通过调控GDSL转录水平提高甘蓝型油菜抗菌核病、种子萌发速度和含油量

摘要

在我国甘蓝型油菜（Brassica napus）是一种重要的油料作物，更是食用油的主要来源，在食品、化工、能源等诸多领域中都有广泛的应用。由于油菜含有较多对人体有益的不饱和脂肪酸以及高蛋白等优点，近年来在食品保健领域的研发越来越受欢迎。然而，有许多限制因素影响油菜产量的提高，其中外源性因素菌核病（Sclertinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）是油菜生产中最主要的一种限制因子，严重威胁着我国的油菜产量。除了外源病虫害之外，油菜本身内源性因素，如种子籽粒饱满度、萌发速度、含油量等也严重影响油菜产量的提高。提高油菜产量对于解决我国人口众多，土地面积有限，具有重要意义。GDSL脂肪酶作为一个重要的脂肪酶超家族，有研究报告显示 GDSL脂肪酶在植物的逆境胁迫、种子萌发、幼苗建成和生理代谢等多方面发挥功能。
　　本文主要初步研究了外源拟南芥 AtGDSL1和油菜内源性 BnGDSL1两个GDSL脂肪酶/酯酶基因在油菜中的生物学功能。通过生物信息学分析发现AtGDSL1和BnGDSL1蛋白都属于SGNH脂肪酶和酯酶超家族，两者的氨基酸序列相似性更是达到了85.99％，暗示它们可能具有相似的功能作用。进一步的研究发现两者在抵抗菌核病、提高种子萌发速率和含油量方面发挥着重要的作用。生物信息学分析还发现AtGDSL1和BnGDSL1均含有一段跨膜结构域，都属于亲水性蛋白，在N端有一段含有25个氨基酸序列的信号肽，可能分泌到细胞外。
　　BnGDSL1具有脂肪酶活性已由本实验室闫素贞论文中证实过。为了验证AtGDSL1是否具有脂肪酶活性，我们构建了原核表达重组载体AtGDSL1-pGEX-4T-1，在大肠杆菌中诱导表达后，对分离纯化得到的重组蛋白进行脂肪酶活性测定，结果发现AtGDSL1能够水解脂肪底物，1mg AtGDSL1重组蛋白催化底物反应最多可积累7.2 mM产物，说明AtGDSL1确实是一个脂肪酶。
　　实验中我们构建了AtGDSL1和BnGDSL1过量表达以及BnGDSL1抑制表达油菜植株来研究AtGDSL1和BnGDSL1在油菜中的生物学功能。首先，通过转基因植株离体叶片核盘菌接种实验，发现 AtGDSL1在油菜中过表达后可显著增强油菜抗菌核病，BnGDSL1则对核盘菌没有显著效果。其次，我们发现AtGDSL1和BnGDSL1过量表达后，种子萌发速度显著提高，而BnGDSL1抑制表达植株种子萌发速度受到严重抑制。最后，通过近红外光谱分析含油量，发现相比于野生型油菜种子，BnGDSL1抑制表达植株种子的含油量则提高。
　　本研究表明，通过调控 GDSL转录水平可以提高甘蓝型油菜抗菌核病、种子萌发速度和含油量。本研究的开展有助于了解油菜抗菌核病的分子机理，为选育抗菌核病油菜品种提供基因资源。此外，种子萌发率和含油量的提高在油菜生产中具有重要意义。

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缩写与符号

第一章 绪 论

1.1 油菜在我国农业生产中的地位

1.2 影响油菜生产的重要限制因素

1.3 植物GDSL脂肪酶研究进展

1.4研究目的和意义

1.5研究内容和技术路线

第二章 AtGDSL1和BnGDSL1序列生物信息学比较分析

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论与小结

第三章 AtGDSL1脂肪酶功能验证

3.1 材料与试剂

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论与小结

第四章 AtGDSL1烟草中亚细胞定位分析

4.1 材料和试剂

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论和小结

第五章 BnGDSL1在甘蓝型油菜中的诱导表达

5.1 材料和试剂

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论与小结

第六章 GDSL转基因植株构建以及抗菌核病分析

6.1 材料与试剂

6.2 方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论与小结

第七章 过表达BnGDSL1和AtGDSL1提高种子萌发速度

7.1 材料与试剂

7.2 方法

7.3 结果

7.4 讨论

第八章 抑制BnGDSL1表达提高种子含油量

8.1 材料和试剂

8.2 方法

8.3 结果

8.4 讨论

第九章 总结与展望

9.1 工作总结

9.2 展望

参考文献

致谢

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