端标记MGB；

针对乙型肝炎病毒E-H型基因型的PCR反应液体系组成第二反应体系，其中HBV-E-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，HBV-F-P的5'端标记HEX，3'端标记MGB，HBV-G-P的5'端标记ROX，3'端标记MGB，HBV-H-P的5'端标记CY5，3'端标记MGB。

所述试剂盒中还包括乙型肝炎病毒A-H型基因型的标准品。

本发明还提供乙型肝炎病毒八种基因分型的非诊断性检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）合成权利要求1所述的引物和探针；

（2）根据仪器对各探针两端分别标记权利要求2中所述的荧光报告基团和相应的荧光淬灭基团；

（3）制备阳性标准品；

（4）提取待测样品DNA；

（5）准备PCR反应体系；

（6）运行PCR；

（7）数据分析。

优选的，所述步骤（3）中阳性标准品的制备方法为构建分别包含乙型肝炎病毒A-H八种基因亚型检测靶标基因标准序列的质粒：分别合成乙型肝炎病毒A-H八种基因亚型检测靶标基因标准序列并克隆入P18-T载体中，命名为PMT-HBV-A，PMT-HBV-B，PMT-HBV-C，PMT-HBV-D，PMT-HBV-E，PMT-HBV-F，PMT-HBV-G，PMT-HBV-H。

更优选的，所述步骤（2）中探针的标记分别为：HBV-A-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，HBV-B-P的5'端标记HEX，3'端标记MGB，HBV-C-P的5'端标记ROX，3'端标记MGB，HBV-D-P的5'端标记CY5，3'端标记MGB；HBV-E-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，HBV-F-P的5'端标记HEX，3'端标记MGB，HBV-G-P的5'端标记ROX，3'端标记MGB，HBV-H-P的5'端标记CY5，3'端标记MGB；

步骤（5）中PCR反应体系分成两个，针对乙型肝炎病毒ABCD型基因型的引物和探针加入至第一反应体系，针对乙型肝炎病毒EFGH型基因型的引物和探针加入至第二反应体系。

优选的，所述步骤（6）运行PCR时荧光通道检测选择：检测选用FAM、HEX、ROX和CY5通道。

所述步骤（6）运行PCR是的反应程序为95℃2min；再按95℃15s，60℃1min，循环40次。

上述技术方案中，分别针对乙型肝炎病毒八种基因分型的引物和探针具有良好的特异性，用于荧光PCR反应，不存在互相干扰，每种探针一端标记有荧光报告基团，另一端标记有荧光淬灭基团，不同种探针的荧光报告基团不同，当被检测的样本在某种分型的引物引导下扩增后，与相应分型的探针结合，通过其探针的荧光报告基团，则可检测出样本是被哪种分型的乙型肝炎病毒感染，实际应用中，鉴于仪器、荧光素选择范围等因素，可将针对乙型肝炎病毒A-D型基因型的PCR反应液体系组成第一反应体系，针对乙型肝炎病毒E-H型基因型的PCR反应液体系组成第二反应体系。

为提高检测的准确性，试剂盒种配置了八种亚型的阳性标准品，该标准品可以是各种亚型的全序列，（其序列全长可在基因库查），也可以是包括检测靶标基因位点的一段基因序列，上述序列委托公司合成即可，所述的检测靶标基因位点即本发明筛选的各亚型的高度保守序列位点，应用时，通过PCR的方法拼接，将合成好的检测靶标基因序列克隆入P18-T载体pMD18-Tvector(Takara)中，构建分别包含乙型肝炎病毒A-H八种亚型检测靶标基因标准序列的质粒，命名为：PMT-HBV-A，PMT-HBV-B，PMT-HBV-C，PMT-HBV-D，PMT-HBV-E，PMT-HBV-F，PMT-HBV-G，PMT-HBV-H。

