一种水稻基因启动子、表达盒、表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种水稻基因启动子、表达盒、表达载体及应用。所述水稻基因启动子序列如SEQ？ID？NO.1所示，命名为pOsMTG3启动子。pOsMTG3启动子主要在水稻根、茎、穗中优势表达，而在叶片中不表达。由于pOsMTG3启动子未检测到在水稻叶片中的表达，可用于特殊水稻品种的研发，而不影响光合作用等叶片的重要功能。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻基因启动子、表达盒、表达载体及其应用。

背景技术

启动子是位于结构基因转录起始位点上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。目前应用于植物研究中的启动子,按其作用方式及功能可分为3类,即组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。

组成型启动子可以在植物的各种组织中启动基因表达。目前在植物中应用最广的是组成型动子，如CaMV35S启动子等。然而，外源基因的持续高效表达，产生的大量异源蛋白质或其他代谢产物在植物体内累积，不仅造成物质与能量的浪费，而且还打破了植物本身的代谢平衡，影响植物的正常生长发育过程，甚至于一些产物对植物有毒而导致其死亡。为了使外源基因更加有效地发挥作用，减少对植物的不利影响，组织特异性启动子的研究越来越受到人们的重视。

组织特异性启动子仅在特定的组织及一定的发育时期才可以启动基因的表达。近年来，植物组织特异性启动子已被大量研究，并且在农作物的分子遗传改良领域得到了广泛的应用。Sindhu等利用Gt1基因启动子将菜豆球蛋白基因特异表达于水稻种子的胚乳中，获得了高蛋白质含量的水稻种子。Borisjuk等利用根特异启动子mas2'，使目的基因只在烟草的根细胞中表达。Kasuga等利用rd29A启动子驱动来自拟南芥的转录因子DREB1A或CBF1，在转基因拟南芥中表达，有效地提高了转基因植株的抗寒性，而且对植物的生长影响甚微。Bell-Lelong等发现C4H启动子能够诱导木质素在拟南芥的茎中特异性表达，从而避免了木质素对其他组织的伤害。以上特异性启动子驱动外源目的基因在植物中定位表达，不仅减轻了对植株的不利影响，而且还能提高目的产物在特定部位的表达量，增强转基因的效果。

随着转基因育种技术的快速发展，人们对启动子的要求也不断变化。目前越来越多的研究倾向于特异性表达的启动子，在满足各种不同研究需求的同时，尽可能避免物质和能量的浪费，减少外源基因在非目的组织中过度表达所造成的损失。水稻rbcS基因启动子受光诱导调控，使外源基因在绿色组织中特异表达，且在叶片中表达量较高。水稻AL1基因启动子能够调控外源基因在胚乳表层中的传递细胞层区域的表达，从而改善种子从母体的营养吸收以及防御病原入侵。Orys1基因的启动子则能够诱导外源基因在水稻的花粉中特异性表达。

发明内容

在水稻基因组芯片分析的基础上，本课题组筛选到1个在水稻中组织特异性表达的基因OsMTG3(GENBANK号码AK121385)。通过生物信息学分析,该基因上游1.8kb的DNA片段为候选启动子区域，将其命名为pOsMTG3。通过克隆、测序鉴定后，将其连接到表达载体PC31P1中，得到与GUS基因融合表达的表达载体PC31P1p3。通过农杆菌介导法将构建的pOsMTG3启动子表达载体转化水稻，对转基因株系进行GUS组织化学染色分析，验证启动子的表达特异性，为其进一步应用于水稻分子改良育种提供重要的数据参考。即，本发明提供了一种水稻基因启动子、表达盒、表达载体及应用。

