拟南芥AtGDSL基因在油菜抗菌核病及促进种子萌发中的应用

摘要

本发明公开了一种控制甘蓝型油菜抗菌核病和促进油菜种子萌发的基因及其应用，具体涉及一种增强植物对核盘菌生物胁迫抗性和促进油菜种子萌发的AtGDSL基因，同时还对AtGDSL基因在增强植物对核盘菌抗性和促进油菜种子萌发中的功能进行了验证和应用验证；本发明通过基因工程技术手段，将外源拟南芥AtGDSL基因导入油菜植株，使其在甘蓝型油菜中过量表达外源拟南芥AtGDSL基因后，油菜植株的抗菌核病能力显著提高，而且种子萌发能力显著增强；本发明的AtGDSL基因对抗核盘菌有明显效果，可应用在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性，而增强种子的萌发速度，则可为油菜大规模机械化生产提供优良育种材料。

说明书

技术领域

本发明涉及拟南芥AtGDSL基因在油菜抗菌核病及促进种子萌发中的应用，属于植物基因工程和生物技术领域。

背景技术

油菜(Brassica napus)是我国第一大油料作物, 我国油菜年种植面积700万公顷（1亿亩），占全世界的1/3，居世界首位，其所产菜籽油占我国整个食用植物油供应的40％（沈金雄等，2007）。此外，菜籽油也用于生产生物柴油，是解决全球能源短缺的重要原料作物。因此油菜不仅是食用油的主要来源，也是重要能源作物，具有十分重要的战略地位。然而由于我国耕地面积有限，短时期内无法通过增加种植面积提高油菜总产量，我国的菜籽生产量目前仅能满足国内2/3的消费需求，大量依赖进口。在当前和今后相当长的时间内，我国都将面临食用油和化石能源短缺的严峻局面。所以提高油菜的抗菌核病和产量是我们目前急需解决的问题，除了传统育种方法之外，随着生物技术的发展，越来越多的人们把目光投向通过遗传改良的方法获得性状优良的油菜品种。

油菜的生长受到众多环境因素的影响，病原菌以及一些不利的非生物胁迫（包括干旱、重金属、盐害、低温、高温等）都会对其产量造成极大损失，因此，利用基因工程技术，将一些抗逆相关基因转入到油菜品种中，培育既高产又抗逆的优质新品种是应对食物，能源资源短缺有效途径之一。为深入发掘并研究油菜抗逆相关基因，提供理论依据和基因资源。

油菜菌核病（Sclerotinia sclerotiorum （Lib.）de Bary）是限制我国油菜生产的主要因子之一。在长江中下游及东南沿海油菜主产区，油菜菌核病的发生率很高，产量损失高达50%以上；全国发生面积在7000万亩以上，产量损失高达30%，严重时达到50-80%。目前油菜菌核病的防治方法主要是化学防治技术和抗病品种的选育，但化学防治存在防效不高、病原难以根除、花期喷药困难以及农药残留、环境污染等诸多问题；常规育种因难以找到有效的抗性材料以及速度非常缓慢等缺点，也很难有效解决抗病问题。由此，对抗菌核病油菜品种进行分子改良，快速培育抗菌核病品种，是提高菜籽单位面积产量的重要策略。油菜种子比较小，播种后如果土壤条件和气候条件不合适时，如果种子的萌发不强的话，很难得到全苗。特别是利用机械化直播时，种子萌发力强，对后期的出苗尤为重要。所以选育适合全程机械化作业的油菜品种，萌发力强成为一个重要指标。

GDSL 脂肪酶家族是一个脂肪酶的重要超家族，植物GDSL脂肪酶的功能研究主要涉及到参与生长发育、形态建成、油脂代谢和抗菌核病等生理方面(Oh等2005; 凌华2006; Zhang等2006; Kim等2008; Updegraff等2009; Agee等2010)。辣椒的CaGLIP1基因在拟南芥和大肠杆菌中过量表达发现它具有水解酶活性，而且可以抑制假单胞菌和活体寄生真菌的生长（Jeum>CaGL1可以通过调节基因CaPR-4的表达而抵抗损伤（Ki-Jeong>GLIP1基因可以通过调节水杨酸途径从而抑制黑斑病菌生长；拟南芥GLIP2基因能在SA、JA和ET的信号的诱导下表达，并在生长素的负调控下抵抗胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia>AtLTL1)在盐诱导下过表达能增强植物的耐盐性,>