本发明的有益效果为：（1）本品采用聚合酶链式反应(PCR)结合荧光探针技术，检测样品中A-H型乙型肝炎病毒分型，所设计的探针和引物特异性型及灵敏度高，准确性好。（2）成本经济，操作方法快速简便，适宜广泛推广应用。

具体实施方式

下面是上述针乙型肝炎病毒八种基因分型的PCR试剂盒及利用其进行定量检测的方法的具体说明，但不以任何形式限制本发明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂、及所合成的引物和探针序列等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：针乙型肝炎病毒八种基因分型的PCR试剂盒中引物、探针序列的设计及合成

从GenBank（美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库）中搜索HBVA-H型基因型的全序列并利用BLAST序列分析进行比对，筛出高度保守区域，针对保守序列采用引物设计软件PrimerPremier5分别设计引物和对应的特异性探针，并检测是否有发夹结构或者二聚体形成，结果表明设计的探针满足特异性要求，且不会形成发夹结构或者二聚体。所设计的引物、探针序列分别为：

①针对乙型肝炎病毒A型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-A-FACCTGGGTGGGTAATAATTTGGA

HBV-A-RGAAACCACAATAGTTGCCTGATCTT

HBV-A-PAATTGACTACTAGATCCCTG

②针对乙型肝炎病毒B型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-B-FCTCGTGGTGGACTTCTCTCAATT

HBV-B-RATCCAGCGATAACCAGGACAAAT

HBV-B-PCAAATCTCCAGTCACTCAC

③针对乙型肝炎病毒C型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-C-FGAGCCAACTCAAACAATCCAGAT

HBV-C-RGAATGCTCCCGCTCCTACCT

HBV-C-PCCCCAACAAGGATC

④针对乙型肝炎病毒D型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-D-FGGGAACTTTACTGGGCTTTATTCTT

HBV-D-RGGGCCTACAAACTGTTCACATTT

HBV-D-PCTCATTGGAAAACACC

⑤针对乙型肝炎病毒E型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-E-FAGTGAACCCTGTTCCGACTACTG

HBV-E-RGGTCCCCAATCCTCGAGAA

HBV-E-PCTCACTCATCTCGTCAAT

⑥针对乙型肝炎病毒F型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-F-FGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACC

HBV-F-RGTAATGATCCCCAACTGCCAAT

HBV-F-PATGGATACCCACAGATAA

⑦针对乙型肝炎病毒G型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-G-FTGGAAAGTCTGTCAACGAATAACTG

HBV-G-RAAGGCAGGGTAACCACATTGG

HBV-G-PTTTCGCTGCTCCTTTT

⑧针对乙型肝炎病毒H型基因型的PCR反应液体系，包括如下引物和探针

HBV-H-FCCCGTGTGTCCTCTACTTCCA

HBV-H-RAAGAGTGGTGCAGGTTTTGCA

HBV-H-PATCTACAACCACCAGCACG。

上述的探针中，HBV-A-P的检测靶标基因位点位于乙型肝炎病毒A型基因型全序列的2143-2162碱基，HBV-B-P的检测靶标基因位点位于乙型肝炎病毒B型基因型全序列的320-338碱基，HBV-C-P的检测靶标基因位点位于乙型肝炎病毒C型基因型全序列的2985-3998碱基，HBV-D-P的检测靶标基因位点位于乙型肝炎病毒D型基因型全序列的2521-2536碱基，HBV-E-P的检测靶标基因位点位于乙型肝炎病毒E型基因型全序列的106-123碱基，HBV-F-P的检测靶标基因位点位于乙型肝炎病毒F型基因型全序列的931-814碱基，HBV-G-P的检测靶标基因位点位于乙型肝炎病毒G型基因型全序列的1014-1029碱基，HBV-H-P的检测靶标基因位点位于乙型肝炎病毒H型基因型全序列的490-508碱基，其对应的标准品序列在基因库可查。