本发明通过如下技术手段达到上述目的：

所述水稻基因启动子序列如SEQIDNO.1所示，命名为pOsMTG3启动子。所述启动子用于在水稻的茎、穗、根和芽中表达目的基因。

用于扩增上述启动子的引物对包括：

引物pOsMTG3-F：5’-TCTAGACTCTACGTGTTCGAGCAATGCC-3’(SEQIDNO.3)；

引物pOsMTG3-R：5’-AAGCTTACGCTATGGAGAGCTTG-3’(SEQIDNO.4)。

所述表达盒包含上述启动子，以及目的基因，所述目的基因与所述启动子连接。所述目的基因位于所述启动子的3’侧。

所述表达载体含有权利要求1所述的启动子。

所述表达载体还含有目的基因，所述目的基因与所述启动子连接。

所述目的基因位于所述启动子的3’侧。所述目的基因为GUS基因。

所述表达载体序列如SEQIDNO.2所示，命名为表达载体PC31P1p3。

下面对本发明作进一步说明：

本发明公开了一个来自于水稻的特异pOsMTG3启动子，通过对含有重组基因pOsMTG3-GUS的转基因植株的不同部位进行GUS染色分析表明，该启动子在茎、穗、根和芽中表达，而在叶片中不表达。王利军等发现ats1A基因启动子可启动外源基因在转基因烟草的叶片中特异性高效表达，Marraccini等发现RBCS1基因启动子可驱使报告基因在叶中特异性高效表达，而pOsMTG3是1个在叶片中特异性不表达的启动子，此类型启动子在国内外鲜有报道，具有一定的应用价值。

通过基因芯片筛选特异性表达的基因，克隆其启动子并进行功能试验，是获得特异性启动子的一大途径。本发明通过水稻基因组芯片分析筛选得到的OsMTG3基因在水稻根、茎、穗中优势表达，而在叶片中不表达，具有一定特异表达的特征。利用生物数据库PLACE对该基因pOsMTG3启动子序列分析表明，pOsMTG3具有启动子发挥功能至关重要的顺式作用元件，其中TATA盒保证转录的正确定位，而CAAT盒则控制转录起始的频率。除此之外，该启动子还含有一些可能与耐逆境相关的保守元件，其中，ABRELATERD1、MYCATERD1和MYB2CONSENSUSAT可能参与OsMTG3基因对干旱胁迫的响应，而LTRECOREATCOR15能够调节低温、干旱和ABA等逆境响应基因的表达，GATA盒在植物光诱导和硝酸盐诱导基因的转录过程中起作用。

叶片作为水稻主要的营养器官，通过光合作用提供植株生长的能量，在水稻的生长发育过程中起着至关重要的作用。而外源基因在受体植株的表达往往会引发一系列不可预测的负面影响，极大地影响转基因植物的正常生长和发育。本发明表明，pOsMTG3启动子能够启动外源基因在水稻根、茎、穗中优势表达，而在叶片中不表达，可以确保外源基因在根、茎或果实中正常表达的同时，对叶片功能的影响相对较低，为水稻生长发育提供充足的物质和能量来源。这在国内外尚没有相关的报道，为转基因水稻的研究提供了一种全新的启动子。

本发明以GUS基因作为目的基因为例，表达盒就是pOsMTG3启动子和该目的基因(GUS)相连接，不再在两者之间要插入其他基因。启动子的意义就在于，像一个开关一样，控制与其相连的基因的表达与否，GUS基因只是起到一个指示作用，把启动子是否工作以一个比较直观的方式显现出来(GUS染色结果，有蓝色表示开关工作，没有蓝色表示开关不工作)。该启动子在除叶子以外的部位都是工作的，该启动子之后可以连接任何其他外源的目的基因。

总之，本发明利用水稻基因芯片筛选得到1个在水稻多组织表达的基因OsMTG3，且该基因在孕穗期受干旱处理时表达量上调，而在抽穗期受低温处理时表达量下调。把该基因ATG密码子上游1.8kb左右的DNA片段预测为启动子区，并将其命名为pOsMTG3。用PCR技术克隆该启动子，并以GUS基因作为报告基因，在水稻中分析了该启动子在不同组织中的表达特性。GUS组织化学染色分析表明：pOsMTG3启动子主要在水稻根、茎、穗中优势表达，而在叶片中不表达。由于pOsMTG3启动子未检测到在水稻叶片中的表达，可用于特殊水稻品种的研发，而不影响光合作用等叶片的重要功能。