但对于拟南芥AtGDSL的作用，目前相关的文献及专利报道甚少。在本研究中我们发现，将外源AtGDSL基因导入油菜后所得到的转基因植株植株对菌核病抗性显著增强，种子的萌发力也加强，这一结果对于增强油菜菌核病抗性及获得适合机械化大规模生产研究具有重要应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对油菜育种中缺乏株抗病及种子萌发快的基因资源，提供一种新的抗病及促萌发基因AtGDSL的用途，为提高油菜抵御菌核病和促进种子萌发基因工程技术领域提供一种新的有效选择。本发明的目的是提供利用外源拟南芥基因AtGDSL的导入，来培育抗菌核病能力强、萌发快的油菜新材料。

一种外源AtGDSL基因及其同源基因在油菜抗菌核病中的应用，所述AtGDSL基因的核苷酸序列如SEQ>AtGDSL基因的同源基因核苷酸序列为与SEQ>

一种AtGDSL基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ>

本发明还提供一种包含所述AtGDSL基因的重组载体，其特征在于，构建所述重组载体所选用的载体为可以引导外源基因在植物中表达的载体，本发明还公开了带有AtGDSL基因的重组载体pCAMBIA1300>

本发明还提供一种包含所述AtGDSL基因的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主为植物，所述植物为油菜。本发明还包括含有AtGDSL基因的重组载体pCAMBIA1300-35S-AtGDSL-NOS转基因细胞系和宿主菌，以及油菜种子。

本发明另外还提供一种包含所述AtGDSL基因在提高油菜抗菌核病及促进种子萌发中的应用。

实现本发明的技术如下：

为了获得本发明的内容，对AtGDSL基因进行了深入和全面的研究，结果发现该基因的过量表达显著增强油菜对腐生营养型真菌核盘菌的抗性，此外，AtGDSL基因的过量表达可提高油菜种子萌发速率，表明该基因在油菜育种等方面具重要应用前景。

根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供植物核盘菌响应及促进种子萌发基因来实现，所述基因含有SEQ ID NO.1核苷酸序列或与SEQ ID NO.1实质上同源的核苷酸序列。

根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供植物核盘菌响应及促进萌发蛋白来实现，所述的蛋白含有SEQ ID NO.2核苷酸序列或与SEQ ID NO.2实质上同源的氨基酸序列。

根据本发明的另一个方面，上述目的通过提供含有AtGDSL基因超表达重组载体pCAMBIA1300-35S-AtGDSL1-NOS（本发明构建，请见实施例1）来实现对油菜植物抗菌核病控制。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体pCAMBIA1300-35S-AtGDSL-NOS转化的微生物（根癌农杆菌GV3101，购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同）来实现。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物(包含有pCAMBIA1300-35S-AtGDSL-NOS重组载体的根癌农杆菌GV3101转化获得抗性转基因植株。

本发明的优点：

1．本发明中所采用的农杆菌介导的体外浸蘸渗透法转化油菜，速度快、成本低、操作简单。

2．本发明构建的pCAMBIA1300-35S-AtGDSL-NOS载体转化油菜后所获得的AtGDSL过量表达株系，为AtGDSL的抗病功能研究提供了原材料，也可作为新的抗病育种材料，为作物抗病育种提供了新的基因源，将有助于培育更优产高质的新品种，有很好的应用前景。

3．抗菌核病遗传研究对指导育种实践、品种改良及品种推广均具有重要意义，因此发掘和鉴定作物抗菌核病基因，并深入探讨抗菌核病基因的分子作用机理，具有重要的理论意义和应用价值。AtGDSL转基因油菜植株显著提高菌核病抗性，这对油菜的生产育种等具有重要指导借鉴意义。