具体对每种探针的荧光标记，遵循如下原则，根据仪器对荧光的分辨条件，选择荧光报告基团和对应的荧光淬灭基团。为便于使用及提高反应的特异性、准确性，可将针对乙型肝炎病毒A-D型基因型的PCR反应液体系组成第一反应体系，所述针对乙型肝炎病毒A-D型基因型的PCR反应液体系组成第一反应体系，针对乙型肝炎病毒E-H型基因型的PCR反应液体系组成第二反应体系，该设计减少了反应样本，简化了操作，提高了实验效率。

实施例2：利用上述试剂盒对阳性标准品进行检测

（1）根据基因库查询结果，委托专业公司（如上海生工，英潍捷基（上海）贸易有限公司）合成针对乙型肝炎病毒的八种基因亚型的标准序列、引物及探针序列，并作如下标记：HBV-A-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，HBV-B-P的5'端标记HEX，3'端标记MGB，HBV-C-P的5'端标记ROX，3'端标记MGB，HBV-D-P的5'端标记CY5，3'端标记MGB，HBV-E-P的5'端标记FAM，3'端标记MGB，HBV-F-P的5'端标记HEX，3'端标记MGB，HBV-G-P的5'端标记ROX，3'端标记MGB，HBV-H-P的5'端标记CY5，3'端标记MGB。

采用市售的荧光PCR试剂或试剂盒或PremixExTaq试剂盒准备PCR反应体系。分为第一反应体系和第二反应体系，第一反应体系中包括针对乙型肝炎病毒ABCD型基因型的引物和探针（带有上述荧光标记），第二反应体系中包括针对乙型肝炎病毒EFGH型基因型的引物和探针，具体的，各PCR反应体系的工作液和反应条件如下：

1）第一反应体系：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCRBuffer2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、Taq酶（5U/μL）0.07μL、HBV-A-F/R（5μM）0.3μL、HBV-A-P（5μM）1.5μL、HBV-B-F/R（5μM）0.3μL、HBV-B-P（5μM）1.5μL、HBV-C-F/R（5μM）0.3μL、HBV-C-P（5μM）1.5μL、HBV-D-F/R（5μM）0.3μL、HBV-D-P（5μM）1.5μL、A-D标准序列的DNA各2μL、补ddH₂O0.73μL至终体积为20μL。

2）第二反应体系：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCRBuffer2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、Taq酶（5U/μL）0.07μL、HBV-E-F/R（5μM）0.3μL、HBV-E-P（5μM）1.5μL、HBV-F-F/R（5μM）0.3μL、HBV-F-P（5μM）1.5μL、HBV-G-F/R（5μM）0.3μL、HBV-G-P（5μM）1.5μL、HBV-H-F/R（5μM）0.3μL、HBV-H-P（5μM）1.5μL、A-D标准序列的DNA各DNA2μL、补ddH₂O0.73μL至终体积为20μL；

（4）将上述各20μL体系分别加入至PCR管中，盖上管盖，将PCR管放入荧光定量PCR检测仪中（ABI公司的ABI7500检测仪等），运行PCR反应，反应条件：95℃2min；再按95℃15s，60℃1min，循环40次；反应体系为20μL。荧光通道检测选择：检测选用FAM、HEX、ROX和CY5通道。

（5）数据分析,

本发明提供的引物对乙型肝炎病毒八种基因分型都有很好的特异性扩增，利用标记的荧光报告基团能得到准确、稳定、平行性好的结果。

实施例3：利用上述试剂盒进行样本检测的方法

（1）根据上述设计的引物及探针的序列，委托专业公司（如上海生工，英潍捷基（上海）贸易有限公司）合成引物及探针，并标记备用；

（2）提取待测血清样品并提取其乙型肝炎病毒DNA

抽取受检者静脉血1ml，注入无菌1.5ml的离心管中，室温静置2h后，取上清转至另一无菌离心管中，即为血清样本；借助DNA提取液按照常规方法提取乙型肝炎病毒DNA；