附图说明

图1为表达载体PC31P1p3T-DNA的结构图；图中T_NOS为终止子；

图2为不同逆境下水稻OsMTG3基因在叶片和穗中的相对表达水平图；图中1、2和3分别代表苗期、孕穗期、抽穗期；L代表叶片，P代表穗；K代表无处理对照，C代表低温，D代表干旱；

图3为pOsMTG3启动子PCR产物(a)及PC31P1p3载体(b)酶切鉴定图；图中M代表DNAMarker；1代表PCR或酶切产物；PC31P1代表空表达载体；

图4为pOsMTG3启动子的序列和结构图；图中方框内序列代表引物序列；下划线代表保守元件；ATG代表基因翻译起始位点；

图5为转基因水稻植株的PCR鉴定图；图中M代表DNAmarker；N代表无模板阴性对照；W代表野生型9311阴性对照；P代表阳性植株对照；1～14代表被检测植株；

图6为pOsMTG3-GUS转基因水稻植株不同组织器官GUS活性的组织化学染色分析

图；图中A、C、E、G为转基因植株，B、D、F、H为野生型9311对照植株。

具体实施方式

1材料和方法

1.1水稻材料

供试水稻为籼稻品种9311以及培矮64S(OryzasativaL.)。以培矮64S为基因芯片分析的材料，培矮64S基因组DNA作为克隆启动子的模板，9311作为转化受体品种。

1.2菌株、质粒、酶与试剂

大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌EHA105和转化载体pCAMBIA1300为本实验室保存。植物表达载体PC31P1质粒由本实验室外籍专家PedroS.C.F.Rocha教授提供。实验中所用的DNA聚合酶(LATaq酶、rTaq酶)、限制性内切酶、连接酶、克隆载体pMD18-T试剂盒等购自Takara公司，生化试剂购自Sigma公司。

1.3基因芯片分析

水稻表达芯片(AffymetrixGeneChipRiceGenomeArray)和相关试剂盒均购自美国Affymetrix公司。试验处理、取材制样及提取RNA等均采用徐孟亮等^[12]的方法。主要操作步骤如下：①总RNA的提取与纯化；②cDNA的合成与纯化；③体外转录合成cRNA与cRNA的纯化；④cRNA片段化、制备杂交液；⑤芯片杂交；⑥洗脱芯片；⑦扫描芯片；⑧数据分析。

1.4pOsMTG3启动子的克隆及表达载体的构建

以CTAB法提取水稻培矮64S的基因组DNA作为克隆的模板。PCR反应体系按LATaq酶的标准体系进行。引物由Invitrogen公司合成，序列为：pOsMTG3-F：5’-TCTAGACTCTACGTGTTCGAGCAATGCC-3’(SEQIDNO.3)；pOsMTG3-R：5’-AAGCTTACGCTATGGAGAGCTTG-3’(SEQIDNO.4)。上、下游引物分别引入酶切位点XbaI和HindIII,以下划线表示。反应条件如下：95℃预变性3min；94℃变性35s，60℃退火60s，72℃延伸2min，循环36次；72℃延伸4min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离、回收，连入pMD18-T载体进行测序确认。用XbaI和HindIII酶切，插入同样酶切的质粒PC31P1，得到含有pOsMTG3-GUS重组基因的表达载体PC31P1p3(图1)，并进行酶切鉴定。

1.5农杆菌介导的水稻转化

取水稻品种9311成熟胚诱导的愈伤组织，采用农杆菌介导的双菌株双载体法共转化^[13]的方法进行水稻遗传转化。水稻组织培养、抗性愈伤组织的筛选以及植株再生等参照肖媛等^[14]的方法进行。

1.6转基因水稻的PCR检测

水稻基因组DNA的提取方法与之前相同。鉴定引物由Invitrogen公司合成，上下游序列分别为：GUS-F：5’-CTCGAAGTCACAGCCAAAAGCC-3’(SEQIDNO.5)；GUS-R：5’-CCACGATGCCATGTTCATCTGC-3’(SEQIDNO.6)。反应体系参照rTaq酶说明书的标准体系进行，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸30s，循环40次；72℃延伸2min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离。