4．本发明所构建的AtGDSL过表达植株可提高种子萌发速度，这为选育适合全程机械化播种的油菜提供了新品种。

附图说明

图1.AtGDSL基因与其它物种同源氨基酸序列比对结果。

其中各物种的缩写为：Bn（Brassica>）：甘蓝型油菜；At（ Arabidopsis>）：拟南芥；Ca （Capsicum）：辣椒；黑色区域显示的为相同的氨基酸，灰色区域显示的为类似的氨基酸。

图2.植物转化重组表达载体1300-35S-AtGDSL-NOS构建示意图。

图3.植物转化载体1300-35S-AtGDSL-NOS的T-DNA插入区结构示意图。

图4.油菜AtGDSL的过表达株系PCR鉴定；图中，1为DNA标准Marker2000;>

图5.Q-PCR检测过表达株系中AtGDSL的表达量结果；其中，NY12为非转基因野生型对照；#12、#18、#35均为独立的AtGDSL过表达转基因株系。

图6.AtGDSL过表达株系与野生型株系接种核盘菌36h后离体叶片；其中，NY12为非转基因野生型对照；#12、#18、#35均为独立的AtGDSL过表达转基因株系。

图7.AtGDSL过表达株系对菌核病抗性病斑面积检测，其中，NY12为非转基因野生型对照；#12、#18、#35均为独立的AtGDSL过表达转基因株系。

图8.AtGDSL过表达株系与野生型NY12株系萌发2天后的种子；其中NY12为非转基因野生型对照；#18为独立的AtGDSL过表达转基因株系。

图9..AtGDSL过表达株系与野生型株系种子萌发2天脂肪酸分解代谢相关基因表达量；其中NY12为非转基因野生型对照；#18为独立的AtGDSL过表达转基因株系。

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。

实施例1：AtGDSL基因的获得

1.幼苗培养

以野生型拟南芥作为实验材料，生长条件为：温度为20 ± 2°C；湿度为60-90%；每天光周期为光照8 h黑暗16 h；光照强度为44 μmol m^–2>–1。

>提取与cDNA第一链合成

RNA的提取：采用UNIQ- 10柱式Trizol试剂盒（购于上海英俊生物技术有限公司），取少量样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1mL TRNzol-A试剂（天根生化科技有限公司）的2mL EP管中，充分振荡后，4°C，12000rpm离心10min；之后取上清约800μL，加氯仿300µL(预冷利于分离)，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液约300µLZCX移至新的2mLEP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，4℃，12000rpm离心10min；弃去上清，加800µL 75%乙醇溶解，4℃，12000rpm离心5min；弃上清，加20μL灭菌的DEPC水溶解沉淀。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

按MMLV反转录酶试剂盒（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）的操作说明进行。

表1. 反转录程序

（1）按以下体系混匀各组分：2 μg总RNA、用DEPC处理H₂O补充至10>

（2）70℃反应10 min，然后在冰上放置至少5 min后加入预先混匀的10 μL试剂：

（3）混匀后42℃反应100 min。

（4）70℃再反应 15 min，结束反应后在冰上冷却。-20℃保存备用。

>基因序列分析

根据GenBank中拟南芥AtGDSL基因序列（NM102707）,在该基因CDS（Coding>

上游引物AtGDSL-F(5’-ATGGAGAGTTACTTAACGAAATGGTG-3’)(SEQ ID NO.3)，

下游引物AtGDSL-R(5’-TCAAAGCTGTGCCAGCCTTGAAATATC-3’）(SEQ ID NO.4)，

以拟南芥cDNA为模板，利用LA-Taq酶 (TaKaRa Biotechnology Co.)进行PCR，按照下列反应条件：94℃5min ，然后30 cycles （94℃50s, 59℃ 50s, 72℃ 1 min 30s ），72℃ 10min。，扩增出AtGDSL基因的全长编码序列。然后，参照UNIQ->AtGDSL克隆进pMD18-T载体（宝生物工程>