（3）准备PCR反应体系

本实施例中对乙型肝炎病毒的八种基因亚型同时进行分型检测，采用市售的普通PCR试剂或试剂盒或PremixExTaq试剂盒。其中针对乙型肝炎病毒的PCR反应体系分两个，分别为第一反应体系和第二反应体系，第一反应体系中包括针对乙型肝炎病毒ABCD型基因型的引物和探针，第二反应体系中包括针对乙型肝炎病毒EFGH型基因型的引物和探针；所用的各反应体系中的探针都带有可被仪器区分的荧光报告基团和荧光淬灭基团，同时设置没有乙肝病毒DNA的空白对照，和A-H阳性标准品的阳性对照PCR体系。具体的，各PCR反应体系的工作液和反应条件如下：

1）第一反应体系：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCRBuffer2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、Taq酶（5U/μL）0.07μL、HBV-A-F/R（5μM）0.3μL、HBV-A-P（5μM）1.5μL、HBV-B-F/R（5μM）0.3μL、HBV-B-P（5μM）1.5μL、HBV-C-F/R（5μM）0.3μL、HBV-C-P（5μM）1.5μL、HBV-D-F/R（5μM）0.3μL、HBV-D-P（5μM）1.5μL、样本DNA2μL、补ddH₂O6.73μL至终体积为20μL。

2）第二反应体系：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCRBuffer2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、Taq酶（5U/μL）0.07μL、HBV-E-F/R（5μM）0.3μL、HBV-E-P（5μM）1.5μL、HBV-F-F/R（5μM）0.3μL、HBV-F-P（5μM）1.5μL、HBV-G-F/R（5μM）0.3μL、HBV-G-P（5μM）1.5μL、HBV-H-F/R（5μM）0.3μL、HBV-H-P（5μM）1.5μL、样本DNA2μL、补ddH₂O6.73μL至终体积为20μL；

3）空白对照PCR体系I：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCRBuffer2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、Taq酶（5U/μL）0.07μL、HBV-A-F/R（5μM）0.3μL、HBV-A-P（5μM）1.5μL、HBV-B-F/R（5μM）0.3μL、HBV-B-P（5μM）1.5μL、HBV-C-F/R（5μM）0.3μL、HBV-C-P（5μM）1.5μL、HBV-D-F/R（5μM）0.3μL、HBV-D-P（5μM）1.5μL、蒸馏水2μL、补ddH₂O6.73μL至终体积为20μL；

空白对照PCR体系Ⅱ：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCRBuffer2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、Taq酶（5U/μL）0.07μL、HBV-E-F/R（5μM）0.3μL、HBV-E-P（5μM）1.5μL、HBV-F-F/R（5μM）0.3μL、HBV-F-P（5μM）1.5μL、HBV-G-F/R（5μM）0.3μL、HBV-G-P（5μM）1.5μL、HBV-H-F/R（5μM）0.3μL、HBV-H-P（5μM）1.5μL、蒸馏水2μL、补ddH₂O6.73μL至终体积为20μL；

4）阳性对照PCR体系参见实施例2中的第一反应体系和第二反应体系；

（4）将上述各20μL体系分别加入至PCR管中，盖上管盖，将PCR管放入荧光定量PCR检测仪中（如ABI公司的ABI7500检测仪等），运行PCR反应，反应条件：95℃2min；再按95℃15s，60℃1min，循环40次；荧光通道检测选择：检测选用FAM、HEX、ROX和CY5通道。

（5）数据分析,

综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，空白对照组委隐形，各型阳性对照组均为阳性，待测样本根据所属体系及检测到的荧光信号确认对应亚型是否有扩增，从而得出为哪种亚型的乙型肝炎病毒感染或混合型感染。

SEQUENCELISTING

<110>河北国际旅行卫生保健中心

<120>乙型肝炎病毒八种基因分型的荧光PCR试剂盒及检测方法

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<400>21

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<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

cccgtgtgtcctctacttcca21

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

aagagtggtgcaggttttgca21

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

atctacaaccaccagcacg19