1.7阳性转基因植株的GUS组织化学分析

阳性转基因植株的GUS组织化学分析按Jefferson^[15]的方法改良后进行。将待测水稻样品与含有底物X-Gluc的染色反应液(0.25％TritonX-100；50mmol/LNaH₂PO₄；50mmol/LNa₂HPO₄；2.5mmol/LK₄[Fe(CN)₆]；2.5mmol/LK₃[Fe(CN)₆]；2.5mmol/LX-Gluc)于37℃保温48h后进行组织化学染色分析，叶片等含有叶绿素的绿色组织用75％的乙醇脱色后观察。

2结果和分析

2.1基因芯片表达分析

为发掘新的水稻耐逆基因，研究植物应答逆境胁迫的分子机制，本课题组采用包含51279个水稻转录本的Affymetrix基因芯片在全基因组水平上分析了培矮64S在苗期、孕穗期、抽穗期的叶片、穗在无处理对照以及低温、干旱等逆境处理下的表达模式，筛选到1个在水稻多组织表达的基因OsMTG3。基因芯片分析结果显示，低温、干旱逆境处理后，OsMTG3基因在孕穗期的表达量比无处理对照分别上调88.2(4.98倍)和2500.7(141.28倍)，而在抽穗期的表达量比无处理对照分别下调2626.4(0.45倍)和上调290.6(0.05倍)(图2)。2.2启动子的克隆及表达载体的构建

以pOsMTG3-F和pOsMTG3-R为引物、培矮64S基因组DNA为模板进行PCR扩增。扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，得到约1.8kb的条带，大小与预期一致(图3a)。片段回收连接pMD18-T载体后测序分析，该序列位于水稻第3号染色体，全长1937bp。目的片段经HindIII酶切后连接到表达载体PC31P1质粒，经酶切鉴定，确认pOsMTG3启动子序列已经正确连接到表达载体中(图3b)。并另作酶切鉴定连接方向正确(图略)，构建成以GUS为报告基因的启动子分析载体。将构建好的表达载体PC31P1p3以及含有潮霉素(hygromycinB)筛选标记的载体pCAMBIA1300，以冻融法分别转入根癌农杆菌菌株EHA105中，-80℃保存备用。

2.3启动子的结构分析

经PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)软件分析表明，OsMTG3基因翻译起始位点上游-75～-81位点之间有1个TATA盒，能够保证转录的正确定位；而-159～-163之间有1个CAAT盒，控制着转录起始的频率(图4)。进一步分析显示，该段序列中存在多个保守元件，其中，ABRELATERD1、MYCATERD1和MYB2CONSENSUSAT可能参与OsMTG3基因对干旱胁迫的响应，而LTRECOREATCOR15则可能与OsMTG3基因对低温胁迫的反应有关，GATA盒则可能使OsMTG3基因能够在特异的器官或组织中表达。

2.4转基因水稻植株的获得与PCR检测

将以pOsMTG3启动子启动GUS报告基因的表达载体PC31P1p3，用根癌农杆菌介导的双菌株双载体法共转化水稻品种9311，经过潮霉素筛选培养30d获得抗性愈伤；经分化与再生培养，得到89棵再生植株。分别取再生植株叶片，提取基因组DNA，用引物GUS-F和GUS-R进行PCR鉴定。其中有29个单株检测为转基因阳性，部分PCR检测结果如图5所示，在250～500bp之间出现1条明亮的带，大小与GUS基因的扩增区域一致(289bp)，表明T-DNA片段已经整合到水稻基因组中。

2.5GUS融合基因在阳性转基因植株中的表达

从每个阳性转基因植株上分别取苗期的叶片、茎，抽穗期的穗、成熟种子的根芽等不同组织进行GUS组织器官化学染色，并分别选取野生型9311植株的相应组织作为阴性对照。结果如图6所示，pOsMTG3启动子的表达具有一定的特异性，与芯片数据大致吻合。pOsMTG3在叶片中几乎不能启动下游GUS基因的表达(图6G，H)，在茎和根及芽中则能启动下游GUS基因较高水平的表达(图6C,D,E,F)，而在穗子(颖壳)中表达量相对较低(图6A,B)。