如图1所示，AtGDSL与其它物种同源氨基酸序列比对后，发现其具有极高的相似性，并且都具有GDSL脂肪酶家族特有保守结构域GDSL-motif（蓝色框区域内），此外，它们都还具有一个a ATP/GTP-binding site (P-loop)，而大多数抗病相关基因如PR1等都具有此结构。AtGDSL的这些结构特点，也为本发明的研究其抗菌核病提供了理论信息。

实施例2:>构建过表达AtGDSL转基因油菜植株

1.AtGDSL过表达载体构建

在载体pCAMBIA1300（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）的上游EcoRI/KpnI酶切位点处加入CaMV 35S强启动子，其下游BamHI/HindIII酶切位点处加上CaMV Nos终止子，将其改造成重组载体pCAMBIA1300-35S-Nos。具体过程如下：

具体过程如下：根据NCBI上公布的CaMV 35S序列（Gene ID:AJ007626）使用Primer Premier 5.0软件设计引物：上游引物：5′-GAATTCTTAATTAAGAGCTCGCATGCC-3′(SEQ>GGTACCGTCCCCGTGTTCTCTCCAA-3′(SEQ>GGATCCGAATTTCCCCGATCGTTCAA′-3′(SEQ>BamHI酶切位点（下划线部分），下游引物：5′-AAGCTTGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3′(SEQ>HindIII酶切位点（下划线部分），用PCR从pEGAD载体中扩增得到CaMV>BamHI/HindIII酶切位点，将其改造成重组载体pCAMBIA1300-35S-Nos。所用内切酶EcoRI、KpnI、BamHI及HindIII均购于宝生物工程>AtGDSL全长序列。扩增所用引物序列分别为：上游引物AtGDSL-F(5’-GGTACCATGGAGAGTTACTTAACGAAAT-3’)(SEQ>GGATCCTCAAAGCTGTGCCAGCCTTGA-3’）(SEQ>BamHI酶切位点（下划线部分），扩增出目的基因AtGDSL全长序列。

然后将目的基因AtGDSL克隆进pMD18-T载体（宝生物工程>

>重组质粒 pCAMBIA1300-35S-AtGDSL-Nos>的油菜遗传转化

（1）农杆菌GV3101感受态细胞制备好后，将重组质粒 pCAMBIA1300-35S-AtGDSL-Nos与之进行连接转化，转化后的农杆菌进行菌落PCR鉴定，挑取阳性克隆单菌落接种到3-5 mL含有相应抗生素的LB培养基中培养，于28℃培养过夜，再按1%接种量接种到100mL含有相应抗生素的LB液体培养基中大量培养至农杆菌培养液终浓度为OD600约为2.0左右。然后在培养基内加入转化缓冲液0.1%Silwet-77、2 ng/L6-BA、8 mg/L乙酰丁香酮，制备成农杆菌悬液，以备浸花所用。

（2）选择野生型植株宁油12（NY12）（购于江苏省农科院油菜品系）浸花，在浸花的前一天去掉已经授粉的角果和花朵，剪掉已经开的花絮，浸花时，把油菜的整个花序部分浸泡在农杆菌溶液中3-5 min，同时轻轻搅动，浸泡过的植株套入报纸纸袋，用回形针或大头针扎口固定，使花蕾具有较高的湿度，保持1-2天，不要在过量的阳光中暴晒，防止农杆菌失去活性。

（3）重复步骤（2），并把整个花序部分套在报纸纸袋中1-2天。

（4）两次浸花结束后，去掉花序上的报纸纸袋，剪去新生出的侧枝花序以及经过浸花的花序顶端新萌发的花蕾。

（5）植株于自然条件下生长，定时剪除新生的侧枝花序以及新生花蕾，直到种子成熟时停止灌溉，收获干种子于网袋中放置，置于通风干燥的地方保存。

>过表达AtGDSL转基因油菜植株PCR鉴定

步骤2中收获的种子出苗以后先用25mg/L的潮霉素筛选，选取抗潮霉素的植株，选取60株分别进行编号为#1—#60，分别提取基因组，用PCR进一步鉴定验证。

过表达AtGDSL转基因油菜植株PCR鉴定所用的引物为（根据AtGDSL基因的保守序列设计引物）：

上游引物5’-CTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’(SEQ ID NO.11);

下游引物 5’-TCCTAACTTGCCCGCTAAAA-3’(SEQ ID NO.12)。

对照为非转基因野生型植株NY12。程序为：94℃ 10min,94℃ 50s,58℃ 50s,72℃ 40s,72℃ 10min,检测结果表明（图4），阳性对照（本实施例中阳性对照为质粒pCAMBIA1300-35S-AtGDSL-NOS）和#12，#18，#35这3个转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带（475bp），而阴性对照（野生型NY12）则没有电泳条带，表明转基因油菜基因组中已经含有目的基因片段。

>过表达AtGDSL转基因油菜植株的qPCR鉴定

为了确定AtGDSL在油菜中是否过量表达，本发明采用荧光定量RT-PCR方法进一步分析了转基因植株中AtGDSL表达量。荧光定量PCR使用SYBR®>

采用B.>（Gene ID:AT4G34270）作为内参基因，AtGDSL基因的引物为

AtGDSL-RTF、AtGDSL-RTR（该引物根据AtGDSL基因的保守序列设计）。荧光定量反应体系为20 µL，先除模板外在1.5 mL EP管中配制好反应液（如下表2），再分装到PCR Strip Tubes中。各个样品的cDNA稀释10倍并吸打混匀后依次在每个反应液中加入2 μL，每个样品三个重复，同时设置不加模板的阴性对照。

表2. qPCR反应程序

扩增条件为：95℃，30sec；然后95℃ 5s，60℃ 30 s，72℃ 27s，40个循环；每个循环于72℃复性末端进行荧光检测。反应结束后先加热到95℃，然后降至72℃，再缓慢升温至95℃，记录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。每组实验均完成三个生物学重复，每个生物学重复至少做三次技术重复，检测AtGDSL在油菜中基因相对表达量。

首先以熔解曲线为标准，利用仪器所带软件，优化内标基因和目的基因PCR反应条件，使之扩增产物特异。本实验以油菜B.>为内参基因，分别测定B.>和目的基因AtGDSL的Ct值，取其平均值，用比较Ct法得到目的基因对内参基因的DCt，然后以水处理的叶片为参照（即将其值转换成1）分别获得其它处理的DDCt，最后通过2^-DDCt估算目的基因的相对表达值，并且求出系统误差。

表3.B.>基因和AtGDSL基因的引物序列表

如图5所示，三个株系#12、#18、#35的AtGDSL表达水平显著高于野生型NY12对照，这表明#12、#18、#35株系为三个独立的AtGDSL过表达转基因株系。

实施例3：过表达AtGDSL油菜植株对核盘菌侵染响应

采用PDA培养基培养核盘菌菌核。PDA培养基(1L)配方：马铃薯 200g，蔗糖 10-20g，琼脂粉 17-20g，双蒸水1000g；将去皮马铃薯切成小块，加水800mL，煮沸0.5h，用纱布滤去残渣，加水补足1000mL，然后加入糖和琼脂，加热使琼脂完全融化，趁热分装，高压灭菌后备用。

取上述PCR检测为阳性的四叶一心期的转AtGDSL阳性植株的第四片真叶进行离体接种。叶片剪下置于白瓷盘中，每个转基因植株叶片与非转基因对照并排置于一个盘中，叶片下铺一层湿纱布，取新鲜制备的φ5mm菌丝块，有菌丝的面朝下，接种于叶片中部稍稍偏离主脉的位置，每叶接种一个菌丝块。用透气膜蒙上盘口利于保湿，然后置22℃黑暗培养。分别在接种后0、12、24、36>

如图6和图7所示，离体叶片接种鉴定结果显示转基因植株明显增强菌核病抗性（三个过表达株系#12、#18、#35，每个株系3个重复，结果相同，未显示）。核盘菌病斑在AtGDSL过表达转基因株系中的生长面积要比野生型NY12中小很多，损伤组织的面积也要小。根据核盘菌的生长面积可以发现，软腐坏死发生在核盘菌接种24>

实施例4：过表达AtGDSL油菜植株促进种子萌发作用

从收获的T1代种子（实施例2步骤2中得到的）中挑选饱满粒大的过表达AtGDSL油菜植株#18株系和非转基因的野生型NY12油菜种子，在70%酒精中浸泡3分钟，蒸馏水冲洗3次，之后5%>AtGDSL油菜种子萌发速度明显高于非转基因野生型油菜植株（如图8）。进一步通过qPCR方法测定了种子萌发相关基因（主要包括脂肪酸β氧化代谢途径相关基因KAT、MFP以及乙醛酸循环相关基因ICL）相关表达量（如图9）。由此发现AtGDSL基因通过参与脂肪酸β氧化分解或者乙醛酸循环过程，从而促进油菜种子萌发速度。

表4. 种子萌发相关基因qPCR鉴定引物

SEQUENCE LISTING

<110>江苏大学

<120>拟南芥AtGDSL基因在油菜抗菌核病及促进种子萌发中的应用

<130>拟南芥AtGDSL基因在油菜抗菌核病及促进种子萌发中的应用

<160>22

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1326

<212>DNA

<213>Brassica napus

<400>1

cttcacattc actcatatca ctacactttc cattaattac caatatattt ttactactta 60

aaaaagatat tggtcttgaa atggagagtt acttaacgaa atggtgtgta gtgcttgtgt120

tgttgtgttt cgggtttagt gtagtaaaag cacaagcaca agctcaagtt ccatgtttct180

ttgtttttgg tgactctttg gttgacaatg gaaacaacaa cggtcttatt tctattgcaa240

gatccaatta cttcccttac ggtatcgatt tcggcggccc taccggccgt ttctccaacg300

gcaagactac tgttgatgtg atcgctgagc tacttggatt taatggctac attcctgcgt360

acaatactgt gagtggtcgg caaatactct ccggagttaa ctacgcttcc gcagctgctg420

gaatccgaga agaaaccggt cgacaattgg gacaaaggat aagctttagt ggacaagtta480

ggaactacca gaccacagta tcgcaagttg tgcagcttct aggagacgag actcgtgcag540

ctgattacct caagagatgt atttactctg ttggtttagg aagcaacgac tatctcaaca600

actacttcat gcctacgttt tactcttcta gcagacaatt cacacccgaa caatacgcta660

acgatctcat cagtcgctac agcacccagc tcaatgcatt atacaactat ggggctcgaa720

agtttgcatt gagtggaatt ggagcagttg gttgtagtcc taacgcgctc gcaggcagtc780

ccgacggtag gacttgcgta gaccgcatca actcagcaaa ccagatcttc aacaacaagc840

taagatctct tgttgatcag ctcaacaaca atcaccctga tgcaaagttc atctacatca900

atgcttatgg cattttccag gacatgatca caaatcctgc cagatttggg tttagagtga960

cgaacgcggg atgttgcggt attgggagga atgctggaca gatcacatgt ttaccgggac 1020

agagaccgtg tagagaccgc aatgcgtacg tgttctggga cgcatttcac cctactgaag 1080

ccgcaaatgt gatcatcgca aggagatcgt acaatgcaca atcggcttca gacgcttacc 1140

ctatggatat ttcaaggctg gcacagcttt gaagaaacat agtaaaataa gaactaaaga 1200

agttccacaa accaatgtgt gatcttgttg tgtaccgtac cgctatttaa gattttcttg 1260

acgtaattga aatcgagtaa aacattattc tatatacatt cgatttctat atcaacttca 1320

tcactc1326

<210>2

<211>363

<212>PRT

<213>Brassia napus

<400>2

Met Glu Ser Tyr Leu Thr Lys Trp Cys Val Val Leu Val Leu Leu Cys

1 5 1015

Phe Gly Phe Ser Val Val Lys Ala Gln Ala Gln Ala Gln Val Pro Cys

202530

Phe Phe Val Phe Gly Asp Ser Leu Val Asp Asn Gly Asn Asn Asn Gly

354045

Leu Ile Ser Ile Ala Lys Ser Asn Tyr Phe Pro Tyr Gly Ile Asp Phe

505560

Gly Gly Pro Thr Gly Arg Phe Ser Asn Gly Lys Thr Thr Val Asp Val

65707580

Ile Ala Glu Leu Leu Gly Phe Asn Gly Tyr Ile Pro Ala Tyr Asn Thr

859095

Val Ser Gly Arg Gln Ile Leu Ser Gly Val Asn Tyr Ala Ser Ala Ala

100 105 110

Ala Gly Ile Arg Glu Glu Thr Gly Arg Gln Leu Gly Gln Arg Ile Ser

115 120 125

Phe Ser Gly Gln Val Arg Asn Tyr Gln Thr Thr Val Ser Gln Val Val

130 135 140

Gln Leu Leu Gly Asp Glu Thr Arg Ala Ala Asp Tyr Leu Lys Arg Cys

145 150 155 160

Ile Tyr Ser Val Gly Leu Gly Ser Asn Asp Tyr Leu Asn Asn Tyr Phe

165 170 175

Met Pro Thr Phe Tyr Ser Ser Ser Arg Gln Phe Thr Pro Glu Gln Tyr

180 185 190

Ala Asn Asp Leu Ile Ser Arg Tyr Ser Thr Gln Leu Asn Ala Leu Tyr

195 200 205

Asn Tyr Gly Ala Arg Lys Phe Ala Leu Ser Gly Ile Gly Ala Val Gly

210 215 220

Cys Ser Pro Asn Ala Leu Ala Gly Ser Pro Asp Gly Arg Thr Cys Val

225 230 235 240

Asp Arg Ile Asn Ser Ala Asn Gln Ile Phe Asn Asn Lys Leu Arg Ser

245 250 255

Leu Val Asp Gln Leu Asn Asn Asn His Pro Asp Ala Lys Phe Ile Tyr

260 265 270

Ile Asn Ala Tyr Gly Ile Phe Gln Asp Met Ile Thr Asn Pro Ala Arg

275 280 285

Phe Gly Phe Arg Val Thr Asn Ala Gly Cys Cys Gly Ile Gly Arg Asn

290 295 300

Ala Gly Gln Ile Thr Cys Leu Pro Gly Gln Arg Pro Cys Arg Asp Arg

305 310 315 320

Asn Ala Tyr Val Phe Trp Asp Ala Phe His Pro Thr Glu Ala Ala Asn

325 330 335

Val Ile Ile Ala Arg Arg Ser Tyr Asn Ala Gln Ser Ala Ser Asp Ala

340 345 350

Tyr Pro Met Asp Ile Ser Arg Leu Ala Gln Leu

355 360

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atggagagtt acttaacgaa atggtg26

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcaaagctgt gccagccttg aaatatc 27

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gaattcttaa ttaagagctc gcatgcc 27

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggtaccgtcc ccgtgttctc tccaa 25

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ggatccgaat ttccccgatc gttcaa26

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

aagcttgatc tagtaacata gatgacaccg c31

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ggtaccatgg agagttactt aacgaaat28

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ggatcctcaa agctgtgcca gccttga 27

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cttcgcaaga cccttcctc19

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

tcctaacttg cccgctaaaa 20

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tgaagagcag attgatttgg ct22

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

acactccatt gtcagccagt t 21

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

gaccgcatca actcagcaa19

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

cctcccaata ccgcaacat19

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

tgctgcgtat cagaggacc19

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

gcccaaacag taccgacaa19

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

ttgccttggg aggagggtta g 21

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

caagacgtgg aagacgctgt 20

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

gatgacagaa aacagaggga gg22

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

tgggcttcaa gtagtccaca aa22

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